一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，该方法包括取鱼体组织的重量百分比为腹脂0.2-0.5、肝脏0.8-1.0、肌肉1-2和鳃1.5-1.8，然后加入氯仿甲醇混合液研磨；然后通过回流过滤提取脂肪溶液；然后利用氮气吹干溶液，提取到结晶脂肪；然后将结晶脂肪溶解于氢氧化钾甲醇溶液中，并充氮气防氧化和冷却容器壁减少挥发；然后将脂肪酯化为脂肪酸，再用正庚烷溶解脂肪酸；然后取上清液离心处理后再取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图，即可通过色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。从而可以实现对鱼类的脂肪结构的认识，进一步对鱼类的保护和饲养。
【专利说明】一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类组织脂肪酸的领域，具体涉及一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法。
【背景技术】
[0002]目前野生鱼类面临越来越多的威胁，很多面临着灭绝，或者其他常见鱼类的养殖遇到饲养营养搭配的困难。虽然鱼体中含有丰富的脂肪酸，有的脂肪酸鱼体本身可以生物合成，但是有的则不能或合成量很少，远不能满足鱼类生长发育各阶段的需要，必须由外源供给补充。因此，研究、测定鱼类脂肪酸组成、生理功能、需要量，对于提高养殖鱼类的产量及品质，具有十分重要的意义。
[0003]为了很好地保护野生鱼类的种族和长存及及鱼类的养殖，不但需要不断地关注鱼类的生存环境，还应该不断地研究鱼类的结构及其相对应的生活需求，所以需要对其组织脂肪酸的组成成分进行准确提取测定，从而可以进一步保护野生鱼类和人工养殖，以免野生鱼类的种族遭受灭绝，及解决人工养殖的困难。但是目前提取鱼类组织脂肪的方法采用氮吹的方法吹干氯仿甲醇混合液，未对氯仿甲醇混合液做其他处理，导致氮吹用时过长，且由于氮气的制冷作用导致氯仿甲醇混合液难于挥发，影响脂肪酸测定结果，并且提取鱼体组织脂肪酸时，组织取样量无统一的标准，影响对鱼类的组织脂肪酸的成分测定，浪费资源，准确度不高。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是通过合理地提取鱼体各组织的比例成分，快速全面地研磨提取脂肪酸，再利用气相色谱仪获得色谱图和面积归一化法计算出脂肪酸组分的相对含量，最终实现对鱼类的脂肪结构的认识，从而可以进一步对鱼类的保护和饲养。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0006](I)取一类鱼中的一条成熟鱼剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.2-0.5、肝脏0.8-1.0、肌肉1-2和觸1.5-1.8,然后加入4_6ml氯仿甲醇混合液,混合研磨5_10分钟；
[0007](2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2-2.5h，保持水浴锅温度为50°C?55°C ；
[0008](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0009](4)取出1ml滤液于b容器中，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪；
[0010](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器2_4分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0011](6)加入2ml 10%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0012](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用15ml_20ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0013](8)取上清液置于离心管中,加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.2-0.5% ；
[0014](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0015](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
[0016]本方法经过对鱼体各组织按一定比例进行提取，并加入适量的氯仿甲醇混合液来研磨鱼体各组织，使研磨得更加充分，各组织脂肪渗出得更加充分；然后再次添加氯仿甲醇混合液进行回流加热处理使脂肪充分溶于氯仿甲醇混合液中进一步提取比较纯的脂肪溶液；然后为了防止脂肪被氧化，使用氮气吹干脂肪溶液获得结晶脂肪，然后经过步骤(5)既能实现预防脂肪被氧化，又能快速将结晶脂肪溶解于氢氧化钾甲醇溶液中，减少脂肪的破坏，促使接下来测定脂肪酸组分更加准确；再经过步骤(6)可以快速将脂肪酯化成脂肪酸，而且可以大大减少脂肪和脂肪酸被氧化和损坏，提高纯度，确保测定脂肪酸组分的准确性；然后经过步骤(7)将脂肪酸溶于正庚烷中并用食盐水去除气泡提纯；然后经过步骤(8)可以防止外界水分进入上清液，再进入步骤(9)和(10)将提纯的脂肪酸溶液送入气相色谱仪获得色谱图，然后用面积归一化法将色谱图计算出脂肪酸组分。其中能测定出的脂肪酸包括有肉豆蘧酸、肉豆蘧烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酯酸、油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、芥酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，经过本测定的方法，可以确定出每一类鱼不同的脂肪酸组分占总脂肪酸的比值，也可以对应计算出每一类鱼不同的脂肪酸组分的具体含量值，实现对鱼类的脂肪结构的认识，从而可以进一步研究鱼类的保护和饲养，配制适合各个鱼类所需的饲料。
[0017]优选的是，所述氯仿甲醇混合液为氯仿和甲醇的比例是2: I。
[0018]优选的是,所述的鱼为红罗非鱼、黄颡鱼、淡水鲨鱼、大刺鳅。
[0019]优选的是，所述步骤(I)取每条成熟鱼体各组织的重量百分比为腹脂0.5、肝脏
1.0、肌肉1.5和觸1.8,加入的氯仿甲醇混合液为5ml。
[0020]优选的是，所述步骤(2)的可加热容器为圆底烧瓶。
[0021]优选的是，所述步骤(2)的回流为用氯仿甲醇混合液类的易挥发有机溶剂提取脂肪成分的过程，其为将研磨液与有机溶剂混合，并加热混合液，同时冷却挥发的有机溶剂使其恢复液态混入研磨液中继续溶解脂肪，反复进行加热液态的有机溶剂和冷却气态的有机溶剂直至脂肪成分溶于有机溶剂中。
[0022]优选的是，所述步骤(4)氮吹过程中还包括有将b容器放至30°C水浴锅中，且放置水深为5cm，可加快氯仿甲醇混合液挥发速度且不会导致样品中的脂肪随提取液而挥发，确保脂肪的活性和纯度。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0024]实施例1
[0025]本技术方案提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0026](I)取一条成熟的红罗非鱼剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.5、肝脏1.0、肌肉1.5和鳃1.8，然后加入5ml氯仿甲醇混合液，混合研磨7分钟；
[0027](2)将研磨液转至圆底烧瓶中，向该圆底烧瓶中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖圆底烧瓶底部，将圆底烧瓶与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2h，保持水浴锅温度为55°C，其中该回流为用氯仿甲醇混合液类的易挥发有机溶剂提取脂肪成分的过程，其为将研磨液与有机溶剂混合，并加热混合液，同时冷却挥发的有机溶剂使其恢复液态混入研磨液中继续溶解脂肪，反复进行加热液态的有机溶剂和冷却气态的有机溶剂直至脂肪成分溶于有机溶剂中，其中所用的有机溶剂可以选氯仿甲醇混合液。
