一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 游离脂肪酸，即非酯化脂肪酸（non-estesterfied fatty acid，NEFA)，是人体内 脂肪代谢的中间产物，也是细胞膜脂质结构的底物和前列腺素等细胞内信号分子的供体。 当肌肉活动所需能源一一肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能 源使用。虽然游离脂肪酸只占身体脂肪很少的一部分，但却满足了能量需求的很大部分，故 而是监控人体脂代谢、糖代谢的重要指标。游离脂肪酸不仅能够反映人体脂肪代谢情况及 血脂水平、评价血糖及辅助诊断糖尿病，还能反映人体内多种其他病理、生理情况，如胰岛 素抵抗、肥胖、恶性疾病、代谢综合征和心血管疾病等。
[0003] 血清中高游离脂肪酸浓度多见于肥胖、糖尿病、心肌梗塞、重症肝障碍、甲状腺功 能亢进、肢端肥大症和饥饿等；游离脂肪酸含量低见于甲状腺机能减退、脑垂体功能不全、 阿狄森氏病等，餐后亦可引起游离脂肪酸生理性降低。
[0004] 随着糖尿病、高血压、高血脂等现代病的日益多发，对糖类和脂类的异常代谢监 控，也成为临床上诊治和检测病情的重要事项。目前测定血清中游离脂肪酸的方法较多，如 酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法、气相色谱法等。由于传统方法操 作繁琐且精密度差，而酶法检测血清游离脂肪酸试剂盒具有特异性高、精密度好、操作简单 等优点，因此在临床大批量样本的自动快速检测中，酶法应用的最为广泛。
[0005] 市售酶法测定游离脂肪酸试剂盒的主要反应原理大都基于Trinder反应模式，具 体反应过程如下：
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[0009]即游离脂肪酸在ATP、辅酶A的存在下，经脂酰辅酶A合成酶（Acyl CoA Synthetase，ACS)作用，生成脂酰辅酶A ;脂酰辅酶A被脂酰辅酶A氧化酶（Acyl CoA Oxidase，AC0D)氧化，生成反式-稀酰辅酶A(2,3-trans-Enoyl-CoA)和过氧化氢；而生成 的过氧化氢在过氧化物酶（peroxidase，P0D)存在下，与Trinder色原及4-氨基安替比林 (4-aminoantipyrine，4_APP)生成红色醌亚胺物（purple dye)，该物质的生成量与样本中 的游离脂肪酸含量呈正比，通过测定其吸光度即可得到样品中游离脂肪酸的浓度。
[0010] 目前市售酶法测定游离脂肪酸的试剂盒主要存在下述问题：
[0011] 1.酶法测定游离脂肪酸试剂盒最初从国外进口，进口试剂具有良好的稳定性和优 秀的分析性能，但价格昂贵，检测成本较高，不适合大规模应用。现今，游离脂肪酸的生化 检测在国内市场上方兴未艾，仅有少数的一些厂家能够实现游离脂肪酸试剂盒的自产，但 其所采用的色原反应物质活性低，显色稳定性差、抗干扰性弱，从而导致整个试剂盒稳定性 差，检测结果不准确，灵敏度低。
[0012] 2.由于催化Trinder反应的过氧化物酶对底物专一性较差，反应易受到内源性物 质的干扰，如抗坏血酸、胆红素、溶血等。抗坏血酸等还原性物质还会与H 202竞争过氧化物 酶（P0D)或与色原性物质竞争H202，从而使氧化过程中产生的H 202被消耗，生成的红色醌亚 胺化合物减少，导致测定结果不准确。
[0013] 3.目前市售酶法游离脂肪酸试剂盒均选用单一的稳定剂，由于游离脂肪酸试剂盒 成分比较复杂含有多种酶，其试剂盒稳定性直接与酶活性相关，而酶的活性易受各种因素 的干扰，比如PH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂等，导致试剂盒缺乏稳定性，保存 时间短，影响临床使用。单一的稳定剂已越来越不能满足对试剂盒稳定性的要求，因此，组 合选用两种或多种配制简单、成本低廉、对酶种类较多的游离脂肪酸测定试剂盒有良好稳 定效果的稳定剂，是非常必要的。
【发明内容】
[0014] 本发明为克服上述现有技术缺陷，提供了一种高稳定性的酶法游离脂肪酸测定试 剂盒，能够消除人血清中抗坏血酸、胆红素等多种物质的干扰、灵敏度高、成本低，不仅能够 适应大规模人群普查的需求，也能满足日常临床快速、大量检查的要求，适合产业化，便于 临床推广。
[0015] 为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：一种基于Trinder反应原 理的酶法测定血清中游离脂肪酸的试剂盒，其组成包括试剂1和试剂2两种独立液态试剂， 其中试剂1、试剂2中的各组分及浓度范围为：
[0016] 试剂 1 :
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[0018] 试剂 2 :
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[0020] 所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。
