基。链长度甚至可以长达大约100个碱基。长度的范围可以是10至35个碱基、12 至25个碱基、或13至20个碱基。在某些情况下，除了其他因素诸如成本、合成产率等等之 外，长度的选择通常取决于反义效应的强度与核酸链对靶的特异性的平衡。
[0148] 在一些实施方式中，嵌合AS0的长度的选择和它与靶链之间的互补性的程度也取 决于其被RNA酶H切割之后，嵌合AS0和靶链之间的结合亲和力。AS0的效力取决于切割之 前AS0与靶的结合亲和力以及切割的材料从AS0分离使得它自由地结合到另一个靶链的解 离率。
[0149] 嵌合反义多核苷酸包括"中心区域"、"第一 5' -侧翼区域"和"第一 3' -侧翼区 域"。嵌合多核苷酸还包括"第二5'-侧翼区域"或"第二3'-侧翼区域"，或两者。下面进 一步解释这些区域。具体的核苷酸到一个这样的区域或另一个区域的分配不是专有的。可 以存在几种方式以将给定的多核苷酸的核苷酸分配到不同的区域。这些区域名称是为了方 便，尽管很显然，通过制备其中核苷酸提供这样的区域的序列，多核苷酸将获得本文描述的 功能性能。
[0150] "中心区域"包括天然的和非天然的核苷酸二者。选择用于中心区域的核苷酸的 类型在很大程度上决定可能的反义作用机制的类型。例如，在中心区域中包括DNA和/或 DNA-样核苷酸可以导致可被RNA酶H识别的DNA/RNA异源双链体结构的形成。因此，在这 种情况下，RNA酶H-依赖的作用机制是可能的。另一方面，如果从中心区域排除DNA和/或 DNA-样核苷酸，那么预期会发生RNA酶H-非依赖的作用机制。当然，即使形成DNA/RNA异 源双链体结构，仍然可能发生RNA酶H-非依赖的机制。
[0151] 在一些实施方式中，中心区域包括至少5个核苷酸，所述至少5个核苷酸"当与RNA 多核苷酸杂交时，中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别"。
[0152] 当与RNA杂交时"被RNA酶H识别"的"至少5个核苷酸"通常是包括5至20个 连续的碱基的区域、包括5至16个连续的碱基的区域、包括5至12个连续的碱基的区域、 或包括5至8个连续的碱基的区域。此外，可用于这个区域的核苷酸是当与RNA核苷酸杂 交时，被RNA酶H识别的那些，如天然的DNA，其中RNA酶H切割RNA链。适合的核苷酸诸 如修饰的DNA核苷酸和其他碱基在本领域是已知的。已知含有2' -羟基基团的核苷酸，如 RNA核苷酸是不合适的。当期望RNA酶H-依赖的效应时，本领域的技术人员可以容易地确 定用于在"至少5个核苷酸"的这个区域中使用的核苷酸的适宜性。在一个实施方式中，中 心核苷酸区域的核苷酸独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
[0153] 在一些实施方式中，中心区域可以包括少至4个这样的核苷酸：当与RNA多核苷酸 杂交时，中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别。
[0154] 在其他实施方式中，中心区域不包括DNA。也就是说，在某些实施方式中，反义核酸 具有RNA酶H-非依赖的效应，或可替换地，非RNA酶H-依赖的反义效应。"非RNA酶H-依 赖的反义效应"意指当使靶基因的转录产物（RNA有义链）和与转录产物的部分序列互补的 核酸链杂交时，由于翻译或剪接功能修饰作用诸如外显子跳跃的抑制而发生的阻抑靶基因 的表达的活性（参见在图1中的虚线包围的区域之外的上部的描述）。
[0155] "不包括DNA的核酸"意指不包括天然的DNA和修饰的DNA的反义核酸，且它的实 例可以是RNA、修饰的RNA、核苷酸类似物、PNA、或包括吗啉代核酸的核酸。此外，关于"不 包括DNA的核酸"，从对核酸酶的耐受性是高的观点来看，核酸的部分或全部可以包括修饰 的核苷酸和/或核苷酸类似物。这样的修饰的实例包括下面描述的那些，且相同的核苷酸 可以经受多种修饰的组合。此外，如下面描述的，与修饰的核酸的数目和修饰的位置相关的 优选的实施方式可以通过在修饰之后测量由嵌合多核苷酸具有的反义效应来表征。
[0156] 中心区域中的核苷酸的碱基序列和靶基因的转录产物的碱基序列彼此不必完全 地互补，且碱基序列可以具有至少70 %或更高、优选地80 %或更高、且更优选地90 %或更 高（例如，95%、96%、97%、98%、99%或更高）的互补性。
[0157] 对"不包括DNA的核酸"的长度没有具体的限制，但是长度如以上描述的，且通常 是5至35个碱基、5至25个碱基、12至25个碱基、或13至20个碱基。
[0158] 对"不包括DNA的核酸"的长度没有具体的限制，但是长度如以上描述的，且通常 是5至35个碱基、5至25个碱基、12至25个碱基、或13至20个碱基。
[0159] 如本文使用的，"DNA核苷酸"意指天然的DNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或磷 酸酯键（phosphatelinkage)亚单元的DNA核苷酸。类似地，"RNA核苷酸"意指天然的RNA 核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯 键亚单元是这样的亚单元：其中在亚单元中添加或取代了单个取代基，且该亚单元作为整 体没有被不同的化学基团取代。从包括核苷酸的区域的部分或整体具有高的对脱氧核糖核 酸酶等等的耐受性的观点来看，DNA可以是修饰的核苷酸。这样的修饰的实例包括胞嘧啶 的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、 5_溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代 磷酸酯化（phosphorothioation)、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷 酸酯化（phosphorodithioation)、磷酰胺化（phosphoroamidation)、2'-〇-甲基化、2'-甲 氧乙基（M0E)化、2' -氨丙基（AP)化和2' -氟化。然而，从具有极好的药代动力学观点来 看，优选硫代磷酸酯化。可以实行这样的修饰，使得相同的DNA可以经受多种修饰的组合。 并且，如下面讨论的，RNA核苷酸可以被修饰以取得相似的效果。