[0028](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0029](4)取出1ml滤液于b容器中，并将b容器放至30°C水浴锅中，且放置水深为5cm，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪，可加快氯仿甲醇混合液挥发速度且不会导致样品中的脂肪随提取液而挥发，确保脂肪的活性和纯度；
[0030](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，上下左右振摇b容器2分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0031](6)加入2ml 10%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0032](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用15ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0033](8)取上清液置于离心管中，加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.3% ;
[0034](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0035](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
[0036]其中所用的氯仿甲醇混合液为氯仿和甲醇比例为2: I。
[0037]实施例2
[0038]本技术方案提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0039](I)取一条成熟的黄颡鱼剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.3、肝脏0.9、肌肉1.5和鳃1.5，然后加入4ml氯仿甲醇混合液，混合研磨6分钟；
[0040](2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2.5h，保持水浴锅温度为 53。。；
[0041](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0042](4)取出1ml滤液于b容器中，并将b容器放至30°C水浴锅中，且放置水深为5cm，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪，可加快氯仿甲醇混合液挥发速度且不会导致样品中的脂肪随提取液而挥发，确保脂肪的活性和纯度；
[0043](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器3分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0044](6)加入2mll0%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0045](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用17ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0046](8)取上清液置于离心管中，加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.2% ;
[0047](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0048](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。[0049]其中所用的氯仿甲醇混合液为氯仿和甲醇比例为2: I。
[0050]实施例3
[0051]本技术方案提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0052](I)取一条成熟的淡水鲨鱼剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.5、肝脏
1.0、肌肉2和鳃1.8，然后加入6ml氯仿甲醇混合液，混合研磨10分钟；
[0053](2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2.5h，保持水浴锅温度为 55 0C ；
[0054](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0055](4)取出1ml滤液于b容器中，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪；
[0056](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器4分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0057](6)加入2ml 10%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0058](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用20ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0059](8)取上清液置于离心管中,加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.5% ；
[0060](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0061](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
[0062]实施例4
[0063]本技术方案提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0064](I)取一条成熟的大刺鳅剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.2、肝脏0.8、肌肉I和鳃1.5，然后加入4ml氯仿甲醇混合液，混合研磨5分钟；
[0065](2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2h，保持水浴锅温度为50 0C ；
[0066](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0067](4)取出1ml滤液于b容器中，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪；
[0068](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器2_4分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0069](6)加入2mll0%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0070](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用15ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0071](8)取上清液置于离心管中，加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.2% ；
