谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于水稻分子育种技术领域，更具体地，本发明涉及一种谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm的分子标记及其应用。

背景技术：

稻瘟病是全球范围内水稻生产的三大主要病害之一，培育抗病品种是防治稻瘟病危害最经济有效的手段。传统的水稻抗病育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。通过分子标记辅助选择抗病基因则不受上述不利因素影响，是培育抗病品种的有效途径之一。

谷梅4号是一个地方性品种，具有广谱而持久的稻瘟病抗性，其抗病主效基因Pigm(t)(以下简写为Pigm)定位于第6染色体分子标记C5483和C0428之间约70kb的范围内(论文出处：Theor Appl Genet，2006，113：705-713)。但是文献中公布的分子标记大多为CAPS标记，操作复杂且代价较高，不适合分子标记辅助选择，其余SSR和InDel标记主要是用于遗传定位的，在育种中存在多态率较低，差异较小的缺点。潘存红等开发了(专利申请：CN 103497996A)用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm的分子标记InDel587，但是仍存在约15％的受体亲本(特别是籼型亲本比例更高)与谷梅4号无多态，标记距离目标区间较远(65.2kb)两个缺陷。

另外，现有研究已证实谷梅4号抗病主效Pigm位于Piz座位上。Piz座位上已发现了Pi2、Pi9、Pi-zt、Piz、Pi40、Pigm等复等位基因，但是各自的基因序列及抗谱存在一定差异，要实现对Pigm的利用就需要将Pigm与其它不同复等位基因区分开来，从而实现将Pigm特异地转育至受体品种之中。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的标记特异性不足及与目标基因连锁不紧密的问题，本发明的目的之一是提供谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm的分子标记，本发明的目的之二是提供用于检测所述分子标记的引物，本发明的目的之三是提供所述分子标记的应用。

技术方案：本发明所述的谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm的分子标记，包括分子标记Pigm-4，所述的分子标记Pigm-4为包含位于水稻基因组第6号染色体10436119bp～10436192bp处(位于AP005659之中)的DNA片段，谷梅4号此段碱基缺失。本发明在描述基因组碱基位置时，是以水稻日本晴基因组为基准。

所述的分子标记Pigm-4的片段长度为150～500bp。该片段长度有利于采用电泳的方法进行识别检测，电泳方法简单易行，成本低。当然，上述的分子标记Pigm-4的片段长度并非是必须的，当采用其他检测方法如测序等，则不受上述长度的限制。

进一步的，所述的分子标记Pigm-4为包含如SEQ ID NO.1所示序列的DNA片段。进一步的，所述的分子标记Pigm-4的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述的分子标记，还包括与所述分标记Pigm-4配合使用的分子标记Pigm-2，所述的分子标记Pigm-2为包含位于水稻基因组第6号染色体10366681bp～10366821bp处的DNA片段。进一步的，所述的分子标记Pigm-2为位于水稻基因组第6号染色体10366681bp～10366821bp处的DNA片段。

Pigm-4可以区分Pigm基因的抗感差异，因其与目标基因还存在一定的遗传距离，单个标记的筛选正确率达到99.01％(而不是100％)，而Pigm-4与Pigm-2两个标记配合使用时则完全包含了Pigm所在的整个片段，筛选的正确率达到100％。

本发明还提供了一种扩增引物，引物为Pigm-4引物对或/和Pigm-2引物对，其中Pigm-4引物对的上、下游引物分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，Pigm-2引物对的上、下游引物分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了所述的分子标记在分子标记辅助选择抗稻瘟病水稻育种中的应用。

所述的应用包括：将抗稻瘟病基因Pigm转入受体亲本，利用所述的分子标记选择含抗病基因Pigm的水稻材料。

其中，利用所述的分子标记选择水稻材料时，采用Pigm-4引物对或/和Pigm-2引物对进行扩增，其中Pigm-4引物对的上、下游引物分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，Pigm-2引物对的上、下游引物分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了所述的分子标记在通过分子标记辅助选择的方法提高水稻的抗稻瘟病侵染能力中的应用。所述的应用包括：将抗稻瘟病基因Pigm转入受体亲本，利用所述的分子标记选择含抗病基因Pigm的水稻材料。其中，利用所述的分子标记选择水稻材料时，可采用上述的Pigm-4引物对或/和Pigm-2引物对进行扩增。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过对抗稻瘟病基因Pigm(t)供体品种谷梅4号基因组相应区段分段测序的方式，发现了紧邻Pigm(t)基因的谷梅4号特异DNA序列，并根据谷梅4号特异序列与公知亲本的差异设计、验证了特异性分子标记Pigm-4。

