本发明涉及食品生物技术领域。更具体地，涉及一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法。
背景技术：
由于水生生物的生长环境与陆地上生物的生长环境有很大的区别，因此鱼类蛋白质的氨基酸序列、结构和功能与陆地生物蛋白质有比较大的区别，尽管当前利用蛋白酶解技术制备生物活性肽的蛋白质主要源自陆地生物，而对于鱼类蛋白的酶解利用较少，但是由于鱼类蛋白的氨基酸序列、结构和功能和陆地生物的区别较大，所以可能会获得生物活性更加优异的活性肽。而且，海洋占据了整个地球75％，无论是在种类还是在数量，海洋中的蛋白资源都远远超过陆地生物，并且未得到很好的开发。
随着中国水产品总体产量的不断提高，产生大量的水产品加工下脚料，目前因为企业缺乏有效的技术手段，对富含蛋白质的水产品加工副产物利用很少，这不仅造成资源的浪费，同时也对海洋和陆地环境造成污染。因此，对水产品加工下脚料进行综合开发利用，变废为宝，生产出各种农业、医药、食品等行业所需的新产品，将大大降低主导产品的成本，产生很好的经济、生态和社会效益。
传统观点认为，蛋白质吸收是以蛋白质水解成为游离氨基酸后才被吸收利用；但是最近的研究发现，蛋白质在人类消化道内，经过多重酶水解，不仅会以氨基酸的形式进行吸收，同时还会以小肽的形式吸收，并且发现小肽的吸收速度比同一组成的氨基酸的吸收速度还要快。生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，是一类相对分子质量小于6000da、具有多种生物学功能的多肽。生物活性肽在消化道内不会被各种消化酶再水解，而是直接被小肠上皮细胞吸收，进入人体的循环系统，并且吸收速度快，可以很快发挥作用。总而言之，生物活性肽相比较于蛋白质还有氨基酸，具有直接吸收、完全吸收、自主吸收等优点，具有很高的利用价值。
因此，提供一种利用蓝圆鲹加工副产物高效制备生物活性肽方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法，实现蓝圆鲹加工副产物的高值化利用。
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法得到的生物活性肽的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：测定蓝圆鲹加工副产物中粗蛋白含量，并将蓝圆鲹加工副产物搅碎；
(2)胰蛋白酶水解：按粗蛋白含量加入胰蛋白酶酶解，具体工艺条件为：料水比1:15，酶添加量7000～8000u/g，温度50～60℃，ph7～8，反应时间4～5h；
(3)酶解液分离：取酶解产物，离心，取上清酶解液，采用截留分子量为3000da的超滤膜分离机分离，得到超滤液；
(4)干燥：将超滤液进行干燥，即得。
优选的，步骤(2)中，胰蛋白酶水解的具体工艺条件为：料水比1:15，酶添加量7450.54u/g，温度为54.48℃，ph7.12，反应时间4h；
优选的，所述蓝圆鲹加工副产物可以为蓝圆鲹鱼头、鱼尾、鱼内脏。
优选的，所述离心为15℃、6000r/min离心20min。
优选的，所述超滤膜分离的工作压力0.15mpa。
优选的，步骤(4)所述超滤液45℃旋转蒸发浓缩3-4倍后再进行干燥。
优选的，所述干燥为冷冻干燥，时间为18-20h。
本发明还提供了上述制备方法得到的生物活性肽在抗氧化上和抑制ace活性上的应用。
本发明以蓝圆鲹加工副产物(鱼头、鱼尾、鱼内脏等)为原料，只利用一种胰蛋白酶水解，并结合滤膜分离技术就得到了大量分子量小于3000da的抗氧化和ace抑制活性强的生物活性肽产品，其含量占酶解产物的67％。
本发明的有益效果如下：
本发明以蓝圆鲹加工副产物(鱼头、鱼尾、鱼内脏等)为原料，利用胰蛋白酶一步水解制备得到的活性肽安全性高、无副作用，变废为宝，不仅实现了水产品加工下脚料的高值化利用，而且能够减少环境污染，产生很好的经济、生态和社会效益。另外，本发明方法所需设备简单，易操作，成本低，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解过程易于控制，便于工业化推广应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出酶解产物的高效液相色谱分析。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法