[0072](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0073](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
[0074]实施例5
[0075]本技术方案提供了一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其包括如下步骤:
[0076](I)取一条成熟的大刺鳅剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.5、肝脏1.0、肌肉1.5和觸1.8,然后加入6ml氯仿甲醇混合液,混合研磨5_10分钟；[0077](2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2.3h，保持水浴锅温度为 55 0C ；
[0078](3)将液体过滤到a容器中，去除残渣；
[0079](4)取出1ml滤液于b容器中，并将b容器放至30°C水浴锅中，且放置水深为5cm，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪，可加快氯仿甲醇混合液挥发速度且不会导致样品中的脂肪随提取液而挥发，确保脂肪的活性和纯度；
[0080](5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器2_4分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁；
[0081](6)加入2mll0%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温；
[0082](7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用15ml饱和食盐水淋洗上层清液；
[0083](8)取上清液置于离心管中，加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.4% ；
[0084](9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图；
[0085](10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
[0086]本方法经过对鱼体各组织按一定比例进行提取，并加入适量的氯仿甲醇混合液来研磨鱼体各组织，使研磨得更加充分，各组织脂肪渗出得更加充分；然后再次添加氯仿甲醇混合液进行回流加热处理使脂肪充分溶于氯仿甲醇混合液中进一步提取比较纯的脂肪溶液；然后为了防止脂肪被氧化，使用氮气吹干脂肪溶液获得结晶脂肪，然后经过步骤(5)既能实现预防脂肪被氧化，又能快速将结晶脂肪溶解于氢氧化钾甲醇溶液中，减少脂肪的破坏，促使接下来测定脂肪酸组分更加准确；再经过步骤(6)可以快速将脂肪酯化成脂肪酸，而且可以大大减少脂肪和脂肪酸被氧化和损坏，提高纯度，确保测定脂肪酸组分的准确性；然后经过步骤(7)将脂肪酸溶于正庚烷中并用食盐水去除气泡提纯；然后经过步骤(8)可以防止外界水分进入上清液，，再进入步骤(9)和(10)将提纯的脂肪酸溶液送入气相色谱仪获得色谱图，然后用面积归一化法将色谱图计算出脂肪酸组分。其中能测定出鱼类的脂肪酸包括有肉豆蘧酸、肉豆蘧烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酯酸、油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、芥酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，经过本测定的方法，可以确定出每一类鱼不同的脂肪酸组分占总脂肪酸的比值，也可以对应计算出每一类鱼不同的脂肪酸组分的具体含量值，实现对鱼类的脂肪结构的认识，从而可以进一步研究鱼类的保护和饲养，配制适合各个鱼类所需的饲料。
[0087]本发明用的气相色谱仪的原理是利用样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，导致各组分在色谱柱中的气相和固定液相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两项间反复多次的分配，由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不相同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺利离开色谱柱进入检测器产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱图。面积归一化法是根据样品中各脂肪酸组分分别出峰在色谱图上，而鱼体内可检测出的大约有12-17种脂肪酸，这些脂肪酸中的每一种都会在色谱图上形成一个峰，每个峰的面积加起来设为100，每个脂肪酸形成的峰在100中占多少就是这种脂肪酸在所有脂肪酸中所占的比例，既为本发明要测定的鱼体脂肪酸组分的相对含量。[0088]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
【权利要求】
1.一种测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取一类鱼中的一条成熟鱼剖腹，取出鱼体组织的重量百分比为腹脂0.2-0.5、肝脏0.8-1.0、肌肉1-2和觸1.5-1.8,然后加入4_6ml氯仿甲醇混合液,混合研磨5_10分钟； (2)将研磨液转至可加热容器中，向该可加热容器中再加入15ml氯仿甲醇混合液以覆盖容器底部，将容器与冷凝管连接好并置于恒温水浴锅中，回流2-2.5h，保持水浴锅温度为50°C~55? ； (3)将液体过滤到a容器中，去除残渣； (4)取出1ml滤液于b容器中，用氮气吹干滤液，提取到结晶脂肪； (5)加2ml0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液到结晶脂肪中，充入氮气，振摇b容器2_4分钟至结晶脂肪完全溶解，同时用自来水冷却容器外壁； (6)加入2mll0%三氟化硼乙醚或三氟化硼甲醇溶液到b容器中，混合均匀，充入氮气后将b容器置于50°C水浴中并静置3分钟后冷却至常温； (7)加2ml的正庚烷并振荡均匀后静置，用15ml-20ml饱和食盐水淋洗上层清液； (8)取上清液置于离心管中,加入无水硫酸钠占所述上清液质量的0.2-0.5% ； (9)取上层清液送入气相色谱仪获得色谱图； (10)将色谱图用面积归一化法计算脂肪酸组分的相对含量。
2.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述氯仿甲醇混合液为氯仿和甲醇的比例是2: I。
3.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述的鱼为红罗非鱼、黄颡鱼、淡水鲨鱼、大刺鳅。
4.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述步骤(1)取每条成熟鱼体各组织的重量百分比为腹脂0.5、肝脏1.0、肌肉1.5和鳃1.8，加入的氯仿甲醇混合液为15ml。
5.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述步骤(2)的可加热容器为圆底烧瓶。
6.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述步骤(2)的回流为用氯仿甲醇混合液类的易挥发有机溶剂提取脂肪成分的过程，其为将研磨液与有机溶剂混合，并加热混合液，同时冷却挥发的有机溶剂使其恢复液态混入研磨液中继续溶解脂肪，反复进行加热液态的有机溶剂和冷却气态的有机溶剂直至脂肪成分溶于有机溶剂中。
7.根据权利要求1所述测定鱼体组织脂肪酸组分的方法，其特征在于，所述步骤(4)氮吹过程中还包括将b容器放至30°C水浴锅中，且放置水深为5cm。
【文档编号】G01N30/88GK104034837SQ201410269446
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】陈涛 申请人:南宁学院