本发明筛选获得的特异分子标记与谷梅4号广谱抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁，Pigm-4与目标区段的距离仅为14kb。

本发明筛选获得了基于谷梅4号基因组特异的分子标记，可100％区分谷梅4号(或以其作为供体转导了特异序列的目标品系)与其它品种。

本发明分子标记Pigm-4可以区分Pigm基因的抗感差异，单个标记的筛选正确率达到99.01％，而配合基因上游区的备选分子标记Pigm-2可使筛选的正确率达到100％。

本发明所转导的Pigm基因具有广谱抗稻瘟病特性，通过分子标记辅助选择，将Pigm(t)导入受体水稻品种，可显著提升水稻品种的抗稻瘟病抗性。

附图说明

图1为SEQ ID NO：1序列与相关公知亲本相应区段内的部分序列比对结果；其中品种代码1为：谷梅4号(GM4，含Pigm)，2为：9311(籼稻对照)，3为：IR65482(含Pi40)，4为：Fukunishiki(含Piz)，5为：Nipponbare(粳稻对照，日本晴)，6为：C101LA51(含Pi2)，7为：75-1-127(含Pi9)，8为：Toride 1(含Pi-zt)。

图2为Pigm相关检测标记Pigm-2、Pigm-4及Indel587在BAC克隆AP005659目标区段的位置示意图(AP005659全长138870bp)。

图3为特异性标记Pigm-4检测各亲本材料的电泳图；其中1号泳道为Marker(型号：100bp-ⅠDNA ladder，购自上海捷瑞生物科技有限公司)，2-19号泳道分别为：谷梅4号、IR65482、C101LA51、75-1-127、Toride 1、Fukunishiki、谷梅4号/武运2674纯系、9311、镇恢82、镇恢832、成恢177、成恢727、秀水519、武运2674、武运粳27号、镇稻88、镇稻18号、镇糯19号；泳道号从左至右依次为1到19。

图4为标记Pigm-4检测武运2674//武运2674/谷梅4号杂交后代部分单株的电泳图(BC1F2)；其中1和5号泳道为Marker，2号泳道为抗病对照谷梅4号，3号泳道为感病对照武运2674，其余泳道为群体内单株；泳道号从左至右依次为1到33。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1 谷梅4号特异基因组序列标记Pigm-4的获得与验证

1 试验材料

本研究所用的水稻材料包括Pi9、Pi2、Piz、Pi-zt、Pi40的供体品种的基因组DNA：75-1-127、C101A51、Toride 1、Fukunishiki、IR65482，及Pigm的供体谷梅4号；受体品种粳稻新品系武运2674、籼稻受体品种镇恢82、常规粳稻品种以及典型的杂交稻保持系、恢复系250份(9311、日本晴、中花11、秀水519、龙粳41、连粳4号、连粳6号、连粳7号、连粳11号、连粳9号、连粳10号、徐稻3号、华粳3号、华粳4号、华粳5号、华粳6号、华粳7号、淮稻5号、淮稻6号、淮稻7号、淮稻8号、淮稻9号、淮稻10号、淮稻11号、淮糯12号、淮稻13号、淮优粳2号、盐稻6号、盐稻8号、盐稻9号、盐稻11号、盐粳9号、盐粳10号、盐粳11号、扬育粳2号、扬农稻1号、武陵粳1号、扬辐粳7号、扬辐粳8号、扬粳4038、扬粳4227、宁粳1号、宁粳2号、宁粳3号、宁粳4号、宁粳5号、南粳49、南粳38、南粳40、南粳41、南粳42、南粳43、南粳44、南粳45、南粳46、南粳47、南粳5055、苏沪香粳、通粳981、武粳4号、武粳13号、武粳15号、武育粳3号、武香粳1号、武香粳9号、武香粳14号、武育粳18号、武育粳20号、武运粳7号、武运粳11号、武运粳19号、武运粳21号、武运粳23号、武运粳24号、武运粳27号、武运粳29号、常农粳3号、常农粳4号、常农粳5号、常农粳6号、常农粳7号、苏粳8号、苏香粳2号、嘉33、嘉991、镇稻88、镇稻99、镇稻7号、镇稻8号、镇稻10号、镇稻11号、镇稻12号、镇稻13号、镇稻14号、镇稻15号、镇稻16号、镇稻17号、镇稻18号、镇糯19号、皖恢057、蜀恢498、安选6号、宜恢1577、中恢8006、R9308、盐恢559、泸恢17、多系1号、桂恢582、文恢242、航1号、浙恢9516、五山丝苗、明恢63、R6547、明恢86、绵恢577、内香5B、宜恢10号、恩恢58、绵恢725、望恢006、广恢218、华恢451、粤品丝苗2号、亚恢420、测253、南恢11、粤晶丝苗、浙恢501、辐恢728、内香恢1号、湘恢263、成恢177、R7954、远恢2号、成恢727、闽恢3301、明恢100、中恢218、广恢R15、中9B、萍恢9901、昌恢T114、中恢2286、先恢1号、淦恢3号、淦恢319、成恢448、广恢998、浙恢7954、温恢689、成恢209、蜀恢538、嘉恢99、成恢3203、天恢198、乐恢188、成恢19、福恢673、成恢761、成恢425、泸恢3T、成恢9348、宜恢4245、雅恢2115、川恢907、绵恢663、抗65、扬恢136、扬恢507、R6547、扬恢818、抗98、华占、镇恢084、广恢128、云恢310、镇恢41、成恢210、蜀恢527、镇恢62、镇恢46、川恢047、福恢7185、云恢68、云恢23、锦恢907、云恢26、云恢808、云恢40、昌恢121、内恢182、明恢62、内恢3105、双抗明占、早恢66、中组14、成恢157、苏恢728、苏恢118、镇恢10003、D3745、宁恢广抗占、镇恢100、绵恢146、湘R702、丙4114、泸恢602、绵恢3724、珍珠糯、R9368、柳丰香占、华润2号、R476、R900、R6326、蜀恢498、绵恢523、绵恢662、成恢178、广恢116、广恢290、广恢710、广恢138、汕恢721、广恢122、广恢169、广恢428、明恢70、明恢2088、明恢1259、紫恢100、旱恢10号、贵恢2190、贵恢5832、贵恢168、红恢98、先恢207、早恢89、早恢90、明恢69、明恢70、金恢161、川广恢909、镇恢832、镇籼1B、Y58S、广占63S)；其中Pi9、Pi2、Piz、Pi-zt、Pi40的供体品种DNA由江苏里下河地区农业科学研究所提供，其他稻种材料由本单位收集。

