7本发明试剂盒与进口试剂盒线性对比
[0113]
[0114] 结果表明本发明试剂盒线性良好，拟合相关系数优于进口试剂盒。
[0115] 四、稳定性研究
[0116] 使用本实施例所述试剂盒，测定高、低两个水平的游离脂肪酸样品，每个水平样本 重复测定10次，对2-8°C放置20个月的试剂测定结果进行对比，验证测定结果的准确性，按 正规统计学要求，计算每个水平样品测定结果的平均值和标准差，然后按公式：
[0117]
[0118] 变异系数（CV)=标准差/平均值X 100%
[0119] 其中，X为测得的NEFA含量浓度值，f为测得的X值的平均数，n为重复测定次数；
[0120] 计算变异系数CV，结果列于下表8中；
[0121]按公式B%= (x-TK「X丨〇〇%
[0122] 其中T为初始测定值均值，I为2-8°C放置20个月的测定值均值。
[0123] 计算2_8°C放置20个月测定值与初始测定值均值的相对偏差（B% )，结果列于表 8中。
[0124] 表8本发明试剂盒2_8°C长期放置20月检测结果
[0125]
[0126] 由表8可以看出本实施例所述试剂盒在2_8°C放置20个月，测定结果重复性CV均 小于10%，且与初始测定值的偏差均小于10%，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发 明试剂盒重复性良好，具有较好的准确性和良好的稳定性。
[0127] 六、酶活性的影响
[0128] 加入2. 0 %脂酰辅酶A氧化酶稳定剂对脂酰辅酶A氧化酶的保护作用。
[0129] 表9酶保护剂对试剂中酶活性的影响
[0130]
[0131] 本发明试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作 用会更明显，20个月后加酶稳定剂的试剂与未加酶稳定剂的试剂相比，残存酶活率升高 49%〇
[0132] 实施例3
[0133] -、一种稳定的酶法游离脂肪酸测定试剂盒，该试剂盒由按照下述成分和比例配 制的液体双试剂组成，其中：
[0134]试剂1:
[0135] 滅0搏.缓沖液 100 minol/L. MgCh ? 6H20 20 mmoI/L KCL 10 mmol,,L ATP' 4.0 mmol/L 辅酶 A. 0.4 mmol/L 脂酰辅酶A合成酶 2.0 KU/L 4-氨基安替比林 0,8 g/L 稳定剂海藻糖 3.0 g/L 无脂肪酸白蛋白 2.0 g/L 咪唑烷基脲 0.1 % 表面活性剂 2.0 g/.L BOTA 1,0 mmol/L 抗坏血酸氧化酶 2.0KU/L 亚铁氰化钾 0.05 mmol/L
[0136]试剂 2:
[0137] MOPS 缓冲液 100 mrnol/L
[0138] 脂酰辅酶A氧化酶 30 KU/L 黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐 0.02 g/L 3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺 3.0 mmol/L DTPA 螌介剂 1,5 mmol/L 表面活性剂 2.0 g/L 咪唑烷基脲 0.1 % 脂酰辅酶A氧化酶稳定剂 1.0% 过氧化物酶（POD) 90Kl'/L
[0139] 所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。
[0140] 二、本发明试剂盒与进口试剂盒的相关性
[0141] 使用本实施例所述试剂盒，按实施例1所述方法，同时使用市售进口试剂盒（德 赛）对40例人血清样本中的游离脂肪酸含量进行测定，进口试剂盒按照其说明书进行操 作，测定结果如下表10所示。下表中进口试剂盒参考范围是〇. 10-0. 60mmol/L，本发明试剂 盒的参考范围是0. 13-0. 77mmol/L。
[0142] 表10本发明试剂盒与进口试剂盒对NEFA的测定结果
[0143]
[0144]
[0145] 由上表统计结果可以看出，在这40例新鲜人血清样本中，共出现28例阴性结果 和12例阳性结果，本发明试剂盒和进口酶法试剂盒在结果判断上是一一对应的，按实施例 1所述方法，计算本发明试剂盒与进口试剂盒测定结果的相关系数r = 0. 9992,二者相关性 良好，临床意义显著。
[0146] 以上的试验是采用日立公司制造的7080型号全自动生化分析仪进行的，但本发 明试剂盒的应用不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪，并且本领域 技术人员可以根据情况对测定参数做适当调整。
[0147] 三、线性评估
[0148] 取某一高值样本，分别用本发明试剂盒和进口试剂盒（德赛）测定高值样本的5 次倍比稀释后的线性，以此从实际样本中评估各试剂盒的线性，结果列于表11中。
[0149] 表11本发明试剂盒与进口试剂盒线性对比
[0150]
[0151]
[0152] 结果表明本发!明试剂盒线性良好，拟合相美系数优于进m式剂盒。
[0153] 四、稳定性研究
