一种t淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于免疫学【技术领域】，公开了一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法，包括：取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所得检测数据；该抗体包括：抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体和抗CD45RA抗体。本发明的方法实现了对T淋巴细胞进行更加全面的精细免疫分型，所需待测样品少，操作简单、所需时间短、准确性高、可广泛应用于淋巴细胞亚群免疫分型。
【专利说明】一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学【技术领域】，特别涉及一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 淋巴细胞（lymphocyte)也称淋巴球，为白细胞中体积最小的一种，直径6-8微米； 在人体约占白细胞数目的20% -30%，圆形细胞核，细胞质很少；由淋巴器官产生，是机体 免疫应答功能的重要细胞成分，是一类具有免疫识别功能的细胞系。淋巴细胞是复杂的异 质性细胞群体，根据其表型和功能特征可分为不同类别，如T细胞、B细胞、NK细胞等，这些 细胞还可以进一步分为若干亚群。淋巴细胞及其亚群在免疫应答过程中相互协作、相互制 约，共同完成对抗原物质的识别、应答和清除，从而维持机体内环境稳定。
[0003] 早期研究根据淋巴细胞按其发生迁移、表面分子和功能的不同，大体上将淋巴细 胞分为T细胞、B细胞和自然杀伤（NK)细胞。其中T细胞可分为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc)、辅助 T 细胞（helper T lymphocyte，Th)、记忆 T 细胞（memory T lymphocyte，Tm)和调节 / 抑制 T 细胞（regulatory/suppressor T lymphocyte) ;B 细胞可 进一步分为记忆B细胞（memory B cell)、楽细胞（plasma cell)、初始B细胞（na'l've B cell)等亚类。
[0004] 随着科学研究的不断进步，科学家发现了更多的细胞表面标志，可以将各类淋巴 细胞进行更加精细的细胞亚群分类。例如，可以将T细胞进一步划分为：TCRa ￠ +双阴性T 细胞（double negative T lymphocyte，DNT)、Y ST细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细 胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、 细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞。
[0005] 血液样品中淋巴细胞的种类与机体的免疫系统性能有着重要关系。通过对血液样 品中淋巴细胞进行免疫分型和定量分析，能够更加准确地评价机体的免疫功能，也能够更 好地研究某些疾病的发生、发展以及治疗效果评价。目前，常用于血液样品中的淋巴细胞 免疫分型和定量分析的方法主要有：免疫酶标法、普通淋巴细胞分类、较细淋巴细胞亚群检 测。免疫酶标法只是针对某一种或一类特定的抗原或抗体发生特异反应，检测面窄、操作复 杂、对待检测样品需求量大，费时费力。普通淋巴细胞分类，普遍应用于淋巴细胞检测，但只 能将淋巴细胞分为T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞和NK细胞，不能进一步对细胞进行分 型。较细淋巴细胞亚群检测依赖于流式细胞术，采用多色流式的方法，对淋巴细胞进行较为 详细的分型，除传统的T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞和NK细胞外，还检测Tm细胞及细胞 数量。但是，如果想进一步对细胞亚群进行免疫分型和定量分析的话，还需要借助于其他的 细胞免疫分型方法，操作复杂，对待测样品的需求量大，并不适合实际应用。所以，还需要对 淋巴细胞免疫分型和定量分析的方法进行研究，以求尽可能利用简单的方法将淋巴细胞进 行较精细地免疫分型和定量分析。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂 盒。该T淋巴细胞免疫分型的方法能够对T淋巴细胞进行更为全面的精细免疫分型和定量 分析，效率高，且节约了待测样品的用量，更合适T淋巴细胞的免疫分型和定量分析。
[0007] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
[0008] 本发明提供了一种T淋巴细胞免疫分型的方法，包括：
[0009] 取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检 测数据，分析所述检测数据；
[0010] 该抗体包括：
[0011] 抗TCR a e的抗体、抗TCR Y S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗 体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体；
[0012] 该分析的方法包括：
[0013] 细胞表面标志⑶3+TCR a @ +⑶4XD丨代表TCR a @ +双阴性T细胞；
[0014] 细胞表面标志⑶3+TCR Y S +代表Y S T细胞；
[0015] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
[0016] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表辅助耗竭T细胞；
[0017] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表辅助中心记忆T细胞；
[0018] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表辅助效应记忆T细胞；
[0019] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
[0020] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表细胞毒性耗竭T细胞；
[0021] 细胞表面标志⑶8+⑶45RATD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