[0160] 在某些情况下，修饰的DNA的数目和修饰的位置可影响由本文公开的嵌合反义多 核苷酸提供的反义效应等等。由于这些实施方式可随着靶基因的序列等等而变化，它可以 取决于多种情况，但是本领域的普通技术人员可以通过参考与反义方法相关的文献的描述 确定适合的实施方式。此外，当测量在修饰之后嵌合反义多核苷酸具有的反义效应时，如果 因此获得的测量的值没有显著地低于修饰之前嵌合反义多核苷酸的测量的值（例如，如果 在修饰之后获得的测量的值低于修饰之前嵌合反义多核苷酸的测量的值的30%或比修饰 之前嵌合反义多核苷酸的测量的值更多），可以评价相关的修饰。如下面的实施例所示，可 以通过下列步骤实行反义效应的测量：将处于测试中的核酸化合物引入细胞等等，且通过 适当利用已知的技术诸如Northern印迹、定量PCR和蛋白质印迹，测量细胞内的革巴基因的 表达的量（mRNA的量、cDNA的量、蛋白质的量，等等），其中所述表达被处于测试中的核酸化 合物提供的反义效应阻抑。候选试剂可以是嵌合反义多核苷酸自身，或作为双链反义试剂 的部分的嵌合反义多核苷酸。
[0161] 如本文使用的，"RNA核苷酸"意指天然存在的RNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖 或磷酸酯键亚单元的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元是这样的亚单元：其中 在亚单元中添加或取代了单个取代基，且该亚单元作为整体没有被不同的化学基团取代。
[0162] 从具有高的对核酸酶诸如核糖核酸酶（RNA酶）的耐受性的观点来看，核酸的部分 或全部可以是修饰的核苷酸。这样的修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴 化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤 的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫 基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、磷酰胺化、2'-0-甲基化、2'-甲氧乙基（M0E) 化、2'-氨丙基（AP)化、脱氧核糖（导致'UNA'）的2'-碳和3'-碳之间的断裂和2'-氟 化。同样地，还构思了具有胸腺嘧啶碱基取代了尿嘧啶碱基的RNA核苷酸。然而，从具有极 好的药代动力学观点来看，使用硫代磷酸酯化。此外，可以实行这样的修饰，使得相同的核 酸可以经受多种修饰的组合。例如，如下面描述的实施例中使用的，相同的RNA可以经受硫 代磷酸酯化和2' -0-甲基化，以便提供对酶促切割的耐受性。如本文使用的，"核苷酸类似 物"意指非-天然地存在的核苷酸，其中碱基、糖或磷酸酯键亚单元在亚单元中具有多于一 个添加的或取代的取代基，或亚单元作为整体被不同的化学基团取代。具有多于一个取代 的类似物的实例是桥接的核酸，其中桥接的单元凭借糖环上的两个取代被添加，所述桥接 的单元通常连接到2'和4'碳原子。关于根据某些实施方式的第一侧翼，从增加对靶基因 的转录产物的部分序列的亲和力和/或靶基因对核酸酶的耐受性的观点来看，第一侧翼还 包括核苷酸类似物。"核苷酸类似物"可以是其中由于修饰（桥接的基团、取代基，等等）， 增强了对靶基因的转录产物的部分序列的亲和力和/或核酸对核酸酶的耐受性的任何核 酸，且它的实例包括JP10-304889A、TO2005/021570、JP10-195098A、JP2002-521310 W、TO2007/143315、TO2008/043753、TO2008/029619 和TO2008/049085 中公开的适用于 反义方法的核酸（在下文中，这些文献将被称为"与反义方法相关的文献"）。也就是说，它 的实例包括以上描述的文献中公开的核酸：己糖醇核酸（HNA)、环己烷核酸（CeNA)、肽核酸 (PNA)、乙二醇核酸（GNA)、苏糖核酸（TNA)、吗啉代核酸、三环-DNA(tcDNA)、2'-0_甲基化的 核酸、2' -M0E(2' -0-甲氧乙基）化的核酸、2' -AP(2' -0-氨丙基）化的核酸、2' -氟化的 核酸、2' -F-阿拉伯糖核酸（2' -F-ANA)和BNA(桥接的核酸）。