供体品种DNA由水稻叶片采用SDS法提取得到。

2 试验方法

2.1 序列测定与标记开发

根据Deng等(Yiwen Deng,Xudong Zhu,Ying Shen,Zuhua He.Genetic characterization and Fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t)tightly linked to Pi2and Pi9in a broad-spectrum resistant Chinese variety.Theor Appl Genet,2006,113:705–713.)的定位结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上获取水稻品种日本晴相应区段的DNA序列(位于日本晴基因组第6号染色体10360000-10440000bp)，利用软件Primer 5软件相对均匀分布(每隔8kb左右)地设计10对片段长度预计产物在500-1200bp的扩增标记。分别以谷梅4号和日本晴、9311为模板扩增、产物测序比对，再根据比对结果开发特异性分子标记。

2.2 检测步骤

步骤一、DNA提取(SDS法)：

1、将2cm长的叶片剪碎置2ml的离心管中，加上钢珠，然后放入装液氮的保温瓶中速冻，快速捞取放在48孔模具上，盖好盖子置于磨样机上震动30s，取下离心管，倒出钢珠。

2、在含有液氮磨碎的叶片的2ml离心管中，加入SDS(0.1M Tris-Hcl,PH 8.0；0.025M EDTA,PH 8.0；29.25g/L Nacl；12g/L SDS)600μl，放置65℃水浴锅中，30min。

3、加入150μl KAc(PH 4.8)，放置-20℃冰箱，30min。

4、加入与SDS等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)溶液，放置振荡器

充分摇匀，20min。

5、离心，12000rpm，4min，转移200μl上清液置1.5ml离心管中。

6、在上清液中加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃冰箱，20min。

7、离心，12000rpm，4min，弃上清，风干，加入200μl ddH₂O溶解，此为DNA母液。

8、将母液稀释10倍即为DNA工作液。

9、取1.5μl用于PCR扩增反应。

步骤二、PCR扩增：

PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

1、反应体系如下：

总体积：10μl。DNA 1.5μl，2mM SEQ ID NO：1上游引物0.5μl，2mM SEQ ID NO：2下游引物0.5μl，10×Taq Buffer(GENERAY，捷瑞公司)1.2μl，1mM dNTP0.3μl，1000U Taq DNA聚合酶(GENERAY)0.1μl，加ddH₂O补足至10μl。

