杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用。所述杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC?No.9105。基于所述杂交瘤细胞株产生的抗Nodal的单克隆抗体，所述抗Nodal的单克隆抗体与抗Nodal的多克隆抗体组成一种新的可应用于检测肿瘤细胞的试剂盒。本发明提供单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1∶1024000，在westernbolt检测中，本发明提供的抗体仅在目标位置检测到特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。所述试剂盒可以较好地用于血清中Nodal蛋白的含量检测，且具有较高的灵敏性和特异性。
【专利说明】杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测 肿瘤细胞方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株 的抗Nodal单克隆抗体和多克隆抗体及检测肿瘤细胞方面的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，早期诊断癌症的最便捷的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，肿瘤标志物是 指在肿瘤发生、发展过程中能反映细胞恶变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标 记物的检测，可以对辅助相应肿瘤做早期诊断、判断预后、检测疗效和肿瘤复发状况的判断 等。
[0003] Nodal属于TGF-β家族成员，它是一胚胎期高表达、而在成体组织中几乎没有表 达的蛋白质。Nodal在细胞内以无活性的前体形式存在，在经过一系列加工修饰除去N端信 号肽和一段包含200多个氨基酸的前肽序列后，便形成由110个氨基酸的成熟Nodal蛋白 被分泌至胞外，成熟Nodal蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，分子量约为12kDa (人 和小鼠的结构非常接近，氨基酸一致性达98. 29%)。其中，通过比对TGF-β家族蛋白分析 所得Nodal高特异性序列如SEQ ID N0:2所示。Nodal蛋白的功能是介导胚胎发育中外胚 层的上皮细胞向内、外胚层之间迁徙以形成间质组织。已知在胚胎发育过程中，Nodal信号 主要通过细胞膜上丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样I型受体（ActRI)和II型受体（ActRII)的 介导传入胞内。活化的ActRI (ALK4或ALK7)随即激活胞内调节蛋白Smad (Sma/Mothers Against Decapenta-plegic)家族的Smad2/Smad3复合物。此后该复合物与Smad4形成具 有活性的三聚体并转运至胞核内，结合到目的基因的顺式作用元件或启动子区域，调控相 关基因的转录，参与了肿瘤恶性生物学行为的发生过程。
[0004] 新近，人们发现Nodal蛋白在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、 胃癌、神经胶质瘤等多数肿瘤中再度表达，且其表达水平与肿瘤浸润、转移和预后不良有关 系。因此，通过检测血清中Nodal蛋白的表达情况，有望成为一种更加快速、方便、准确广泛 的肿瘤体外普查诊断方法。
[0005] 目前，对血清中蛋白的表达情况监测方法通常需要用到抗体，因此，研制一种效价 高、特异性好的Nodal蛋白抗体十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，针对Nodal蛋白抗体及其相关技术的不足，提供一 种杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株，可以产生优异的抗Nodal的抗体。
[0007] 本发明要解决的另一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0008] 本发明要解决的还一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体的应 用。
[0009] 本发明基于上述应用，提供一种将可以应用于用于肿瘤检测方面的试剂盒。
[0010] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 提供一种杂交瘤细胞株AH12,于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC N0. 9105。 toon] 本发明提供优选的上述杂交瘤细胞的制备方法为： 以SEQ ID NO: 1所示序列的成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得 到第一阳性克隆，以SEQ ID N0:2所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进 行特异性筛选得到阳性克隆，经3次亚克隆至阳性克隆率为100%，制得杂交瘤细胞，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0. 9105。
[0012] 本发明提供一种抗Nodal的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO. 9105的杂交瘤 细胞株产生。
[0013] 基于所述杂交瘤细胞产生的所述单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与 较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000,在Western Blot检测中，本发明提供的抗体 仅识别目标位置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。
[0014] 本发明提供所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，尤其是在制备检测Nodal蛋白的 检测工具中具有较好的应用。
[0015] 本发明提供的单克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。
[0016] 作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺 癌、肾癌或黑色素瘤。
[0017] 本发明提供所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： 501 :以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞； 502 :将小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，获得所述杂交瘤细胞AH12,体内诱 生或体外培养，经纯化，即得所述单克隆抗体。
[0018] 作为优选,免疫的剂量为200 μ g/只小鼠,免疫的次数为4次。
[0019] 作为优选,小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合的体积比例为5:1。
[0020] 作为优选，融合的融合剂为质量分数为50%的PEG4000。
[0021] 作为优选，Nodal蛋白与弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
[0022] 作为优选，融合后、筛选前还包括HAT培养的步骤S03,具体为用HAT选择培养基于 37°C、5%C0 2的培养箱中培养，融合后第3 d开始每隔2 d更换新鲜HAT培养基。
[0023] 作为优选，体内诱生具体为：取10周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐 齐U，注射量为〇. 5 mL/只；1周后用PBS缓冲液重悬CGMCC N0. 9105的杂交瘤细胞株至细胞 密度为IX 1〇6个/mL，每只小鼠腹腔注射1 mL; 10 d?15 d后待小鼠腹部明显隆起时收集 腹水，2000 rpm/min离心10 min,取上清。
[0024] 作为优选，纯化采用Protein A柱。
[0025] 本发明还同时提供了一种抗Nodal的多克隆抗体。所述多克隆抗体的制备方法 为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收集血清，经Protein A柱亲和纯化，即得。本 发明提供的多克隆抗体效价可达1: 32000。
[0026] 本发明提供所述多克隆抗体在制备检测Nodal蛋白的检测工具中的应用。
[0027] 本发明提供所述多克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。
[0028] 作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺 癌、肾癌或黑色素瘤。
[0029] 优选的，肿瘤为为结直肠癌、卵巢癌或乳腺癌。
[0030] 本发明还提供了一种用于肿瘤检测的试剂盒，包括：本发明提供的单克隆抗体或 本发明提供的多克隆抗体。
[0031] 由于本发明提供的单克隆抗体或多克隆抗体具有良好的效价、纯度和特异性。因 此，本发明提供的试剂盒具有较高的特异性和检测的准确度。
