液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法
【专利摘要】本发明涉及检验检疫技术，尤其涉及一种液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法。该发明采用QuEChERS净化技术-超高效液相色谱－电喷雾串联四级杆质谱检测，优化分析程序和参数，对常用于柑橘保鲜的多种保鲜剂残留检测进行定性和定量方法研究，分别是多菌灵、噻菌灵、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌灵、咪酰胺和2,4-D。从而建立高灵敏度、准确、快速、能同时检测多种防腐保鲜剂残留的检测技术。
【专利说明】液质联用仪同时检测柏橘中多种防腐保鲜剂残留的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检验检疫技术，尤其涉及一种液质联用仪同时检测巧橘中多种防腐保 鲜剂残留的方法。
【背景技术】
[0002] 我国巧橘种植面积和产量分别约占世界巧橘总面积和总产量的39%和31. 6%， 位列世界第一。巧橘富含多种营养成分和独特的生理活性物质，深受人们的喜爱。巧橘除 用于鲜食外，也可加工成多种副产品。巧橘是我国南方地区栽培面积最大、经济地位最重要 的果树之一，浙江省是我国重要的巧橘生产基地。近年来，随着巧橘产量的激增，巧橘供求 关系发生了根本的变化，由卖方市场转向了买方市场，由数量型消费转变为质量型消费。巧 橘产量的连年增长，使得巧橘的国内市场竞争越来越激烈，因此，扩大巧橘出口量是增加巧 橘销售的重要途径。浙江省巧橘W出口鲜果和橘子罐头为主，W欧美、俄罗斯、日本和东南 亚为主要市场。
[0003] 然而，我国出口的一些农产品往往由于有毒有害物质残留量超过外方的限制标 准，被拒收、扣留、退货、索赔和终止合同的现象屡屡发生，部分传统大宗出口创汇商品被迫 退出国际市场。我国是第一水果生产大国，但在世界水果出口贸易中我国水果所占份额很 小，而且售价低，有毒有害物质含量超标是造成该一局面的原因之一。发达国家通过设立严 格限量标准，一方面保证本国公民的身体健康，一方面为阻碍包括水果在内的农产品进入 国际市场制造技术贸易壁垒。
[0004] 近年来，巧橘中的化学防腐保鲜剂对人体的危害越来越受到人们的关注。由于巧 橘在采摘后的胆藏中由于自身生理活动和有害生物危害等原因，会造成损失。目前我国普 遍使用防腐保鲜剂来降低因病原微生物浸染而导致巧橘在胆藏期的损失，其中化学防腐剂 因其效果好、成本低、使用方便等优势占据了市场主导地位。化学防腐保鲜剂虽然具有良好 的防腐保鲜的作用，但大多化学防腐保鲜剂有不同程度的毒性，巧橘中的保鲜剂残留会对 人体健康产生不利影响，甚至出现致癌、致崎、致突变等情况，化学防腐保鲜剂在巧橘胆藏 中的应用造成的高毒高残留问题因此也越来越受到人们的关注。一些发达国家修订的水果 或巧橘中化学防腐保鲜剂限量要求日趋严格。例如我国巧橘中咪鲜胺限量为5mg/kg，而加 拿大对其的限量为0. Img/kg。日本2006年实行的农药、兽药及相关化学物质"肯定列表制 度"规定水果中苯菌灵，硫菌灵，甲基硫菌灵和多菌灵总量最低限量不超过2mg/kg等。该些 都有可能成为国外限制我国巧橘出口的技术壁垒，影响我国橘农增收。因此，为帮助出口企 业降低风险，有效规避发达国家对我国出口巧橘的技术壁垒，发展快速、可靠、灵敏的防腐 保鲜剂残留检测技术无疑是控制有毒有害物质残留、保障进出口食品安全、避免国际间有 关贸易争端的基础。本研究具有重要的社会和经济意义。
[0005] 我国发布实施的国家标准《食品中农药最大残留限量KGB2763-2014)规定了水果 中杀菌剂的最大残留限量，其中，多数杀菌剂可用作食品保鲜剂。多菌灵、喔菌灵、咪醜胺、 抑霉哇、甲基硫菌灵、咪醜胺、2, 4-D等都是常用的化学防腐保鲜剂，广泛应用于水果等多种 作物生长期和储存期真菌性病害的防治，若使用不当，会在水果及由水果制成的果汁中残 留。