[0163] 根据某些实施方式，BNA可以是其中通过两个或更多个原子桥接2'碳原子和4' 碳原子的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。本领域的技术人员已知桥接的核酸的实例。 这样的BNA的一个亚组可以描述为具有通过4' - (CH2)p-0-2'、4' - (CH2)p-S-2'、4' - (CH2) 15-0〇)-2'、4'-(〇1丄40? 3)-0-(〇12)"1-2'桥接的在2'-位置的碳原子和4'-位置的碳原 子（这里，p、m和n分别地代表从1至4的整数、从0至2的整数和从1至3的整数；且 R3代表氢原子、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰 基基团和单元取代基（荧光或化学发光标记的分子、具有核酸切割活性的官能团、细胞内 或细胞核内定位信号肽等等））。此外，关于根据某些实施方式的BNA，在3' -位置的碳原 子处的〇私取代基和5' -位置的碳原子处的ORi取代基中，RJPR2通常是氢原子，但是彼 此可以是相同的或不同的，且也可以是用于核酸合成的羟基基团的保护基团、烷基基团、 烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团、甲硅烷基基团、磷 酸基团、由用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团、或_P(R4)R5(这里，RjPR5，彼此可 以是相同的或不同的，各自代表羟基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的羟基基团、 巯基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1至5个碳原子 的烷氧基基团、具有1至5个碳原子的烷硫基基团、具有1至6个碳原子的氰基烷氧基基 团、被具有1至5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团）。这样的BNA的非限制性实例 包括a-L-亚甲基氧基（4, -CH2-0-2'）BNA或0-D-亚甲基氧基（4, -CH2-0-2'）BNA，其 又名为LNA(锁核酸（注册商标），2'，4' -BNA)、乙烯基氧基（4' _(CH2)2-0-2'）BNA，其 又名为ENA、0-D-硫代（4, -CH2-S-2'）BNA、氨基氧基（4, -CH2-0-N(R3)-2'）BNA、氧氨基 (4, -CH2-N(R3)-0-2'）BNA，其又名为 2'，4' -BNAnc、2'，4'-BNAc〇c、3' -氨基-2'，4' -BNA、 5' -甲基BNA、（4, -CH(CH3)-0-2'）BNA，其又名为cEtBNA、（4'-CH(CH20CH3)-0-2'）BNA，其 又名为cMOEBNA、酰胺BNA(4' -C(0)-N(R)-2'）BNA(R=H、Me)，其又名为AmNA、以及本领 域的技术人员已知的其他BNA。
[0164] 根据某些实施方式，解锁核酸（UNA)可以是其中2'碳原子和3'碳原子之间的共 价键断裂以引起增加柔性的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。本领域的技术人员已知解 锁核酸的实例。
[0165] 此外，在核苷酸类似物中，根据某些实施方式，可以修饰碱基部分。碱基部分的 修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶 的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；和鸟嘌呤的 N2-甲基化和8-溴化。此外，在根据某些实施方式的修饰的核酸中，磷酸二酯结合位点可以 被修饰。磷酸二酯结合位点的修饰的实例包括硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、 手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、和磷酰胺化。然而，从具有极好的药代动力学的观点来 看，硫代磷酸酯化可被用于例如中心区域和第一侧翼区域。同样，可以实行这样的碱基部分 的修饰或磷酸二酯结合位点的修饰，使得相同的核酸可以经受多种修饰的组合。
[0166] 通常，修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物不限于本文例示的那些。本领域已知 许多修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物，诸如例如Tachas等人的美国专利号8, 299, 039 特别是第17-22栏中公开的那些，并且可被用于本申请的实施方式。在图5中显示了天然 的核苷酸、修饰的核苷酸、和核苷酸类似物的实例。
[0167] 本领域的普通技术人员可以在这样的修饰的核酸之中适当选择和使用核苷酸类 似物同时考虑反义效应、对靶基因的转录产物的部分序列的亲和力、对核酸酶的耐受性，等 等。然而，在一些实施方式中，核苷酸类似物是由下式（1)表示的LNA:
[0168] [化学式1]
[0169]
[0170] 在式（1)中，"碱基"代表可以被取代的芳香族杂环基团或芳香族烃环基团，例如， 天然的核苷的碱基部分（嘌呤碱基或嘧啶碱基）、或非天然的（修饰的）核苷的碱基部分， 同时碱基部分的修饰的实例包括以上描述的那些；且
[0171] RJPR2，彼此可以是相同的或不同的，各自代表氢原子、用于核酸合成的羟基基团 的保护基团、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基 团、甲硅烷基基团、磷酸基团、由用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团、或-p(r4)r5(这 里，RdPR5，彼此可以是相同的或不同的，各自代表羟基基团、由用于核酸合成的保护基团 保护的羟基基团、巯基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1 至5个碳原子的烷氧基基团、具有1至5个碳原子的烷硫基基团、具有1至6个碳原子的氰 基烷氧基基团、或具有1至5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团。
[0172] 将由上述化学式显示的化合物表示为核苷，但是"LNA"且更