[0021] 由于酶法反应需要合适的pH范围和适宜离子强度的缓冲环境，离子强度过高，电 解质干扰酶与底物结合，酶活性将逐渐下降，但离子强度过低也可能无法激活酶的活性，因 此，一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。作为优选，本发明所述试剂缓冲液 选自对酶化学反应等无抑制作用，不干扰生物化学反应过程的GOOD' S缓冲液，如2-吗啉 代乙磺酸（MES)、3-吗啉代丙磺酸（M0PS)、N-[三（羟甲基）甲基]-2-氨基甲磺酸（TES)、 3-[4-(2_羟甲基）-1_哌嗪]丙磺酸（(H)EPPS)中的一种，优选MOPS缓冲液，pH优选范围 为6. 0~8. 5。根据酶催化反应最适条件的要求，在酶测定体系中还需要加入一定量的离子 激活剂，激活剂可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。优选的，本发明 所述试剂盒中所述离子激活剂为MgCl2 ? 6H20,同时加入一定浓度的KCL调节离子强度。
[0022] 本发明所述防腐剂为咪唑烷基脲，较市售常用的proclin系列防腐剂不仅具有良 好的防腐作用，且无还原性，对酶活性无抑制，不影响反应。
[0023] 本发明所述稳定剂并不特指某一个，而是由两种或两种以上试剂共同发挥了稳定 剂的作用，对保持酶活性、维持试剂的长期稳定发挥重要作用，是本发明的一个关键所在。 所述稳定剂选自海藻糖、鹿糖、0 -环糊精、甘露醇中的一种或多种，不仅能够发挥稳定试剂 的作用，还可以用于维持试剂中多种酶的活性。为了减少各试剂之间的交叉影响，更好提高 试剂的稳定性，所述稳定剂同时添加白蛋白，特别选用利用基因工程学上的方法制造的无 脂肪酸白蛋白，经专门的去脂纯化处理，脂肪酸含量低于〇. 002 % (w/w)，较市售产品选用 来自牛、马、羊、人的白蛋白，消除了其所含高浓度脂肪酸对检测结果的影响，减少了检测背 景干扰。
[0024] 本发明所述试剂2中酶保护剂为脂酰辅酶A氧化酶稳定剂，用于维持试剂2中的 脂酰辅酶A氧化酶的高活性，有助于提高试剂的稳定性。
[0025] 本发明所述色原物质的选择对试剂的稳定性、灵敏度以及准确性十分重要，为本 发明的另一个关键因素。本发明通过综合比较国内外常用色原，最终选用了一种胺类新 色原3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺（T0DP)，作为酶法测定游离脂肪酸显色剂，其优点在 于色原合成容易，性能稳定，分子共辄结构特性使得灵敏度大大提高（反应灵敏度可达到 0.0 lmmol/L)，相应可减少样本使用量，最终有效地降低干扰物的量；所述色原的灵敏度、稳 定性优于T0PS、T00S、ADPS等显色剂，与4-AAP氧化缩合显色迅速，呈色稳定，可有效改善对 反应体系中酶类稳定性的影响；其显色反应生成的胺类色原素最大吸收峰在540nm以上， 可有效避开黄疸、溶血干扰。
[0026] 本发明所述各组分组合所发挥的去干扰作用，是本发明酶法准确测定血清NEFA 浓度再一个关键因素。
[0027] 本发明所述表面活性剂选自Brij35、Brij98、Tween20。表面活性剂是反应的促进 剂，可去除其他脂类杂质的影响，提高检测的灵敏度。为了提高试剂的抗干扰的能力，所述 试剂1中加入了亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶，亚铁氰化钾与表面活性剂的组合可有效消 除样本中高胆红素对测值的影响，抗坏血酸氧化酶可有效消除样本中高抗坏血酸对测定样 本的干扰，从而保证了临床检测结果的准确性。
[0028]本发明所述试剂1选用EGTA螯合剂（乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸），可有 效防止除Mg2+外的其他二价金属离子干扰第一步反应。所述试剂2特别选用了氨羧螯合剂 DTPA螯合剂（二乙烯三胺五乙酸），较常用的乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA)、二羟乙基甘氨 酸（DHG)等螯合剂性能更优，可迅速与钙、镁、铁、铅、铜等离子生成水溶性螯合物，有效络 合后续反应中过多的镁离子及抑制乙酰辅酶A氧化酶活性的金属离子，提高测定结果的准 确性；同时还可以防止反应中各种金属阳离子对H 202的分解作用，作为H 202稳定剂，具有明 显的增效和稳定作用。
[0029] 本发明所述4-氨基安替比林（4-AAP)选自高纯度制品，其作用并不在第一次酶反 应中发挥，而是留待在过氧化物酶催化的酶反应中参与呈色反应。
[0030] 本发明所述试剂2中添加黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐（FAD)为脂酰辅酶A氧化酶的 辅酶，在反应中起到递氢体的作用，有助于提高反应的灵活性，使氧化反应更完全，保证了 反应高效、稳定的进行。
[0031] 本发明所述脂酰辅酶A合成酶和脂酰辅酶A氧化酶均选自由基因工程重组产品提 取的尚纯度制品；所述过氧化物酶（P0D)选自由辣根提取的尚稳定性制品。
[0032] 本发明中所述的百分比浓度如未进行特别说明，均为质量体积百分比浓度，即 100ml溶液中所含溶质的克数。
[0033] 本文中使用的术语"高纯度"是指产品的纯度大于95%。
[0034] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益结果：
[0035] 本发明试剂盒与进口试剂盒相关性好，检测结果具有高度的一致性（相关系数 r多0. 990)，线性拟合相关系数优于进口试剂，检测数据准确可靠，在临床可以替代进口试 剂盒使用，大