通常地，根据某些实施 方式的BNA包括其中磷酸衍生的基团结合到相关的核苷（核苷酸）的核苷酸形式。换句话 说，BNA诸如LNA被归为构成双链核酸复合体的核酸链中的核苷酸。
[0173] 此外，在一些实施方式中，核苷酸类似物是由下列式（2)和（3)表示的解锁核酸 (UNA)：
[0174] [化学式2]
[0175]
[0176] [化学式3]
[0177]
[0178] 解锁核酸（UNA)寡核苷酸是柔性的RNA模拟物，其能够使它们调节它们对其他核 苷酸的亲和力和特异性。解锁核酸UNA是非环式-RNA类似物，且又名为2'，3'-开环-RNA， 其中C2' -C3'键断裂。键断裂使得它们有柔性并引起它们调节多种核酸的热力学稳定性。
[0179] 根据某些实施方式，"第一 5' -侧翼区域"和"第一 3' -侧翼区域"分别位于5'侧 面和3'侧面，且连续地连接到中心区域的每一末端的末端核苷酸。
[0180] 紧邻中心区域的5'-侧面布置的包括核苷酸类似物的区域（在下文中，也称为"第 一 5'侧翼区域"）和紧邻中心区域的3'侧面布置的包括核苷酸类似物的区域（在下文中， 也称为"第一 3'侧翼区域"）各自可以独立地包括在与反义方法相关的文献中讨论的核苷 酸类似物中的至少一种，且除了这样的核苷酸类似物之外，还可以包括天然的核酸（DNA或 RNA)。此外，第一 5'侧翼区域和第一 3'侧翼区域的链长度通常独立地是1至10个碱基、1 至7个碱基、或2至5个碱基。
[0181] 此外，存在第一 5'侧翼区域和第一 3'侧翼区域中核苷酸类似物和天然的核苷酸 的种类的数目和位置的适合的实施方式，因为在某些实施方式中，那些核酸的数目和位置 可能影响由双链核酸复合体提供的反义效应等等。由于这些适合的实施方式可以随着序列 等等而变化，它可以取决于多种情况，但是本领域的普通技术人员可以通过参考与反义方 法相关的文献的描述确定适合的实施方式。此外，当以与在包括"至少5个核苷酸"的区域 的情况中相同的方式测量修饰之后由单独的反义链或双链反义试剂具有的反义效应时，如 果因此获得的测量的值没有显著地低于修饰之前的链或试剂的测量的值，那么相关的修饰 可以被评价为优选的实施方式。
[0182] 如以上所指出的，嵌合反义多核苷酸包括至少一个"第二侧翼"区域。一些实施方 式可以仅包括在多核苷酸的5'末端或3'末端的一个第二侧翼区域，或嵌合反义多核苷酸 可以包括第二5'侧翼区域和第二3'-侧翼区域二者。在图3A-3C中示出了这些结构设计。
[0183] 如果存在，"第二5' -侧翼区域"和"第二3' -侧翼区域"包括至少1个低蛋白 质-亲和力核苷酸。
[0184] "低蛋白质-亲和力核苷酸"是这样的核苷酸：（i)比天然的DNA或RNA核苷酸具有 更强的对DNA酶或RNA酶的耐受性且（ii)对蛋白质或蛋白质样细胞组分具有低的结合亲 和力。具体地，核苷酸比硫代磷酸酯化的核苷酸具有更低的对蛋白质的结合亲和力。因此， 低蛋白质-亲和力核苷酸是以上描述的修饰的核苷酸或核苷酸类似物，但是核苷酸没有被 硫代磷酸酯化。
[0185] 低蛋白质-亲和力核苷酸的实例包括2'-0_甲基RNA核苷酸、2'-0_甲氧乙基RNA 核苷酸、LNA、cMOEBNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺 核苷酸、5-甲基胞嘧啶、解锁核酸（UNA)和5-丙炔基尿嘧啶。
[0186] 本文公开的第二侧翼延长了目标嵌合多核苷酸的长度，超过通常所期望的AS0长 度。然而，此处和在下面的实例中描述的，通过在第二侧翼区域中包括低蛋白质-亲和力核 苷酸，减少或甚至消除通常在较长长度的AS0中观察到的性能降低。换句话说，可以利用本 文描述的嵌合反义多核苷酸获得的基因表达抑制的程度接近于不具有第二侧翼区域因此 长度必然更短的传统的缺口体AS0的性能。并且，可以利用本文描述的双链反义试剂获得 的基因表达抑制的程度接近、等于、并且在一些实施方式中超过不具有第二侧翼区域因此 长度必然更短的传统的单链缺口体AS0的性能。
