本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法。
背景技术：
保健类眼贴是指将中药材提取物等有效成分用辅助材料(如棉布、绸、锦、无纺布等)吸收，贴敷于眼部或眼部周围，让有效成分通过局部吸收以改善、缓解眼部疲劳等不适症状的一种产品。霉菌和酵母菌广泛存在于自然界中，酵母菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，眼贴制剂的液体环境为霉菌和酵母菌的繁殖生长提供了有利条件。霉菌和酵母菌属真菌门，很多真菌能产生毒素，使用了污染变质的保健眼贴对人体皮肤、健康造成严重损害。
《db61陕西省地方标准保健用品微生物限度检查》中对于眼贴类保健用品的霉菌和酵母菌检验指标的标准规定是每1g、1ml或10cm2不得检出，而在具体的测定方法中却只有霉菌和酵母菌数测定的定量方法，未给出定性检测方法，对于眼贴制剂的霉菌和酵母菌数测定结果不能得出“未检出”的结果。
查阅多方资料，针对保健用品霉菌和酵母菌数测定，目前国家标准和地方标准中尚未有标准的定性检测方法。眼贴类保健用品的霉菌和酵母菌数的定性检查一直是企业困扰的问题，多数企业参照《中国药典》药品的无菌检查法对眼贴制剂进行检查。但是，无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。要求按照药品gmp规范控制生产过程，生产过程及其环境对微生物控制极其严格，最终使产品能够满足无菌指标的要求，而保健用品为非无菌产品，原辅料、生产环境及其产品都无法满足无菌指标的要求，从实际产品的生产及控制情况分析，眼贴类保健用品并不适用无菌检查法进行检测。无菌检查法中使用的培养基为胰酪大豆胨液体培养基，不能排除细菌造成的干扰，易造成假阳性的现象。且无菌检查法检验周期为14天，周期长，产品从生产、检验到放行出厂周期较长，给企业的存储、运输及生产效率带来了困扰。因此，本领域急需建立一种对于眼贴剂中霉菌和酵母菌数检查的定性检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种新的眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法。
本发明提供的眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法，包括以下步骤：
(1)称取眼贴供试品适量，加入适量体积稀释液，混匀，制成1:10(g/g)供试液；
(2)取适量体积的上述供试液，加入适量体积的霉菌液体培养基，于28℃±1℃增菌培养48h～72h，得到匀液；
(3)取上述匀液适量，分别涂布于至少1块孟加拉红琼脂平板和至少1块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上，静置，然后于28℃±1℃培养3～5天；
(4)结果判断：若孟加拉红琼脂平板和氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上均无菌落生长或有菌落生长但未见疑似菌落则判定为未检出；若孟加拉红琼脂平板和氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上有任何一块平板确认有酵母菌或霉菌生长，则判定该样品检出目标菌。
优选地，本发明提供的眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法，具体包括以下步骤：
(1)称取眼贴供试品10g，加入90ml稀释液，混匀，制成1:10(g/g)供试液；
(2)取上述供试液10ml，加入90ml霉菌液体培养基，于28℃±1℃增菌培养48h～72h，得到匀液；
(3)取上述匀液2ml，以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种量分别涂布于3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上，静置，然后于28℃±1℃培养3～5天；
(4)结果判断：若3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上均无菌落生长或有菌落生长但未见疑似菌落则判定为未检出；若3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上有任何一块平板确认有酵母菌或霉菌生长，则判定该样品检出目标菌。
优选地，步骤(1)中，所述稀释液是0.9％无菌氯化钠溶液。
优选地，步骤(3)中，在所述涂布前，将匀液充分混匀。这是由于霉菌在液体培养基中以菌丝存在，呈絮状。
更优选地，所述混匀使用涡旋混合器进行。
优选地，步骤(3)中，所述涂布是使用无菌l棒涂布。
优选地，步骤(3)中，所述静置的时间为10min。
优选地，步骤(3)中，所述培养为正置培养。正置培养，可以防止霉菌产的孢子分散到空气中而污染整个培养箱。
优选地，步骤(3)中，所述培养在霉菌培养箱中进行。
优选地，所述霉菌为黑曲霉；所述酵母菌为白色念珠菌。
本发明人发现，在分离平板孟加拉红琼脂平板和氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上，菌落形态典型，形态较大，适宜观察；且抑制细菌的生长，选择性很好。
本发明人还发现，所述霉菌液体培养基对于霉菌和酵母菌的促生长能力优于现有的其他增菌液(例如，tsb增菌液和sdb增菌液)，因此使得结果更加可靠。
本发明人进一步发现，将增菌液(匀液)接种在1块选择性平板上，检出率较低，易造成漏检。选择将增菌液接种在3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上，检出率显著优化。
此外，本发明人发现，采用涂布的方法接种在3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板上进行霉菌和酵母菌的分离，检出率明显优于划线的分离方式。
本发明的眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法具有专属性高、检测限低、重现性好、操作容易等特点。特别地，经过反复试验，阳性检出率高，确认可替代原无菌检查方法，满足生产企业对产品的质量控制，且可达到db61陕西省地方标准保健用品微生物限度检查中对于眼贴类产品霉菌和酵母菌数结果不得检出的标准要求。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。
样品名称：好视力牌中老年眼贴；剂型：眼贴剂；规格：6g/贴；包装：塑料镀铝复合袋。
仪器设备：sww.105卧式矩形压力蒸汽灭菌器，上海华成医用核子仪器公司；bs2202s型电子天平，德国赛多利斯公司；hfsafe-1200lc型生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；sha-c型水浴恒温振荡器，天津鑫博得有限公司；lrh-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；shh-250js霉菌培养箱，重庆四达实验仪器厂；mj-250-11霉菌培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；lrh-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；vitek2全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃有限公司；olympus.ch型三目显微镜，日本奥林巴斯公司；pb-10ph酸度计，赛多利斯科技(北京)有限公司；涡旋混合器，德国ika公司。
