标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变性。
[0026] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，所述蛋白 分子与非离子表面活性剂在杂交液中还能够进一步发生协同效应，共同通过范德华力结合 到固相支持物的表面，有效防止未反应的碱性磷酸酶标记链霉亲和素和/或生物素标记靶 标核酸在固相支持物表面的非特异性吸附，起到很好的封闭作用，从而使本发明的方法可 以省去杂交反应前的预杂交步骤。
[0027] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，所述阳离 子型聚合物能够与生物素标记的靶核酸分子（通过PCR扩增获得的生物素标记靶核酸分 子）产生静电吸附作用，使单链核酸分子（带许多负电荷）带上一个正电荷部分，从而在核 酸杂交过程中同步吸附到固相支持物的表面。由于碱性磷酸酶标记链霉亲和素也带有正电 荷，这样就避免了碱性磷酸酶非特异性吸附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合 物可以使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成以后 标记在核酸偶联物上的碱性磷酸酶保持活性状态，从而使得碱性磷酸酶构象的平衡转换朝 着天然状态移动。
[0028] 在本发明的方法中，所述杂交液中还可以包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在本 质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于：硫 酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。
[0029] 在本发明的方法中，所述杂交液中还可以包括其他成分，可以列举的杂交液中其 他成分的实例包括但不限于：氯化钠、杂交缓冲溶液、Denhardt's溶液、十二烷基肌氨酸钠 或十二烷基磺酸钠。可以用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：柠檬酸-柠 檬酸钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。
[0030] 在本发明的方法中，所述杂交液不包括乙二胺四乙酸盐、无机磷酸盐和乙醇胺。
[0031] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述显色溶液还包括Cs~C1S烷基葡萄 糖苷，优选C9~C13烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0. 01~0. 5% (w/v)， 优选 〇· 05 ~0· 1 % (w/v)。
[0032] 本发明的方法通过在显色溶液中添加烷基葡萄糖苷，在不影响酶催化底物反应的 前提下，使得显色溶液具有显著的洗涤效果，从而可以省略传统酶显色之前的洗涤步骤，极 大缩短了传统方法检测靶核酸的耗时。
[0033] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述显色溶液包含Tris-HCl缓冲溶液， 优选PH9. 5的Tris-HCl缓冲溶液。
[0034] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，所述 Tris-HCl缓冲溶液能够在显色反应过程与烷基葡萄糖苷发生协同配合作用，实现对固相支 持物表面的清洗，去除非特异性吸附在固相支持物表面的物质，从而在杂交反应后无须经 过单独的洗膜步骤就可以直接在显色溶液中通过酶促反应使底物形成有色产物而显色。
[0035] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述显色溶液以流动的方式与所述固 相支持物表面接触进行显色；所述流动的方向为上下流向或左右流向；所述流动的时间为 2min~30min,优选 5min~20min,更优选 8 ~15min〇
[0036] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，所述显色 溶液以流动的方式与所述固相支持物表面进行接触，不仅可以促进酶催化底物反应效率， 缩短显色时间，提高显色效果，而且可以加速非特异性吸附在固相支持物表面的物质、未反 应的酶标记链霉亲和素以及生物素标记靶核酸从固相支持物表面脱离，起到清洗固相支持 物表面的作用。所述流动的方向可以是上下方向，此时显色溶液自上而下流过固相支持物 表面；所述流动的方向可以是左右流向，此时显色溶液在固相支持物表面水平流动。所述显 色溶液的流速与流量可以根据实际需要进行设定，没有特别的要求。
[0037] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述反应的温度为35~50°C，反应时间 为5~30min;优选地，反应温度为37~42°C，反应时间为10~15min。