[0022] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表细胞毒性效应记忆T细胞。
[0023] 在本发明中，流式细胞术中所用到的抗体可以为与待测样品同源的抗体或也可以 为与待测样品非同源的抗体，只要该抗体能够与待测样品中细胞表面标志物产生抗原-抗 体特异性结合反应即可。
[0024] 在本发明中，" + "代表阳性，即表示该抗原在细胞表面有表达；
[0025] "++"代表强阳性，即表示该抗原在细胞表面高表达；
[0026] 代表阴性，即表示该抗原在细胞表面不表达。
[0027] 淋巴细胞的表面标志是指存在于淋巴细胞表面的膜分子，它们是淋巴细胞识别 抗原、与其他免疫细胞相互作用以及接受信号刺激并产生应答的物质基础，也是鉴别和分 离淋巴细胞的重要依据。在淋巴细胞的分化发育过程中，淋巴样干细胞进一步分化成各 个细胞亚群，赋予了各个细胞亚群特定的表面标志。有些表面标志是淋巴细胞共有的，有 些表面标志是某一类或某几类淋巴细胞特有的，所以在进行淋巴细胞免疫分型时，可以有 众多种组合。但是并不是每种组合都能够实现淋巴细胞的免疫分型，本发明通过大量的 创造性劳动发现：针对T细胞，细胞表面标志为⑶3+TCRa 0+CD4TDK时，可对TCRa ￠ + 双阴性T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为⑶3+TCRy S +时，可对Y ST细胞进行免 疫分型；细胞表面标志为CD3+CD4+CD45RA+CD27+时，可对辅助初始T细胞进行免疫分型； 细胞表面标志为⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27_时，可以对辅助耗竭T细胞进行免疫分型；细胞表 面标志为⑶3+⑶4+CD45RATD27+时，可以对辅助中心记忆T细胞进行免疫分型；细胞表 面标志为⑶3+⑶4+CD45RATD27_时，可以对辅助效应记忆T细胞进行免疫分型；细胞表 面标志为CD3+CD8+CD45RA+CD27+时，可以对细胞毒性初始T细胞进行免疫分型；细胞表 面标志为CD3+CD8+CD45RA+CD27_时，可以对细胞毒性耗竭T细胞免疫分型；细胞表面标 志为⑶8+CD45RATD27+时，可以对细胞毒性中心记忆T细胞免疫分型；细胞表面标志为 ⑶3+CD8+⑶45RATD27_时，可以对细胞毒性效应记忆T细胞免疫分型。本发明根据对各个细 胞所对应的细胞表面标志，设计获得了最优的细胞表面标志的抗体组合，通过流式细胞术， 对T淋巴细胞进行了更为全面的免疫分型。本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法所需 待测样品少、操作简单、准确性高，能够用于T淋巴细胞的免疫分型。
[0028] 优选地，本发明提供T淋巴细胞免疫分型的方法中，还设置对照组和同型对照组。 设置对照组的意义在于排除无关变量的影响，增加实验结果的可信度和说服力；设置同型 对照组的意义在于区别抗体染色过程中相同亚型所造成的背景信号影响。
[0029] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，对照组 所用不同的荧光标记的抗体具体为：
[0030] 抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗体。
[0031] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 TCRa 0的抗体的荧光标记为PE。
[0032] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 TCRy S的抗体的荧光标记为BV421或FITC。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供 的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗TCR Y S的抗体的荧光标记为FITC。
[0033] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 ⑶3的抗体的荧光标记为Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本发明的另外一些实施例中，本 发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗⑶3的抗体的荧光标记为Pacific blue。
[0034] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 CD4的抗体的荧光标记为FITC或APC-Cy7。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的 T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗⑶4的抗体的荧光标记为APC-Cy7。
[0035] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 ⑶8的抗体的荧光标记为BV510。
[0036] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 ⑶27的抗体的荧光标记为APC。
[0037] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，抗 CD45RA的抗体的荧光标记为TO-Cy7。
[0038] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，同 型对照所用的抗体具体为：PE标记的同型抗体、FITC标记的同型抗体、APC标记的同型抗 体、PE-Cy7标记的同型抗体。
[0039] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法，具体 为：
[0040] 取荧光标记的抗TCRa 0的抗体、荧光标记的抗TCRy S的抗体，与待测样品混 合，室温（即20°C?25°C )条件下，孵育25min?35min，得第一产品；
[0041] 取荧光标记的抗⑶3的抗体、荧光标记的抗⑶4的抗体、荧光标记的抗⑶8的抗 体、突光标记的抗CD27的抗体、突光标记的抗CD45RA的抗体，与第一产品混合，室温（即 20°C?25°C )条件下，孵育25min?35min，得第二产品；
[0042] 取第二产品与红细胞裂解液混合，并将所得混合液置于36. 5°C?37. 5°C的中水 中水浴9min?llmin，洗涤，流式上机检测，得检测数据，分析检测数据；