2、PCR的扩增程序如下：

步骤三、PCR产物检测与测序：

用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，取扩增好的PCR产物2μl，以DNA Marker(100bp-ⅠDNA ladder)作为分子量对照，在240V恒压下电泳1小时。银染显示DNA条带，通过比对DNA Marker找到目标条带，对于需要测序的产物，将含有目的条带的剩余扩增产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证；对于目标基因的检测，则根据片段大小判断抗感基因型。

3试验结果

根据测序结果我们在第4对产物中发现谷梅4号具有与籼稻9311及粳稻日本晴均有显著的DNA序列差异，表现在与粳稻日本晴相比，谷梅4号缺失74个碱基(bp)，缺失位置位于日本晴水稻基因组第6号染色体10436119bp～10436192bp处，而与9311相比缺失了45bp(图1)。根据此差异，我们设计了特异性标记Pigm-4，其引物序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，用Pigm-4分析供试材料，发现在总共250份材料中仅有谷梅4号可以扩增出缺失74bp的特异性条带，从而验证了Pigm-4为谷梅4号基因组所特异的标记(图3)，且与InDel587相比，Pigm-4与目标区段的距离仅为14kb，连锁更紧密(图2)。

表1 用于检测筛选Pigm的PCR标记

之后根据已知的籼粳序列差异利用通用方法设计得到Pigm的上游标记Pigm-2(位置位于日本晴水稻基因组第6号染色体10366681bp～10366821bp)，Pigm-2扩增供体谷梅4号与受体亲本武2674、镇恢82、镇稻18号，发现供体与3份受体材料之间均存在多态性，可以用于进一步的分子标记辅助选择。

实施例2 利用基因组特异标记Pigm-4和上游标记Pigm-2转导Pigm(t)基因，培育广谱抗稻瘟水稻新品种

本实施例的试验材料与试验方法大体同实施例1，所用供体品种为谷梅4号，受体品种为武运2674(一个参加了江苏省水稻区试但是因稻瘟病不达标而被淘汰的新品系，也称武2674，本领域技术人员可通过常规途径获得，另外，受体品种并不仅限于武2674)、镇恢82，检测标记为两翼标记Pigm-2和Pigm-4，稻瘟病接种鉴定和评判的方法参照Deng、Wu等的文献(Yiwen Deng,Xudong Zhu,Ying Shen,Zuhua He.Genetic characterization and Fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t)tightly linked to Pi2and Pi9in a broad-spectrum resistant Chinese variety.Theor Appl Genet,2006,113:705–713.

Yunyu Wu,Ling Yu,Cunhong Pan,Zhengyuan Dai,Yuhong Li,Ning Xiao,Xiaoxiang Zhang,Hongjuan Ji,Niansheng Huang,Buhong Zhao,Changhai Zhou,Guangqing Liu,Xiaojing Liu,Xuebiao Pan,Chengzhi Liang,Aihong Li.Development of near-isogenic lines with different alleles of Piz locus and analysis of their breeding effect under Yangdao 6background.Mol Breeding,2016,36:1-12(online).)。

对武运2674//武运2674/谷梅4号衍生的BC1F2共计652个单株进行检测，发现Pigm-2标记携带Pigm/Pigm(即AA型)、Pigm/pigm(即Aa型)、pigm/pigm(即aa型)的个体分别是165:330:157株，而Pigm-4标记有Pigm/Pigm(即AA型)、Pigm/pigm(即Aa型)、pigm/pigm(即aa型)的个体分别是162:330:160株，均符合统计学意义的1:2:1的比例，但是有6个交换单株(即两个标记基因型不一致的单株)，之后我们对随机选取的102个单株进行接种鉴定，发现在AA及Aa的总共75个体中有73个个体表现为抗稻瘟病，2个个体表现为感病，且这2个感病单株正是6的交换单株中的2个(一个为Pigm-2为Aa型，而Pigm-4为aa型；另一个为为Pigm-2为aa型，而Pigm-4为Aa型)，而两个标记均为aa型的27个个体均表现为感病(图4)。

利用上述两个标记对镇恢82//镇恢82/谷梅4号衍生的BC1F1共计24个单株进行检测，Pigm/pigm(即Aa型)、pigm/pigm(即aa型)的个体分别是13:11株，没有发现交换单株，符合统计学意义的1:1的比例，我们对13个杂合体(即Aa型)单株进行接种鉴定所有个体均表现为抗病。

通过实施例2可以看出：Pigm可以显著提升水稻品种的抗稻瘟病特性，Pigm-4可以区分Pigm基因的抗感差异，单个标记的筛选正确率达到99.01％，而Pigm-4与Pigm-2两个标记配合使用时筛选的正确率达到100％。