[0032] 作为优选，试剂盒中还包括以下包被液和封闭液等组成； 所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST ; 所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST。
[0033] 优选的，本发明提供的用于肿瘤诊断的试剂盒中还包括：HRP标记的羊抗鼠抗体、 nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸。
[0034] 其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19. 2g，加水至1000 mL，为甲液；称 取磷酸氢二钠71. 7g，加水至1000 mL，为乙液；取甲液24. 3mL，乙液25. 7mL，加水至100mL， 即得。
[0035] 本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤： SI 1 :以包被液稀释本发明所述多克隆抗体，4°C放置16h，将该多克隆抗体包被至96孔 板，以质量分数为〇. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min ; 512 :加入封闭液，37°C封闭2h后，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次 5min ； 513 :加入待测样品、由保藏编号为CGMCC NO. 9105的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体， 37°C封闭2h后，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min ; 514 :加入HRP标记的羊抗鼠抗体，18?30°C孵育2h，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲 液洗漆3次，每次5min ; 515 :加入邻苯二胺显色液，显色15min后，以摩尔浓度为2mol/L的硫酸终止反应，检测 〇〇450 ； 所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST ; 所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST。
[0036] 邻苯二胺显色液包括：100ml底物缓冲液加入100 μ L 30%双氧水、50mg 0PD(邻苯 二胺)，即得CPD显色液，现配现用。
[0037] 作为优选，S11中稀释为4000倍体积稀释。
[0038] 作为优选，S13中本发明提供的单克隆抗体经稀释4000倍体积。
[0039] 采用本发明提供的方法，当检测结果表明血清中Nodal蛋白含量为10 ng/mL? 80ng/mL时为健康人群范围，血清中Nodal蛋白含量为高于100 ng/mL时为肿瘤警戒范围。
[0040] 本发明的有益效果： 本发明提供了一种杂交瘤细胞株AH12,于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC N0. 9105。基于 所述杂交瘤细胞可产生具有优异特异性的抗Nodal单克隆抗体。
[0041] 本发明提供的抗Nodal单克隆抗体类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。 经检测，其效价可达1:1024000,在Western Blot检测中，本发明提供的抗体仅识别目标位 置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。
[0042] 本发明所述抗Nodal单克隆抗体结合抗Nodal多克隆抗体(效价可达1:32000) 建立了一套制备肿瘤细胞检测的方法、试剂和试剂盒。所述试剂盒可以精确检测血清中的 Nodal蛋白含量，具有较高的灵敏性和特异性。实验表明，本发明提供的试剂盒对血清中 Nodal检测的浓度范围为20ng/mL?500ng/mL，经验证采用本发明提供的试剂盒对27例结 直肠癌患者血清样本进行鉴定，其检测结果与预期完全一致，准确性可达100%。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1第4次免疫后小鼠血清中的抗体效价。
[0044] 图2杂交瘤细胞的单克隆。
[0045] 图3本发明提供的单克隆抗体经纯化后效价测定。
[0046] 图4本发明提供的单克隆抗体经ProteinA纯化前后的SDS-PAGE对比。
[0047] 图5本发明提供的多克隆抗体经纯化后效价测定
【权利要求】
1. 一种杂交瘤细胞株AH12,于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO. 9105。
2. 权利要求1所述杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，以SEQ ID NO: 1所示序列的 成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得到第一阳性克隆，以SEQ ID NO:2 所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行特异性筛选得到阳性克隆，经亚 克隆至阳性克隆率为100%，制得。
3. -种抗Nodal的单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生。
4. 权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测Nodal 蛋白方面的检测工具或在制备检测肿瘤细胞的试剂方面的应用。
5. 根据权利要求4所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，肿瘤为结肠癌、直 肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。
6. 权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 501 :以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞； 502 :将小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，获得所述杂交瘤细胞AH12,体内诱 生或体外培养，经纯化，即得。
7. -种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述单克隆抗体和抗Nodal的多克隆抗 体； 所述抗Nodal的多克隆抗体的制备方法为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收 集血清，经Protein A柱亲和纯化，即得。
8. 根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括以下包被液和封闭液等组成； 所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST ; 所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0. 5%的PBST。
9. 根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括HRP标记的羊抗鼠抗体、nodal标 准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸； 其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19. 2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷 酸氢二钠71. 7g，加水至1000 mL，为乙液；取甲液24. 3mL，乙液25. 7mL，加水至100mL，即 得。
10. 权利要求7、8或9所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤： 511 :以包被液稀释本发明所述多克隆抗体，4°C放置16h，将该多克隆抗体包被至96孔 板，以质量分数为〇. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min ; 512 :加入封闭液，37°C封闭2h后，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次 5min ； 513 :加入待测样品、由保藏编号为CGMCC NO. 9105的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体， 37°C封闭2h后，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min ; 514 :加入HRP标记的羊抗鼠抗体，18?30°C孵育2h，以质量分数为0. 5%的PBST缓冲 液洗漆3次，每次5min ; 515 :加入邻苯二胺显色液，显色15min后，以摩尔浓度为2mol/L的硫酸终止反应，检测 OD450。
【文档编号】G01N33/577GK104087557SQ201410268890
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】杜军, 蔡绍晖 申请人:中山大学