[0043] 分析的方法包括：
[0044] 细胞表面标志⑶3+TCR a P +⑶4XD丨代表TCR a P +双阴性T细胞；
[0045] 细胞表面标志⑶3+TCR Y S +代表Y S T细胞；
[0046] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
[0047] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表辅助耗竭T细胞；
[0048] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表辅助中心记忆T细胞；
[0049] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表辅助效应记忆T细胞；
[0050] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
[0051] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表细胞毒性耗竭T细胞；
[0052] 细胞表面标志⑶8+⑶45RATD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
[0053] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表细胞毒性效应记忆T细胞。
[0054] 在本发明中，本发明提供的方法中，各个荧光标记的抗体中的荧光标记物不受本 发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的荧光标记物，以及对应的同型 对照。
[0055] 优选地，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，还包括统计待测样品中T淋 巴细胞数目的步骤。
[0056] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的T淋巴细胞免疫分型的方法中，检测样 品中T淋巴细胞数目的步骤包括：
[0057] 检测待测样品中淋巴细胞的总数；
[0058] 检测待测样品中T淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比；
[0059] 通过计算，即得待测样品中T淋巴细胞的数目。
[0060] 本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞数目中，淋巴细胞总数乘以其中T淋 巴细胞的百分比，即得T淋巴细胞的数目。在本发明中通过对待测样品各个T细胞亚群进 行免疫分型和相对数统计，再结合T淋巴细胞的绝对数，即可获得每个T细胞亚群的细胞绝 对数。
[0061] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤，包括：
[0062] 取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待测样品混合，孵育后，经流式细胞术检 测，得检测数据，分析所述检测数据；
[0063] 检测待测样品中T淋巴细胞的百分比中所用的抗体包括：
[0064] 抗⑶45的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶16的抗体、抗⑶56的抗体、抗⑶19的抗体；
[0065] 检测待测样品中T淋巴细胞的百分比中所用的抗⑶3的抗体与T淋巴细胞免疫分 型中所述抗CD3的抗体，各自独立地带有荧光标记。
[0066] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中，对照组所用抗体为：荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD3抗体、荧光标 记的⑶4抗体、荧光标记的⑶8抗体。
[0067] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中,抗⑶45的抗体荧光标记为Percp。
[0068] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中，抗⑶3的抗体的荧光标记为FITC。
[0069] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中,抗⑶16的抗体的荧光标记为PE。
[0070] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中，抗⑶56的抗体的荧光标记为PE。
[0071] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中,抗⑶19的抗体的荧光标记为APC。
[0072] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中,抗⑶4的抗体的荧光标记为APC。
[0073] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分 比的步骤中,抗⑶8的抗体的荧光标记为PE。
[0074] 在本发明中，本发明提供的方法中，检测样品中T淋巴细胞的百分比的步骤为常 规的淋巴细胞免疫分型和定量分析方法，该方法不受本发明的限制，本领域技术人员可以 根据实际情况选择测定待测样品中T淋巴细胞的百分比的方法。
[0075] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中淋巴细胞 的总数的方法为采用血细胞计数仪进行计数。在本发明中，本发明提供的方法中，检测待测 样品中淋巴细胞的总数的方法为常规的方法，该方法不受本发明的限制，本领域技术人员 可以根据实际情况选择检测待测样品中淋巴细胞的总数的方法。
[0076] 本发明还提供了一种淋巴细胞免疫分型的方法，其包括本发明提供的T淋巴细胞 免疫分型的步骤；
[0077] 该T淋巴细胞免疫分型的方法包括：
[0078] 取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检 测数据，分析所述检测数据；
[0079] 该抗体包括：
[0080] 抗TCR a 0的抗体、抗TCR Y S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗 体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体；
[0081] 该分析的方法包括：