[0006] 目前，虽然已有涂膜、减压处理、高压处理、天然保鲜剂、生物保鲜剂等巧橘保鲜新 技术的研究与报道，但受到技术、成本等因素影响，我国对于巧橘防腐保鲜处理普遍使用的 仍是化学防腐保鲜剂。针对防腐保鲜剂的检测分析方法，已报道的主要有高效液相色谱、气 相色谱、液相色谱一质谱联用及酶联免疫法等。气相色谱法或液相色谱法易受杂质干扰，且 灵敏度低；酶联免疫方法操作过程繁琐，且条件要求苛刻；而液相色谱一质谱联用法溶剂 消耗量大、耗时长。
[0007] 由于防腐保鲜剂混配使用具有协同作用，我国巧橘主产区大多采用混配药剂来提 高巧橘的防腐保鲜效果。随着混配防腐保鲜剂的广泛应用，单个防腐保鲜剂检测方法已不 能满足现实需要，迫切需要能够快速、可靠的高通量检测方法，该对于保障消费者健康，避 免和减少不必要的农业损失和国际贸易争端具有重要的理论和实践意义。
[0008] QuEQiERS 净化技术为如cik, Easy, Qieap, Effective, Rugged, Safe 首字母的 缩写，中文解释为快速、简单、经济、高效、安全的分析前处理方法，2003年由美国农业部 MAnastassiades等共同研发，后经过多方面的验证和改进，正式提出了如E化ERS方法。现 在如E化邸S已经成为了全球检测水果、蔬菜中农残时的标准样品处理方法。除此W外，其 应用也涉及到越来越多的不同领域，比如肉类、血液样品、酒、甚至±壤中抗生素、药物、滥 用药、还有其他污染物的检测。
[0009] 在HPLC基础上发展起来的超高效液相色谱扣化C)技术采用了 3.5 ym，甚至 1. 7 y m细颗粒固定化比起传统的HPLC技术，UPLC提供了更大的色谱峰容量、更高的分辨 率和灵敏度W及更快的分析速度。由于巧橘中防腐保鲜剂有些化学结构，性质类似，很难在 短时间内同时分离，因此本研究采用快速高效液相扣PLC)能有效的缩短分析时间、提高色 谱分辨率和分析通量。液相色谱-质谱联用检测法是近几年兴起的新技术，由于液质联用 技术具有极高的灵敏度，适合进行痕量分析，同时可提供的分子量和碎片质量等结构信息， 可靠性较高，可同时测定多种物质，欧盟、美国等均将液质联用方法列为确证方法。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种液质联用仪同时检测巧橘中 多种防腐保鲜剂残留的方法，该方法具有高灵敏度、准确、快速、能同时检测多种防腐保鲜 剂残留的特点。
[0011] 为了实现上述的目的，本发明采用了W下的技术方案：
[0012] 液质联用仪同时检测巧橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，所述的多种防腐保鲜剂 为多菌灵、喔菌灵、咪醜胺、抑霉哇、甲基硫菌灵、咪醜胺和2, 4-滴，该方法包括W下的步 骤：
[0013] 1)标准储备液的配制
[0014] 用十万分之一天平准确称取7种保鲜剂标准品IOmg于烧杯中，精确至0. Img,加己 膳溶解并定容至IOmL容量瓶中，其中喔菌灵用甲醇溶解，多菌灵用5%甲酸己膳溶解，混匀 配制成浓度为IOOOy g/mL的单标储备液，在冰箱中TC?4C保存；
[001引。标准工作溶液
[0016] 分别准确移取ImL各单标储备液置于IOOmL踪色容量瓶中，用己膳定容至刻度， 配成IOy g/mL的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，用稀释成化g/mL、 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液，所述的己膳-水溶液含 0. 15%甲酸，己膳-水的体积比为1:1，各种标准溶液密封保存于4C冰箱中；
[0017] 3)试样制备
[0018] 取200g带皮枯橘样品经四分法选取一定量的样本，经粉碎或组织捣碎机匀浆，装 入样品袋中，密封、标记、rc?4C冰箱中冷藏待用；
[001引 4)样品提取
[0020] 称取试样IOg于50血具塞离也管中，精确至0. Olg,加入20血5%甲酸-己膳溶液， 縱润混合2min，加入Ig氯化轴盐析至少30min，然后W 600化/min离也5min待净化； [00川 W样品净化