培养基及稀释液：胰酪大豆胨液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：160527；沙氏葡萄糖液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：150801；孟加拉红培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：160628；沙氏葡萄糖琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：160612；玉米粉培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：161207；高盐察氏培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：20160923；氯化三苯四氮唑-沙保罗培养基，北京陆桥技术有限责任公司，批号：161009；0.9％无菌氯化钠溶液(氯化钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160926；按药典要求配制、灭菌)。上述配制好的培养基的适用性检查符合《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查：计数检查法(通则1105)要求。霉菌液体培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：20160730；霉菌液体培养基，广东环凯生物科技有限公司，批号：3104619；shh-250js霉菌培养箱，重庆四达实验仪器厂；mj-250-11霉菌培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司。
菌种：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)〔cmcc(b)26003〕、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)〔cmcc(b)10104〕、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)〔cmcc(b)63501〕，白色念珠菌(candidaalbicans)〔cmcc(f)98001〕、黑曲霉(aspergillusniger)〔cmcc(f)98003〕，上述标准菌株均来自中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为第3代。
菌液制备：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，25℃培养3天。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养7天，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗脱孢子，收集孢子悬液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
实施例1：专属性验证
取新鲜制备的不大于100cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉试验菌液，同时接入含菌量大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌混匀。分别对霉菌液体培养基、孟加拉红琼脂培养基、氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂培养基进行促生长能力、抑制能力测试。同时加入样品同上述方法操作，考察样品影响。结果见表1。
表1培养基促生长能力、抑制能力考察结果
由表1可见，目标菌在选择性培养基中生长良好，干扰菌均不生长，且加入样品进行干扰，未对结果产生影响。说明选择性增菌培养基和分离平板促生长能力良好。
实施例2：检测限验证
样品制备：试验组：称取10g样品，加入90ml0.9％无菌氯化钠溶液，混匀，制成1:10(g/g)供试液。同时分别接入含菌量不大于5cfu(g/ml)的白色念珠菌菌液和黑曲霉试验菌液，混匀。菌液对照组：分别接入含菌量不大于5cfu(g/ml)的白色念珠菌菌液和黑曲霉试验菌液至90ml0.9％无菌氯化钠溶液，混匀。样品组：称取10g样品，加入90ml0.9％无菌氯化钠溶液，制成1:10(g/g)供试液。
增菌分离：分别取上述匀液10ml，加入90ml霉菌液体培养基，28℃±1℃培养3天，取匀液2ml，使用涡旋混合器充分混匀，以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种量使用无菌l棒分别涂布分离于3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板，静置10min。于28℃±1℃霉菌培养箱正置培养3天。
试验结果：见表2。其中：试验时间：2017年02月14日；样品批号：20160911；取样量：10.10g；编号：t1。试验时间：2017年02月14日；样品批号：20161014；取样量：10.12g；编号：t2。试验时间：2017年02月14日；样品批号：20161117；取样量：10.05g；编号：t3。试验时间：2017年02月14日；样品批号：20161202；取样量：10.05g；编号：t4。试验时间：2017年02月14日；样品批号：20160918；取样量：10.03g；编号：t5。
表2检测限结果
结果表明：28℃增菌培养3天，涂布分离于孟加拉红琼脂平板和氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板，于28℃霉菌培养箱正置培养3天，结果5批样品的检出率均达到100％。
实施例3：重现性验证
取同一批号的样品，改变实验条件(实验地点、实验人员、仪器、培养基批次)进行试验。同时选取5个批次的样品进行试验。
条件a：910室，hfsafe-1200lc型生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；霉菌液体培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：20160730；孟加拉红琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限公司，批号：160628；氯化三苯四氮唑-沙保罗培养基，北京陆桥技术股份有限公司，批号：161009；
条件b：910室，hfsafe760s型生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；霉菌液体培养基，广东环凯生物科技有限公司，批号：3104619；孟加拉红琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20160902；氯化三苯四氮唑-沙保罗培养基，北京陆桥技术股份有限公司，批号：161009。
样品制备：试验组：称取10g样品，加入90ml0.9％无菌氯化钠溶液，混匀，制成1:10(g/g)供试液。同时分别接入含菌量不大于50cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉试验菌液，混匀。菌液对照组：分别接入含菌量不大于50cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉试验菌液至90ml0.9％无菌氯化钠溶液，混匀。样品组：称取10g样品，加入90ml0.9％无菌氯化钠溶液，制成1:10(g/g)供试液。
增菌分离：分别取上述匀液10ml，加入90ml霉菌液体培养基，28℃±1℃培养3天，取匀液2ml，使用涡旋混合器充分混匀，以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种量使用无菌l棒分别涂布分离于3块孟加拉红琼脂平板和3块氯化三苯四氮唑-沙保罗琼脂平板，静置10min。于28℃±1℃霉菌培养箱正置培养3天。
试验结果：见表3。
表3重现性结果
结果显示：采用条件a和条件b分别对5批产品进行重现性检查，结果表明各批次的检出率均为100％，重现性良好。
以上实验说明，本发明的眼贴中霉菌和酵母菌的定性检测方法具有专属性高、检测限低、重现性好、操作容易等特点，完全可以满足生产企业对产品的质量控制要求。