[0082] 细胞表面标志⑶3+TCR a P +⑶4XD丨代表TCR a P +双阴性T细胞；
[0083] 细胞表面标志⑶3+TCR Y S +代表Y S T细胞；
[0084] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
[0085] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27_代表辅助耗竭T细胞；
[0086] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27+代表辅助中心记忆T细胞；
[0087] 细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RAXD27_代表辅助效应记忆T细胞；
[0088] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
[0089] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RA+CD27_代表细胞毒性耗竭T细胞；
[0090] 细胞表面标志⑶8+⑶45RATD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
[0091] 细胞表面标志⑶3+⑶8+⑶45RAXD27_代表细胞毒性效应记忆T细胞。
[0092] 本发明还提供了一种用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒，包括如下不同的荧光标 记的抗体：
[0093] 抗TCR a 0的抗体、抗TCR Y S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗 体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体。
[0094] 在本发明中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，荧光标记的抗 体，可以是荧光标记物与抗体单独放置，在使用时将两者偶联获得荧光标记的抗体；也可以 是荧光标记的抗体，在使用时，直接使用即可。
[0095] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒包括 荧光标记物和抗体；
[0096] 该抗体包括：
[0097] 抗TCR a P的抗体、抗TCR Y S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗 体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体。
[0098] 在本发明一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗 TCRa 0的抗体的荧光标记为PE。
[0099] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗TCRy S的抗体的荧光标记为BV421或FITC。在本发明的另外一些实施例中，本发明 提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗TCR Y S的抗体的荧光标记为FITC。
[0100] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶3的抗体的荧光标记为Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本发明的另外一些实施例 中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗CD3的抗体的荧光标记为Pacific blue。
[0101] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶4的抗体的荧光标记为FITC或APC-Cy7。在本发明的另外一些实施例中，本发明提 供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗CD4的抗体的荧光标记为APC-Cy7。
[0102] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶8的抗体的荧光标记为BV510。
[0103] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶27的抗体的荧光标记为APC。
[0104] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗CD45RA的抗体的荧光标记为PE-Cy7。
[0105] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中的抗体，还包括同型对照抗体，具体为：PE标记的同型抗体、BV421标记的同型抗体、APC 标记的同型抗体、PE-Cy7标记的同型抗体。
[0106] 在本发明中，本发明提供的试剂盒中，各个荧光标记的抗体中的荧光标记物不受 本发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的荧光标记物，以及对应的同 型对照。
[0107] 本发明还提供了一种用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒，其包括如下不同的荧光标 记的抗体：
[0108] 抗TCR a 0的抗体、抗TCR Y S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗 体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体。
[0109] 在本发明一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗 TCRa 0的抗体的荧光标记为PE。
[0110] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗TCRy s的抗体的荧光标记为BV421或FITC。在本发明的另外一些实施例中，本发明 提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗TCR Y S的抗体的荧光标记为FITC。
