一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种检验技术领域，具体是一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒及其应用。

背景技术：

随着人类基因组计划(humangenomeproject，hgp)的完成，大量疾病相关基因的发现，促进了传统生物医学模式向可预测性、可预防性、个体化和参与性的基因组医学模式转变，为未来发展预防、诊断、治疗长期困扰人类的诸如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经和精神疾病等重大复杂性疾病开辟了新途径，也为基因科学的产业化提供了良好的机遇。

全基因组关联分析(genomewideassociationstudies，gwas)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)为标记进行病例一对照关联分析，即在一定人群中收集病例组和对照组dna，进行snps芯片扫描，采用关联分析比较受检snps标记的某一等位基因频率在病例组和对照组间有无显著性差异，筛选与疾病关联的基因序列变异，做出该snps是否与疾病关联的判断，预测疾病的患病率及风险。该方法研究前不需构建任何假设，不再局限于候选基因或候选染色体区域作为关联分析对象，而是针对基因组中所有snps，随机进行基因分型，分析snps与疾病的关联度，可在全基因组水平上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，全面及时疾病发生、发展和治疗的相关遗传基因。

目前发现遗传因素，或其与环境因素之间的相互作用参与了几乎所有的人类疾病的发生过程。一些复杂的疾病往往不是由单一基因突变引起的，其发生发展与多基因多位点变异有关，且这些位点的变异可能与环境因素相关，这些位点可提高或降低个体患某种疾病的相对风险，被称为该种疾病的易感位点。根据大量的gwas结果，已经发现并证明的一系列复杂疾病的易感位点已被普遍应用于基因检测领域。

帕金森病(parkinson'sdisease,pd)是继阿尔茨海默病之后的第二大常见神经系统退行性疾病，其病理特点是纹状体黑质中进行性的多巴胺能神经元变性和存活神经元内的蛋白聚集，即路易小体。pd主要引起运动障碍，包括运动迟缓，静止性震颤，肌强直和姿势步态异常。目前没有药物能够减缓此病进展，左旋多巴等药物仅能缓解症状。pd的病因尚不清楚，但遗传和环境因素被认为共同参与发病。遗传因素在pd发病中的作用是肯定的，因为目前已有十几个致病基因在家族遗传性pd病例中被发现，例如snca、parkin、lrrk2、uch-l1、pink1等。这些致病基因的突变导致单基因遗传形式的pd。但单基因遗传形式的pd病例仅占所有病例的10％左右，绝大多数病例属于散发性pd(joshuam.shulman,philipl.dejager,andmelb.feany.parkinson'sdisease:geneticsandpathogenesis[j].annualreviewofpathology,2011,6:193-222.)。

突触核蛋白(alpha-synuclein,snca)基因是在家族性pd中发现的第一个致病基因，snca基因突变导致常染色体显性遗传性pd。它所编码的蛋白-a-synuclein蛋白是路易小体的主要组成部分。snca基因的点突变、三倍重复突变和二倍重复突变在家族性pd病例中被发现，并且携带重复突变的患者的死后脑组织中野生型snca的表达增加(singletonab,farrerm,johnsonj,etal.alpha-synucleinlocustriplicationcausesparkinson'sdisease.[j].science,2003,302(5646):841-841.；chartier-harlinmc,kachergusj,roumierc,etal.α-synucleinlocusduplicationasacauseoffamilialparkinson'sdisease[j].lancet,2004,364(9440):1167-9.)。这就提示的重复突变snca可能通过过表达而对多巴胺能神经元产生神经毒性，并导致家族性pd。snca基因不仅是家族性pd的一个致病基因，而且是散发性pd的一个易感基因，snca在散发性pd患者脑组织中表达增加(chiba-faleko,lopezgj,nussbaumrl.levelsofalpha-synucleinmrnainsporadicparkinsondiseasepatients[j].movementdisordersofficialjournalofthemovementdisordersociety,2006,21(10):1703-8.)。位于snca基因转录起始点上游10kb的一个微卫星双核苷酸重复序列等位基因长度多态-rep1，已经被多个研究证实与散发性pd的易感性相关(linnertzc,saucierl,ged,etal.geneticregulationofalpha-synucleinmrnaexpressioninvarioushumanbraintissues.[j].plosone,2009,4(10)::e7480.)。

lrrk2基因突变在常染色体显性遗传pd中是最常见的遗传因素，约占白种人群家族性pd的6％及散发性pd的2％(tianyy,tangcj,wuj,etal.parkinson'sdiseaseinchina[j].neurologicalsciencesofficialjournaloftheitalianneurologicalsociety&oftheitaliansocietyofclinicalneurophysiology,2011,32(1):23-30.；panf,dongh,dingh,etal.snprs356219oftheα-synuclein(snca)geneisassociatedwithparkinson'sdiseaseinachinesehanpopulation.[j].parkinsonism&relateddisorders,2012,18(5):632-634.)。国内乃至亚洲地区的研究多以基因突变与pd的关联性研究居多，综合这些研究结果可见lrrk2在多个亚洲地区(包括中国、日本、韩国等)的散发性pd患者中最常见，受关注最多(sidhua,wersingerc,vernierp.α-synucleinregulationofthedopaminergictransporter:apossibleroleinthepathogenesisofparkinson'sdisease[j].febsletters,2004,565(1-3):1–5.；taysp,limggy.parkinandparkinson'sdisease[j].etiologyandpathophysiologyofparkinson'sdisease,2011,10:47-70.)。

同时，hamzath等研究还发现hla-dra与帕金森氏病相关(hamzath,zabetiancp,tenesaa,etal.commongeneticvariationinthehlaregionisassociatedwithlate-onsetsporadicparkinson'sdisease[j].naturegenetics,2010,42(9):781-5.)