[0038] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，由于在核 酸探针与靶核酸杂交反应的过程中同步实现了酶联反应过程，因此需要严格控制杂交反应 的时间和温度。如果杂交反应时间较短或杂交反应温度较低，核酸杂交效率将会降低，难以 在固相支持物表面形成稳定的双链，影响靶核酸检测的灵敏度；反之，如果杂交反应时间较 长或杂交反应温度较高，碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中容易失活，影响靶核酸检 测的特异性。本发明的发明人经过大量实验和创造性劳动发现，反应温度为35~50°C、反 应时间为5~30min时比较合适，优选反应温度为37~42°C，反应时间为10~15min，此 时靶核酸检测的灵敏度和特异性较好。
[0039] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述核酸探针选自长度为15~40个碱 基的寡核苷酸探针，优选选自长度为16~25个碱基的寡核苷酸探针。
[0040] 在本发明的方法中，通过调整核酸探针的长度和组成，降低了核酸探针与生物素 标记靶核酸杂交的温度，从而使得杂交反应与酶联反应能够统一成一个反应过程进行。本 发明的发明人经过大量实验发现，所述核酸探针选自长度为15~40个碱基的寡核苷酸探 针时比较合适，优选选自长度为16~25个碱基的寡核苷酸探针，此时杂交反应的温度可以 为37~42°C。特别优选的DNA探针的长度包括16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个碱 基。
[0041] 在本发明的方法中，核酸探针长度的选择的依据是：如果核酸探针长度过低，虽然 可以提高探针杂交的特异性，但是会显著降低探针杂交的灵敏度；如果核酸探针长度过长， 可以进一步提高探针杂交的灵敏度，但探针杂交特异性会显著降低。对于过长的核酸探针， 也不能够通过提高杂交温度来提高探针杂交的特异性，因为过高的温度会使得杂交体系中 的碱性磷酸酶标记链霉亲和素失活。同时考虑到探针的GC含量对杂交Tm值得影响，综合 上面各种因素，16~25个碱基的寡核苷酸探针是合适的范围。
[0042] 根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述核酸探针还包括阳性质控探针和 阴性质控探针。其中，所述阳性质控探针可以是人actin基因探针；所述阴性探针可以是引 物设计软件随机生成的一段序列，其特点是不与任何生物的核酸序列相似。
[0043] 根据本发明的一个具体实施例，在步骤A)之前还包括使用用于扩增靶核酸的生 物素标记的引物进行PCR反应而扩增样品中靶核酸的步骤。
[0044] 在本发明的方法中，所述生物素标记靶核酸可以通过如下方法制备得到：首先对 样品中的靶核酸进行分离提取，然后使用用于扩增靶核酸的生物素标记的引物对分离提取 的靶核酸进行PCR扩增得到扩增样品的靶核酸，以提高检测的灵敏度。
[0045] 根据本发明的一个具体实施例，在步骤A)之前还包括在生物素标记脱氧核苷酸 的存在下进行PCR反应而扩增样品中靶核酸的步骤。
[0046] 在本发明的方法中，所述生物素标记靶核酸可以通过如下方法制备得到：首先对 样品中的靶核酸进行分离提取，然后在生物素标记脱氧核苷酸的存在下对分离提取的靶核 酸进行PCR扩增得到扩增样品的靶核酸，以提高检测的灵敏度。
[0047] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述底物包括但不限于：硝基蓝四氮唑 (NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP)、坚牢红和萘酚ASMX。在碱性磷酸酯酶的催 化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色 至蓝紫色的NBT-formazan。
[0048] 根据本发明的一个具体实施例，所述生物素标记靶核酸在进行杂交反应前需要进 行变性，变性的方法可以是本领域技术人员所熟知的。
[0049] 根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自：尼龙膜、硝酸纤维素膜或聚 丙烯膜。其中，尼龙膜和硝酸纤维素膜是优选的，硝酸纤维素膜是特别优选的。
[0050] 在本发明的方法中，选择合适的固相支持物处理方法以及核酸探针在固相支持物 表面的固定方法在本领域技术人员的知识范围内。
[0051] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了所述方法在检测结核分枝杆菌耐药基因 中的应用。
[0052] 将本发明的方法用于检测结核分枝杆菌耐药基因，一方面将核酸反向分子杂交过 程与酶联过程合二为一进行，可以在固相支持物表面直接形成碱性磷酸酶标记标记核酸杂 交体的偶联物；另一方面将洗涤与显色反应合二为一进行，直接在显色溶液中通过酶促反 应使底物形成有色产物而显色，从而在杂交反应后无需经过单独的洗涤步骤就可以快速实 现样品中靶核酸检测的目的。
[0053]在本发明的方法中，所述的"核酸"术语是总括表示核糖核酸（即RNA)、脱氧核糖 核酸（即DNA)、肽核酸（即PNA)、甲基磷酸酯核酸、S-低聚、cDNA和cRNA，以及任何低聚核 苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸类似体的术语，这样的核酸可以是天然存在的，也可以是人 工合成的。
[0054] 在本发明的方法中