[002引称取900mg无水硫酸镇、150mg PSA、150mg C18于15血塑料离也管中，混匀作为净 化试剂；准确移取6血离也后的上清液于净化管中，润旋混匀，W 3000r/min离也5min，取 1血净化后上清液用蒸觸水稀释一倍后过0. 22 y m滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定； [002引 6)色谱测定
[0024] a)色谱柱；Hypersil GOLD C18, 1. 9 y m, 2. ImmX 50mm，或相当者；
[00巧]b)梯度洗脱条件：
[0026]
【权利要求】
1.液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，所述的多种防腐保鲜剂为 多菌灵、噻菌灵、嘧霉胺、抑霉唑、咪酰胺、甲基硫菌灵和2, 4-滴，其特征在于该方法包括以 下的步骤： 1) 标准储备液的配制 用十万分之一天平准确称取7种保鲜剂标准品IOmg于烧杯中，精确至0.lmg，加乙腈溶 解并定容至IOmL容量瓶中，其中噻菌灵用甲醇溶解，多菌灵用5%甲酸乙腈溶解，混匀配制 成浓度为ΙΟΟΟμg/mL的单标储备液，在冰箱中1°C?4°C保存； 2) 标准工作溶液 分别准确移取ImL各单标储备液置于IOOmL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度,配成 10μg/mL的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，用稀释成2ng/mL、5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液,所述的乙腈-水溶液含0· 15% 甲酸，乙腈-水的体积比为1:1，各种标准溶液密封保存于4°C冰箱中； 3) 试样制备 取200g带皮柑橘样品经四分法选取一定量的样本，经粉碎或组织捣碎机匀浆，装入样 品袋中，S封、标记、IC?4C冰箱中冷减待用； 4) 样品提取 称取试样IOg于50mL具塞离心管中，精确至0. 01g，加入20mL5%甲酸-乙腈溶液，漩 润混合2min，加入Ig氯化钠盐析至少30min，然后以6000r/min离心5min待净化； 5) 样品净化 称取900mg无水硫酸镁、150mgPSA、150mgC18于15mL塑料离心管中，混勻作为净化 试剂；准确移取6mL离心后的上清液于净化管中，涡旋混匀，以3000r/min离心5min，取ImL 净化后上清液用蒸馏水稀释一倍后过0. 22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定； 6) 色谱测定 a)色谱柱：Hypersil GOLD018，1.94111，2.1111111\5〇111111，或相当者； b) 梯度洗脱条件:_
c) 柱温：35°C d) 进样量：2yL; 7) 质谱测定 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正负切换扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 毛细管温度：350°C; e) 蒸发温度：300°C; f) 电喷雾电压：+3500(-3000)V; g) 鞘气：30arb; h) 辅助气：IOarb; i) 碰撞气：氦气； j) SRM监测离子对、S-Lens电压、碰撞电压、扫描模式和保留时间如下：
8) 仪器测定 样品进样的程序为：试剂空白、标准工作曲线、样品空白、样品添加与实际样品，重复以 上步骤； 9) 定量方法 按步骤8)进样，用色谱工作站建立标准工作曲线，样品采用工作曲线定量。
2.根据权利要求1所述的液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，其 特征在于所述的柑橘为蜜桔、栊柑或胡柚。
【文档编号】G01N30/02GK104237414SQ201410486081
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】彭芳, 雷美康, 祝子铜, 吴晓勤, 徐佳文 申请人:衢州出入境检验检疫局综合技术服务中心