因此，对snca、lrrk2、hla-dra三个与帕金森氏病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在帕金森氏病方面的遗传因素，评估帕金森氏病发病的相对风险，对于帕金森氏病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助帕金森氏病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-aggtaaccaccgtgtgggtttg-3'，r：5'-tgatcctgtcaggggtttgtttt-3',2)f：5'-actttccacactgctgcacagg-3'，r：5'-ttctcatccaagtgggatgtgttt-3',3)f：5'-cagatcctgggtaggcgttttg-3',r：5'-tatgctcaggcttgggcaattt-3'；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

作为本发明进一步的方案：所述扩增引物为基于基因hla-dra、snca和lrrk2进行设计合成的。

一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备出一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒，对snca、lrrk2、hla-dra三个与帕金森氏病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在帕金森氏病方面的遗传因素，评估帕金森氏病发病的相对风险，对于帕金森氏病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义；同时还能辅助帕金森氏病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等；本专利产品采用基因检测领域的金标准——桑格测序法进行基因分型；桑格测序法是通过控制dna的合成来产生终止于靶序列特定位点的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同单链的dna模板退火，设立四种不同的测序反应，每一种反应中都含有dna聚合酶和四种正常的dntp；除此之外，还含有少量的有3'-h取代普通脱氧核糖3'-oh的2',3'-ddntp；若ddntp掺入到延伸中的dna链，由于缺少3'-oh将会阻断后续dntp形成磷酸二酯键，dna的进一步延伸被终止；使用四种不同的ddntp，产生的寡核苷酸将终止于每一个a,c,g或t在模板链上占据的位置，将四种反应产生的寡核苷酸加到测序仪中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳动的速率就不同，测序仪的图像控制器按照寡核苷酸经过的时间顺序，便可以检测出新合成链5'到3'的序列信息。

附图说明

图1为本发明的杂合型ag测序分型结果图；

图2为本发明的杂合型ct测序分型结果图；

图3为本发明的杂合型cg测序分型结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-aggtaaccaccgtgtgggtttg-3'(seqidno.1)，r：5'-tgatcctgtcaggggtttgtttt-3'(seqidno.2),2)f：5'-actttccacactgctgcacagg-3'(seqidno.3)，r：5'-ttctcatccaagtgggatgtgttt-3'(seqidno.4),3)f：5'-cagatcctgggtaggcgttttg-3'(seqidno.5),r：5'-tatgctcaggcttgggcaattt-3'(seqidno.6)；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

所述扩增引物为基于基因hla-dra、snca和lrrk2进行设计合成的；其中，检测的目标snp位点包括rs3129882、rs356220和rs1491942，这3个位点分别位于基因hla-dra、snca和lrrk2。

一种帕金森综合征易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

其中：

步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

步骤(2)中使用dna扩增试剂盒进行扩增，扩增的反应体系为：

takarataqtm(5u/μl)1u

10×pcrbuffer(mg2+)5μl

dntpmixture(2.5mmeach)4μl

正向引物(10pmol/μl)0.5μl

反向引物(10pmol/μl)0.5μl

模板1μl

双蒸水upto50μl，

扩增程序为：

stage1:predegeneration

repeat:1time

95℃3minutes

stage2:pcrreaction

repeat:30cycles

95℃5second

55℃30second

72℃1minutes

stage3:finalextension

72℃5minutes。

步骤(2)中电泳检测和纯化，其中电泳检测具体步骤为：制备1％的琼脂糖凝胶：称一定量的琼脂糖粉加入对应体积的10×tae加热熔解琼脂糖，待其完全熔解后加入10000×goldviewⅰ。待胶凝固后，取5μl的pcr产物加入loadingbuffer混合后，点到胶孔内，120v定压，跑15min左右。在tgreentransilluminator内观察扩增产物的片段大小、单一性及扩增浓度；

其中纯化体系为：

pcr扩增后的反应液5μl

sap/cip(1u/μl)1μl

exoⅰ(5u/μl)1μl

ddh2o3μl，

其中纯化反应程序为：

37℃30minutes

75℃15minutes。

步骤(3)中的桑格测序反应，反应体系为：

bigdye混合液1μl

测序引物(3.2pmol/μl)1μl

模板(纯化产物)1μl

ddh2o2μl，

反应程序为：

stage1:1time

95℃2minutes

stage2:25cycles

95℃10second

50℃5second

60℃4minutes。

步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

结果检测判定：

分型判定标准如下，见表1。

表1

其中rs3129882的杂合型ag、rs356220的杂合型ct和rs1491942的杂合型cg，测序分型结果图，见图1-3.

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。