[0187] 每一个第二侧翼区域的长度是独立的。除了对嵌合反义多核苷酸的整个长度不超 过100个核苷酸的整体限制之外，对每一个第二侧翼的长度没有具体的限制。
[0188] 可以期望调整第二侧翼区域中碱基的结合亲和力。在一个极端，第二侧翼区域中 的核苷酸可以被选择为与转录产物中的靶向的序列完全地互补。或者，第二侧翼区域序列 可以与相应的靶完全地错配。并且，还构思了第二侧翼区域中匹配和错配的碱基对的任何 组合。在图6A-6D中示意性地示出了这些选择。本领域知晓结合亲和力是反义抑制的性能 中重要的考虑因素。如非专利文献6中讨论的，存在AS0和靶之间的结合亲和力的最佳范 围用于获得AS0的最大效力。因此，可以根据本文公开的实施方式，最佳化第二5'-侧翼区 域和第二3'侧翼区域内并入的匹配和错配的碱基的长度、碱基含量和模式，以供使用。
[0189] 根据一些实施方式的互补链是与以上描述的嵌合反义多核苷酸互补的多核苷酸。 互补链的碱基序列和嵌合反义链的碱基序列彼此不必完全地互补，并且碱基序列可以具有 至少70%或更高、优选地80%或更高、且更优选地90%或更高（例如，95%、96%、97%、 98%、99%或更高）的互补性。
[0190] 互补链是包括选自RNA、DNA、PNA(肽核酸）和BNA(例如，LNA)的核酸中的至少一 种的多核苷酸。更具体地，互补链包括（i)RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物、和任选地低 蛋白质-亲和力核苷酸、和任选地DNA核苷酸；或（ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物和/ 或低蛋白质亲和力核苷酸；或（iii)PNA核苷酸。
[0191] 术语"RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物、和任选地低蛋白质-亲和力核苷酸、和 任选地DNA核苷酸"意指，互补链包括RNA核苷酸、且任选地还可以在链中包括核苷酸类似 物、且任选地还可以在链中包括低蛋白质-亲和力核苷酸、且任选地还可以在链中包括DNA 核苷酸。术语"DNA核苷酸和/或核苷酸类似物和/或低蛋白质-亲和力核苷酸"意指，第 二链可以包括DNA核苷酸或核苷酸类似物、或低蛋白质-亲和力核苷酸，或可以包括DNA核 苷酸、核苷酸类似物、或低蛋白质-亲和力核苷酸的一些组合。术语"PNA核苷酸"意指，第 二链可以基本上包括PNA核苷酸，尽管可以包括其他核苷酸。
[0192] 当某些实施方式的双链反义试剂被细胞内的RNA酶H识别且互补的核酸链因此分 解，释放嵌合反义链时，第二核酸链通常包括RNA核苷酸。在一些实施方式中，从功能分子 诸如肽可以容易地结合到双链复合体的观点来看，第二核酸链包括PNA。
[0193] 互补链的长度没有具体限制。互补链可以比嵌合反义多核苷酸短、与它一样大小、 或比它长。在一些实施方式中，使用能够退火至两种或更多种嵌合反义多核苷酸的互补链。 两种或更多种嵌合反义链可以靶向相同的序列或不同的序列。
[0194] 在一些实施方式中，双链反义试剂包括多于两个多核苷酸。例如，两条反义链可以 与一条互补链形成双链复合体。在PCT/JP2012/083180中公开了多个多组分双链复合体， 且那些也可以应用于本申请中公开的双链反义试剂。