一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：经测定蓝圆鲹加工副产物固形物的含量为39.4％，灰分为1.20％，总糖为2.12％，脂肪含量为0.05％，粗蛋白含量为8.17％，并将蓝圆鲹加工副产物搅碎；
(2)胰蛋白酶水解：按粗蛋白含量加入胰蛋白酶酶解，具体工艺条件为：料水比1:15，酶添加量7000u/g，温度50℃，ph7，反应时间4h；
(3)酶解液分离：取酶解产物15℃、6000r/min离心20min，取上清酶解液，采用截留分子量为3000da的超滤膜分离机(工作压力0.15mpa)分离，得到超滤液；
(4)干燥：将超滤液45℃旋转蒸发浓缩3倍后进行冷冻干燥18-20h，即得。
实施例2一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法
一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：经测定蓝圆鲹加工副产物固形物的含量为39.4％，灰分为1.20％，总糖为2.12％，脂肪含量为0.05％，粗蛋白含量为8.17％，并将蓝圆鲹加工副产物搅碎；
(2)胰蛋白酶水解：按粗蛋白含量加入胰蛋白酶酶解，具体工艺条件为：料水比1:15，酶添加量7450.54u/g，温度54.48℃，ph7.12，反应时间4h；
(3)酶解液分离：取酶解产物15℃、6000r/min离心20min，取上清酶解液，采用截留分子量为3000da的超滤膜分离机(工作压力0.15mpa)分离，得到超滤液；
(4)干燥：将超滤液45℃旋转蒸发浓缩4倍后进行冷冻干燥20h，即得。
实施例3一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法
一种利用蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：经测定蓝圆鲹加工副产物固形物的含量为39.4％，灰分为1.20％，总糖为2.12％，脂肪含量为0.05％，粗蛋白含量为8.17％，并将蓝圆鲹加工副产物搅碎；
(2)胰蛋白酶水解：按粗蛋白含量加入胰蛋白酶酶解，具体工艺条件为：料水比1:15，酶添加量8000u/g，温度60℃，ph8，反应时间5h；
(3)酶解液分离：取酶解产物15℃、6000r/min离心20min，取上清酶解液，采用截留分子量为3000da的超滤膜分离机(工作压力0.15mpa)分离，得到超滤液；
(4)干燥：将超滤液45℃旋转蒸发浓缩3倍后进行冷冻干燥19h，即得。
试验例1蓝圆鲹加工副产物酶解制备生物活性肽中水解酶的选择
1、试验方法
1.1蓝圆鲹加工副产物基本组成成分分析
经检测：蓝圆鲹加工副产物固形物的含量为39.4％，灰分为1.20％，总糖为2.12％，脂肪含量为0.05％，粗蛋白含量为8.17％。结合sds-page分析，蛋白质分子量一般大于45kda.
1.2蓝圆鲹加工副产物处理
采用绞肉机(tf-120)将蓝圆鲹加工副产物鱼头、鱼尾、鱼内脏等搅碎，按粗蛋白含量分别加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶水解。其中，各蛋白酶的工艺参数为：胰蛋白酶和碱性蛋白酶的料水比1:15，酶添加量7000u/g粗蛋白，温度50℃，ph7，反应时间5h；菠萝蛋白酶的料水比1:15，酶添加量7000u/g粗蛋白，温度50℃，ph5，反应时间5h。
2、试验结果
以羟自由基抑制率为指标，比较不同水解酶对酶解产物活性的影响，结果见表1。从表中可以看出胰蛋白酶能明显提高活性肽的抗氧化活性。
表1不同水解酶对活性肽的羟自由基抑制率的影响
试验例2胰蛋白酶酶解工艺条件的建立
1、试验方法
1.1蓝圆鲹加工副产物基本组成成分分析
经检测：蓝圆鲹加工副产物固形物的含量为39.4％，灰分为1.20％，总糖为2.12％，脂肪含量为0.05％，粗蛋白含量为8.17％。结合sds-page分析，蛋白质分子量一般大于45kda.