[0154] 使用本实施例所述试剂盒，测定高、低两个水平的游离脂肪酸样本，每个水平重复 测定10次，对2-8°C放置20个月的试剂测定结果进行对比，验证测定结果的准确性，按正规 统计学要求，计算每个水平样本测定结果的平均值和标准差，然后按公式：
[0155]
[0156] 变异系数（CV)=标准差/平均值X 100%
[0157] 其中，X为测得的NEFA含量浓度值，X为测得的X值的平均数，n为重复测定次数；
[0158] 计算变异系数CV，结果列于下表12中；
[0159]按公式B% = (x -T)/T X 1娜％
[0160] 其中T为初始测定值均值，I为2-8°C放置20个月的测定值均值。
[0161] 计算2_8°C放置20个月测定值与初始测定值均值的相对偏差（B% )，结果列于表 12中。
[0162] 表12本发明试剂盒2-8 °C长期放置20个月
[0163]
[0164] 由以上结果可以看出本实施例所述试剂盒在2_8°C放置20个月，测定结果重复性 CV均小于10%，且与初始测定值的偏差均小于10%，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明 本发明酶法游离脂肪酸检测试剂盒具有较高的准确性和良好的稳定性。
[0165] 五、酶活性的影响
[0166] 加入1 %脂酰辅酶A氧化酶稳定剂对脂酰辅酶A氧化酶的保护作用。
[0167] 表13酶保护剂对试剂中酶活性的影响 [01681
[0169]-本发明试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作 用会更明显，20个月后加酶稳定剂的试剂与未加酶稳定剂的试剂相比，残存酶活率升高 51%〇
【主权项】
1. 一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2两种分别放 置的液体试剂，其各组分及浓度范围为： 试剂1: 缓冲液 20~200mmol/L MgCl2?6H20 1-100mmol/L KCL 5~50mmol/L ATP 2~20mmol/L 辅酶A 0. 1~2. 0mmol/L 脂酰辅酶A合成酶 0. 4~5KU/L 4_氨基安替比林 0. 2~2g/L 稳定剂 1~10g/L 防腐剂 0? 05~0. 5 % 表面活性剂 0. 5~5g/L EGTA 0. 5~3 mmol/L 抗坏血酸氧化酶 0. 5~10KU/L 亚铁氰化钾 0. 01~0.1 mmol/L 试剂2: 缓冲液 20~200mmol/L 脂酰辅酶A氧化酶 10~100KU/L 黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐 0.01-0.05g/L 色原 1~10mmol/L DTPA螯合剂 0? 5~3mmol/L 表面活性剂 0. 5~5g/L 防腐剂 0? 05~0. 5 % 酶保护剂 0. 5~2 % 过氧化物酶（POD) 50-150KU/L 所述试剂1和试剂2的容积比为4:1 ; 所述缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸（MES)、3-吗啉代丙磺酸（M0PS)、N-[三（羟甲基）甲 基]-2-氨基甲磺酸（TES)、3-[4-(2-羟甲基）-1-哌嗪]丙磺酸（（H)EPPS)中的一种，优选 MOPS缓冲液，pH优选范围为6. 0~8. 5 ; 所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、P-环糊精、甘露醇中一种或多种的组合，同时添加无脂 肪酸白蛋白； 所述防腐剂为咪唑烷基脲； 所述表面活性剂选自Brij35、Brij98、Tween20 ; 所述酶保护剂为乙酰辅酶A氧化酶稳定剂； 所述色原为胺类新色原3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述白蛋白为利用基因工程学上方法 制造的无脂肪酸白蛋白，纯度大于98%，脂肪酸含量低于0. 002% (w/w)。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述脂酰辅酶A合成酶和脂酰辅
【专利摘要】本发明涉及一种稳定的酶法游离脂肪酸的试剂盒，该试剂盒由分别放置的试剂1和试剂2两种独立液体试剂组成，具有良好的稳定性和抗干扰性。酶法测定游离脂肪酸，方法简便、易于操作。本发明试剂中选用了新型色原，配方中同时加入了抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾等抗扰剂，使试剂具有灵敏度高、抗干扰性强的特点；同时采用液体稳定技术，加入了一系列特殊的稳定剂、螯合剂和酶保护剂，使试剂具有优良的稳定性，可广泛应用于绝大多数半/全自动生化分析仪，监测人体脂肪代谢情况和血脂水平等，便于临床推广。
【IPC分类】G01N21/31, G01N33/50
【公开号】CN105203472
【申请号】CN201510378206
【发明人】李雪, 袁恩武, 江崇才, 张成顺, 苏岩, 李江
【申请人】北京万泰德瑞诊断技术有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年6月30日