[0195] 在一些实施方式中，互补的多核苷酸与天然的核苷酸相比，全部或部分地包括对 核酸酶诸如核糖核酸酶（RNA酶）有耐受性的修饰的核苷酸或核苷酸类似物。这样的修饰的 实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲 基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；和鸟嘌呤的N2-甲基化 和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、 磷酰胺化、2' -0-甲基化、2' -甲氧乙基（M0E)化、2' -氨丙基（AP)化和2' -氟化。同样 地，还构思了具有胸腺嘧啶碱基取代了尿嘧啶碱基的RNA核苷酸。互补链中也可并入低蛋 白质-亲和力核苷酸。然而，在一些实施方式中，使用硫代磷酸酯化。此外，可以实行这样的 修饰，使得相同的核酸可以经受多种修饰的组合。例如，如下面描述的实例中使用的，相同 的RNA可以经受硫代磷酸酯化和2'-0_甲基化，以便提供对酶促切割的耐受性。然而，在预 期或期望RNA核苷酸被RNA酶H切割的情况下，那么通常仅应用硫代磷酸酯化或2' -0-甲 基化。
[0196] 存在互补链内核苷酸类似物的数目和修饰的位置的适合的实施方式，因为在某些 实施方式中，修饰的数目和位置可影响由双链反义试剂提供的反义效应等等。由于这些适 合的实施方式可随着所要修饰的核酸的类型、序列等等而变化，它可以取决于多种情况，但 是类型、序列等等可以以与以上描述相同的方式，通过测量修饰之后的双链反义试剂所具 有的反义效应来表征。
[0197] 在一些实施方式中，从当通过核糖核酸酶诸如RNA酶A的分解被抑制，直到互补链 被递送至特定细胞的细胞核内时，互补链在特定细胞中可以容易地表现出由RNA酶H分解 的反义效应的观点来看，互补链通常包括RNA，且可并入增加核酸酶稳定性和/或1的核苷 酸。例如，在与嵌合反义链的侧翼区域之一（也就是，第一或第二5'侧翼区域和/或第一 或第二3'侧翼区域）互补的互补链的区域中，人们任选地可以并入一个或更多个修饰的核 酸、一个或更多个核苷酸类似物、和/或一个或更多个低蛋白质-亲和力核苷酸，这有助于 阻抑酶诸如核糖核酸酶分解复合体。
[0198] 根据某些实施方式，修饰是RNA的2' -0-甲基化和/或硫代磷酸酯化。此外，在 一些实施方式中，可以修饰与反义链的侧翼区域之一互补的互补链的整个区域，或可以修 饰与反义链的侧翼区域互补的区域的部分。另外，修饰的区域可以比包括第一核酸链的修 饰的核酸的区域长、或可以比其短，只要修饰的区域包括那个部分。在图15中显示了关于 反义链的结构的互补链的结构的一些实施方式的实例。首先，上部结构是双侧翼反义多核 苷酸（DW-AS0)。下面是互补链的四个实例。例如，在期望双链试剂易受RNA酶H切割的情 况下，那么优选地，与中心区域互补的互补链的部分包括RNA。（RNA(o)=具有二磷酸酯键 的RNA)。与DW-AS0的多个侧翼区域互补的互补链的部分也可包括修饰的核苷酸和/或核 苷酸类似物。例如，在互补链中也可包括双侧翼结构（cRNA(DW))。或者，在每一个末端与 第一和第二侧翼区域互补的互补链的部分可以包括修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，尽 管不一定包括低蛋白质-亲和力核苷酸（cRNA(G)或cLNA(G) ;G指的是"缺口体"结构）。 或者，互补链可以包括肽核酸。图6显示了结构的简易图，且多个互补的区域不一定被登记 上。本领域的技术人员可以容易地明白，结构可以被修饰而不会偏离双链反义试剂的期望 的功能性，包括组成的多核苷酸的功能性。最后，图15中所示的互补链包括5'末端的官能 团"X"。这样的基团任选地被包括且描述如下。
[0199] 在双链反义试剂中，组成的多核苷酸的一个或更多个还可包括功能部分。
[0200] 在一些实施方式中，与反义多核苷酸互补的链可以包括结合到多核苷酸的功能部 分。返回参考图15,功能部分"X"被示出为连接到互补链的多个实例的5'末端。下面进 一步描述的功能部分可以可选地连接在3'末端，或在多核苷酸内部的位置处。在其他实施 方式中，互补链包括多于一个功能部分，所述多于一个功能部分可以连接在多个位置处，和 /或作为基团连接到多核苷酸的一个位置处。
[0201] 在一些实施方式中，嵌合反义多核苷酸可以包括键合到多核苷酸的功能部分。例 如，如图4B、4C和4D所示，可以将功能部分连接到嵌合反义多核苷酸的5'末端核苷酸、或 3' -末端核苷酸、或5'和3'末端核苷酸二者。当然，功能部分也可以连接到内部位置处， 且如上所描述的，可以连接多于一个部分。