[0111] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶3的抗体的荧光标记为Percp-Cy5. 5或Pacific blue。在本发明的另外一些实施例 中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗CD3的抗体的荧光标记为Pacific blue。
[0112] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶4的抗体的荧光标记为FITC或APC-Cy7。在本发明的另外一些实施例中，本发明提 供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，抗CD4的抗体的荧光标记为APC-Cy7。
[0113] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶8的抗体的荧光标记为BV510。
[0114] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗⑶27的抗体的荧光标记为APC。
[0115] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒 中，抗CD45RA的抗体的荧光标记为PE-Cy7。
[0116] 在本发明中，流式细胞术检测过程中，通过目标细胞分群是否清楚、目标细胞荧光 强度等表示准确性的高低；目标细胞分群清楚、目标细胞荧光强度准确高，则表示准确性 商。
[0117] 本发明提供了一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本发明提供的T淋巴 细胞免疫分型的方法，包括：取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式 细胞术检测，得检测数据，分析所得检测数据；该抗体包括：抗TCR a P的抗体、抗TCR Y S 的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗体、抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体； 该分析的方法包括：细胞表面标志⑶3+TCR a 0 +⑶4TD8_代表TCR a 0 +双阴性T细胞；细 胞表面标志⑶3+TCRy S +代表Y ST细胞；细胞表面标志⑶3+⑶4+⑶45RA+CD27+代表辅 助初始T细胞；细胞表面标志⑶3+CD4+⑶45RA+CD27_代表辅助耗竭T细胞；细胞表面标志 CD3+CD4+CD45RATD27+代表辅助中心记忆T细胞；细胞表面标志CD3+CD4+CD45RATD27^代表 辅助效应记忆T细胞；细胞表面标志⑶3+⑶8+CD45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；细胞 表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27^代表细胞毒性耗竭T细胞；细胞表面标志CD8+CD45RATD27+ 代表细胞毒性中心记忆T细胞；细胞表面标志⑶3+CD8+⑶45RATD27_代表细胞毒性效应记 忆T细胞。实验结果证实，本发明设计获得了最优的细胞表面标志的抗体组合，通过流式细 胞术，实现了对T淋巴细胞进行更加全面的免疫分型和定量分析。在本发明的另外一些实 施例中，本发明提供的方法，所需待测样品少、操作简单、所需时间短。在本发明的另外一些 实施例中，本发明提供的方法重复性好、准确性高、可广泛应用于T淋巴细胞亚群免疫分型 和定量分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0118] 图1示实施例1中淋巴细胞分类结果；
[0119] 图2示实施例1中T淋巴细胞分型结果；其中，图2-A、图2-B示TCRa P +双阴性 T细胞的细胞分型结果；图2-C示Y S T细胞的细胞分型结果；图2-D示辅助T细胞亚类的 细胞分型结果；图2-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
[0120] 图3示实施例1中B淋巴细胞分型结果；
[0121] 图4示实施例2中淋巴细胞分类结果；
[0122] 图5示实施例2中T淋巴细胞分型结果；其中，图5-A、图5-B示TCRa f双阴性 T细胞的细胞分型结果；图5-C示Y S T细胞的细胞分型结果；图5-D示辅助T细胞亚类的 细胞分型结果；图5-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
[0123] 图6示实施例2中B淋巴细胞分型结果；
[0124] 图7示实施例3中淋巴细胞分类结果；
[0125] 图8示实施例3中T淋巴细胞分型结果；其中，图8-A、图8-B示TCRa f双阴性 T细胞的细胞分型结果；图8-C示Y S T细胞的细胞分型结果；图8-D示辅助T细胞亚类的 细胞分型结果；图8-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
[0126] 图9示实施例3中B淋巴细胞分型结果；
[0127] 图10示实施例4中淋巴细胞分类结果；
[0128] 图11示实施例4中T淋巴细胞分型结果；其中，图11-A、图Il-B示TCRa f双阴 性T细胞的细胞分型结果；图Il-C示Y S T细胞的细胞分型结果；图Il-D示辅助T细胞亚 类的细胞分型结果；图Il-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
[0129] 图12示对比例中⑶45R0和CCR7相组合时，所得的流式图。
【具体实施方式】
[0130] 本发明公开了一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本领域技术人员可以参 考本文内容，实施该方法，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经 通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0131] 本发明提供的一种T淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒中所用到的试剂和原料 均可由市场购得。
[0132] 本发明中用到的荧光标记 Percp、FITC、PE、APC、BV421、Percp_cy5. 5、BV510、 PE-Cy7、BV450均为常见的荧光标记可以由市场购得，各个荧光标记的抗体也可以由市场购 得。
[0133] 为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施 例，进一步阐述本发明：
[0134] 实施例1淋巴细胞精细免疫分型和定量分析