1.2蓝圆鲹加工副产物酶解工艺条件
采用绞肉机(tf-120)将蓝圆鲹加工副产物鱼头、鱼尾、鱼内脏等搅碎，按粗蛋白含量加入胰蛋白酶水解。
2、试验结果
以羟自由基抑制率为指标，采用响应曲面实验设计(表2)，试验结果如表3所示。
表2响应曲面实验因素水平
表3响应曲面试验方案以及结果
利用design-expert8.0软件对试验数据进行二次多项回归拟合，得到二次多项式回归方程：
y＝－7.41145+0.083396x1+1.30924x2+1.74258×10-4x3－1.044×10-3x1x2+1.2425×10-6x1x3+2.155×10-5x2x3－7.766×10-4x12－0.09884x22－2.6705×10-8x32
方差分析表明回归方程拟合性好，各因素的影响程度分别为：酶添加量＞温度＞ph；利用已建立的数学模型在实验范围内进行优化，最优条件为：反应温度为54.48℃，反应ph7.12，酶添加量为7450.54u/g，反应时间4h，在此条件下羟自由基抑制率平均值为19.83％.
试验例3酶解产物分子量分布
使用tsk-gelg3000sw色谱柱对酶解产物进行分子量大小分析，结果如图1、表4所示，其中分子量＜3000da的组分占水解产物的67％；可见，利用该方法经过一步酶解就可将分子量大于45kda的蛋白水解成大量小分子短肽。
表4酶解产物高效液相色谱分析结果
试验例4不同分子量酶解产物的分离和抗氧化活性研究
取蓝圆鲹加工副产物(鱼头、鱼尾、鱼内脏等)酶解液，采用截留分子量(10000da，3000da)的滤膜分离实验机(cbona-gm-18)对酶解产物进行分离，得到分子量＜3000da(w1)和分子量3000da-10000da(w2)的2个组分。
对两种组分的抗氧化活性进行分析，结果见表5。从表5可以看出，相比分子量在3000da-10000da的w2组分，分子量＜3000da的w1组分具有更强的抗氧化活性，尤其是对超氧阴离子自由基的抗氧化活性提高了336％。
传统的抗氧化肽产品是不同分子量酶解产物的混合物，抗氧化活性弱。已报道的蓝圆鲹来源抗氧化肽对dpph自由基的ic50值一般为30mg/ml，对羟自由基的ic50值一般为9.807mg/ml；而本发明得到的抗氧化肽对羟自由基和dpph自由基的ic50值大大低于以上数据，说明分子量小于3000da的抗氧化肽对自由基具有很好的清除效果。
表5二种不同分子量组分抗氧化活性的ic50值
其中w1组分：mw<3000da；w2组分：mw＝3000da-10000da。
试验例5酶解产物ace抑制活性研究
高血压是一种比较常见的心血管疾病，在全球，尤其是发达地区每年都有20％左右的人被查出患有高血压，并且这一趋势还在逐年增长。人体内的血压受许多因素作用，其中最重要的因素是降压系统---激肽释放酶---激肽系统(kks)和升压系统---肾素---血管紧张素系统(ras)，血管紧张素转化酶即ace(angiotensin-converting-enzyme)是调节上述2个系统的关键因素。因此，抑制ace活性的物质就有降血压功能。
本发明发现(表6)，蓝圆鲹加工副产物的酶解产物具有很好的ace抑制活性。其中分子量小于3000da的w1组分抑制活性是分子量在3000da-10000da的w2组分的3.62倍。
表6二种不同分子量组分ace抑制活性的ic50值
其中w1组分：mw<3000da；w2组分：mw＝3000da-10000da。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。