[0202] 在某些实施方式的嵌合反义多核苷酸中，功能部分可以与多核苷酸键合。多核苷 酸（例如，反义多核苷酸或互补多核苷酸）和功能部分之间的键合可以是直接的键合，或可 以是通过另外的物质介导的间接键合。然而，在某些实施方式中，优选的是功能部分经由共 价键、离子键、氢键等等与多核苷酸诸如第二侧翼直接键合，且从可以获得更稳定的结合的 观点来看，更优选共价键。功能部分也可以经由可裂解的连接基团与多核苷酸键合。例如， 可以经由二硫键连接功能部分。
[0203] 对根据某些实施方式的"功能部分"的结构没有具体的限制，只要它赋予嵌合多核 苷酸期望的功能即可。期望的功能包括标记功能、纯化功能和递送功能。提供标记功能的 部分的实例包括诸如荧光蛋白、萤光素酶等等的化合物。提供纯化功能的部分的实例包括 诸如生物素、亲和素、His标签肽、GST标签肽、FLAG标签肽等等的化合物。
[0204] 此外，从以高特异性和高效率将嵌合多核苷酸递送到靶位点，并从而通过相关核 酸非常有效地阻抑靶基因的表达的观点来看，优选的是将具有将某些实施方式的嵌合反义 多核苷酸递送至体内的"靶位点"的活性的分子作为功能部分，与嵌合反义多核苷酸和/或 组成双链反义试剂的另一多核苷酸结合。在一些实施方式中，优选的是功能部分连接到互 补链，即，与反义多核苷酸互补并退火至反义多核苷酸的多核苷酸。
[0205] 从能够以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌合多核苷酸递送至肝脏等等的 观点来看，具有"靶向递送功能"的部分可以是例如，脂质。这样的脂质的实例包括：脂质诸 如胆固醇和脂肪酸（例如，维生素E(生育酚、生育三烯酚）、维生素A和维生素D);脂溶性 维生素诸如维生素K(例如，酰基肉碱）；中间代谢物诸如酰基辅酶A;糖脂、甘油酯和其衍 生物。然而，在这些之中，从具有更高的安全性的观点来看，在某些实施方式中，使用胆固醇 和维生素E(生育酚、生育三烯酚）。此外，从能够以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌 合反义多核苷酸递送至脑的观点来看，根据某些实施方式的"功能部分"的实例包括糖（例 如，葡萄糖和蔗糖）。同样地，从能够通过结合到多种器官的细胞表面上存在的多种蛋白质， 以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌合反义多核苷酸递送至多种器官的观点来看，根 据某些实施方式的"功能部分"的实例包括肽或蛋白质诸如受体配体和抗体和/或其片段。
[0206] 关于某些实施方式的嵌合反义多核苷酸，如图4B、4C和4D所示，可以将功能部分 连接到5'末端核苷酸、或3' -末端核苷酸、或5'末端核苷酸和3'末端核苷酸二者。用于 将标签偶联到核酸链的技术随标签部分的性质和核酸中的附接点而变化，并且本领域熟知 这些技术。尽管没有示出，功能部分可以连接到多核苷酸的内部位点而不连接到多核苷酸 的链末端位点。再次，本领域熟知这样的技术。
[0207] 因此，已经描述了一些实施方式的嵌合多核苷酸的一些适合的示例性实施方式， 但是嵌合多核苷酸不旨在限于以上描述的示例性实施方式。此外，本领域的普通技术人员 可以通过适当地选择已知的方法产生根据多个实施方式的嵌合多核苷酸。例如，可以通过 下列步骤产生根据一些实施方式的核酸：根据靶向的转录产物的碱基序列（或，在一些情 况下，靶向的基因的碱基序列）的信息，设计核酸的各自的碱基序列；通过利用商业上可得 的自动核酸合成仪（AppliedBiosystems,Inc.的产品；BeckmanCoulter,Inc的产品；等 等）合成核酸；以及随后通过利用反相柱等等纯化所得寡核苷酸。将以这种方式产生的核 酸混入适合的缓冲溶液并在大约90摄氏度至98摄氏度下变性