[0135] 实验材料：
[0136] 待测样品：抗凝外周血样品，来源于健康志愿者，为正常人的外周血。
[0137] BD Biosciences淋巴细胞分类试剂盒（cat340503)，购买于BD biosciences，其中 混合抗体1包括：突光标记Percp的抗⑶45抗体、抗⑶3 (FITC)的抗体、抗⑶4 (APC)的抗 体、抗CD8 (PE)的抗体；混合抗体2包括：突光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD19 (APC)的 抗体、抗CD56和CD16 (PE)的抗体、抗CD3 (FITC)的抗体。BD临床试剂盒自带的红细胞裂解 液。
[0138] 自配的红细胞裂解液：每IL红细胞裂解液中含NH4C18. 29g、KHC03 lg，EDTAO. 37g。
[0139] 实验方法：
[0140] 取500 ii L抗凝外周血样品，取200 ii L待测样品，通过血细胞计数仪测得淋巴细胞 绝对数，得淋巴细胞的绝对数为4. 22 X IO9个/L。
[0141] 剩下300 UL用于检测淋巴细胞各亚群，进行淋巴细胞免疫分型和定量分析。
[0142] 淋巴细胞分类
[0143] 1、取两根流式管，分别标记为L-l、L-2,将BD Biosciences淋巴细胞分类试剂盒 (cat340503)中两种混合抗体分别加入到对应的流式管中，其中混合抗体1加入到L-I号流 式管中；混合抗体2分别加入对L-2号流式管中。
[0144] 2、向L-l、L-2号流式管中，各加入50iiL待测样品，充分涡旋，室温（25°C )避光 孵育30min ;
[0145] 3、用试剂盒中IXBD红细胞裂解液裂解红细胞，5min ;
[0146] 4、加入 ImL PBS 洗涤一次后（3500rpm/min，2min)，加入 200iiL PBS 流式上机，并 分析结果。
[0147] T淋巴细胞精细免疫分型
[0148] 1、取两根流式管，分别标记为T-l、T-2,其中T-I为对照组和同型对照组，T-2为待 检测组；按照表1向各个流式管中加入以下抗体：
[0149] 表1各个流式管中加入的抗体的类别和加入的体积
[0150]
【权利要求】
1. 一种T淋巴细胞免疫分型的方法，其特征在于，包括： 取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数 据，分析所述检测数据； 所述抗体包括： 抗TCRa 0的抗体、抗TCRy S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗体、 抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体； 所述分析的方法包括： 细胞表面标志⑶3+TCR a 0 +⑶4TD8_代表TCR a 0 +双阴性T细胞； 细胞表面标志⑶3+TCR y S +代表Y S T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27+代表辅助初始T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD4+⑶45RA+⑶27_代表辅助耗竭T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD4+⑶45RATD27+代表辅助中心记忆T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD4+⑶45RATD27_代表辅助效应记忆T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD8+⑶45RA+⑶27+代表细胞毒性初始T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD8+⑶45RA+⑶27_代表细胞毒性耗竭T细胞； 细胞表面标志⑶8+CD45RATD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞； 细胞表面标志⑶3+CD8+⑶45RATD27_代表细胞毒性效应记忆T细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括统计所述待测样品中T淋巴细胞数 目的步骤，包括： 检测所述待测样品中淋巴细胞的总数； 检测所述待测样品中T淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比； 通过计算，即得所述待测样品中T淋巴细胞的数目。
3. -种淋巴细胞免疫分型的方法，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的T淋巴 细胞免疫分型的步骤。
4. 一种用于T淋巴细胞免疫分型的试剂盒，其特征在于，包括如下不同的荧光标记的 抗体： 抗TCRa 0的抗体、抗TCRy S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗体、 抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗TCR a 0的抗体的荧光标记为 PE〇
6. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗TCRy S的抗体的荧光标记 为 BV421 或 FITC。
7. 根据权利要求4至6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD3的抗体的荧光 标记为 Percp_cy5. 5 或 Pacific blue。
8. 根据权利要求4至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD4的抗体的荧光 标记为FITC或APC-Cy7。
9. 根据权利要求4至8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD8的抗体的荧光 标记为BV510。
10. -种用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒，其特征在于，其包括如下不同的荧光标记的 抗体： 抗TCR a 0的抗体、抗TCRy S的抗体、抗⑶3的抗体、抗⑶4的抗体、抗⑶8的抗体、 抗⑶27的抗体和抗⑶45RA抗体。
【文档编号】G01N33/53GK104360049SQ201410486072
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】赵晓东, 周丽娜 申请人:重庆医科大学附属儿童医院