oc-2〇-mer-8UPS-嵌合多核苷酸）的效力大。此外， Toc-20-mer-8UPS-的功效延长直至注射之后14天（图13)。此外，Toc-20-mer-8UPS-的 效力是剂量依赖的方式（图14)。
[0254] 这些结果表明，与具有PS的传统20mer对照AS0相比，不具有PS的第二侧翼的存 在提供了改进的性能，且与对照相比，预期上述20-mer-8U PS-AS0具有减少的毒性。
[0255] "高-核酸外切酶耐受性的核苷酸"是（i)比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的 对DNA酶或RNA酶的耐受性，（ii)比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的对核酸外切酶的 耐受性且（iii)比天然的DNA或RNA核苷酸具有相对相同的或更低的对核酸内切酶的耐受 性的核苷酸。
[0256] 高-核酸外切酶耐受性的核苷酸的实例包括2' -0-甲基RNA核苷酸、2' -0-甲氧 乙基RNA核苷酸、LNA、cM0EBNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、 磷酸酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、和解锁核酸（UNA)。
[0257] 实施例5
[0258] 接下来，在小鼠中体内测试了双链反义试剂。在图16A中显示多种反义探针和互 补链的序列和设计。在互补链中，将生育酚（Toe)结合到5'末端。因此，能够引导双链试 剂和可能地嵌合反义多核苷酸递送至肝脏的功能部分被并入互补链中。
[0259] 根据已知的技术通过以下步骤实施生育酚部分与eRNA的结合：制备生育酚酰胺， 其中将生育酚的色烷环的6位置的羟基基团连接到亚磷酰胺；以及然后通过标准的偶联方 法，将生育酚酰胺偶联到RNA的5' -末端。
[0260] 反义多核苷酸和互补链（eRNA)的序列、组成和链长度如下：
[0261] 反义链
[0262] 1. 20mer-lApoBlASO：
[0263] 5，-TsCsCsAsG sCsaststsgsg stsastsTsCsA sGsTsG-3(SEQIDN0:5V
[0264] 2. 20mer~4 ApoBl ASO：
[0265] 5'-uscscsasG sCsaststsgsg stsastsTsCsA s￡susg-3 (SEQ ID NO：6)'
[0266] 3. 20mer-5 ApoBl ASO：
[0267] 5' -uccaGsCsaststsg sgstsastsTsC sAgUK-3 (SEQ ID NO :7) '
[0268] 4. 13merApoBl ASO：
[0269] 5' -GsCsaststsg sgstsastsTsC sA-3'(SEQ ID NO：8)
[0270] (大写字母：LNA;小写字母：DNA;加下划线的：2' -0-MeRNA;s:碱基之间的硫代 磷酸酯）
[0271] 互补链
[0272] 1. 2〇-mer Toc-ApoBl eRNA：
[0273] 5, -Toc-csascsus￡sAAUACCAAUGscsu sSs￡sa-3,(SEQIDNO:9)
[0274] 2. 13-mer Toc-ApoBl eRNA :5，-Toc-usSsasAUACCAAUs￡ sc-3r (SEQ ID NO: 10)
[0275] (大写字母：RNA;加下划线的：2' -OMe-RNA:s:碱基之间的硫代磷酸酯）
[0276] 以等摩尔的量混合具有相同长度的反义多核苷酸和各cRNA，且在95摄氏度下将 混合物加热5分钟，且然后在37摄氏度保温一小时，从而使这些核酸链退火并形成双链核 酸复合体。将退火的核酸存储在4摄氏度或冰上。
[0277] 通过尾静脉，以每一种0. 75mg/kg的量将双链复合体静脉注射至小鼠。小鼠是4 周龄的雌性ICR小鼠，具有20至25g的体重。以n= 3实行利用小鼠的全部实验。同样， 作为阴性对照组，还制备了向其仅注射PBS，而不是双链复合体的小鼠。在注射之后七十二 小时，利用PBS灌注小鼠，且然后将小鼠解剖，以提取肝脏。随后，通过与实施例1中描述的 方法相同的方法实行mRNA的提取、cDNA的合成、和定量RT-PCR，计算mApoB的表达的量/ mGAPHD(内部标准基因）的表达的量，并在施用PBS(仅PBS)的组和施用核酸的组之间进行 比较。在图16B中呈现了如此获得的结果。
[0278] 如在图16B中示出的，与PBS对照相比，三种双链复合体（含有20mer-4、20mer-5 和13merAS0的那些）显示统计学上显著的阻抑水平。此外，包括20mer-5AS0的双链试 剂显示了类似于双链13mer缺口体对照的反义效应的反义效应。因此，与传统的20mer对 照ASO相比，20mer-5ASO中的双侧翼结构提供了改进的性能，且与13mer对照相比，预期具 有减少的毒性。结果证明，包括嵌合反义多核苷酸（即，具有双侧翼结构的反义多核苷酸， 在这种情况下，且第二侧翼在多核苷酸的3'和5'末端）的双链反义试剂提供了改进的体 内反义性能。
【主权项】
1. 一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括： 包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域； 连接到所述中心核苷酸区域的5'末端的第一 5' -侧翼区域，所述第一 5' -侧翼区域 包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物； 连接到所述中心核苷酸区域的3'末端的第一 3' -侧翼区域，所述第一 3' -侧翼区域 包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和 第二5' -侧翼区域和/或第二3' -侧翼区域，其中： 所述第二5' -侧翼区域连接到所述第一 5' -侧翼区域的5'末端且包括至少1个低蛋 白质-亲和力核苷酸；且 所述第二3' -侧翼区域连接到所述第一 3' -侧翼区域的3'末端且包括至少1个低蛋 白质-亲和力核苷酸； 其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷酸。2. -种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括： 包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域； 连接到所述中心核苷酸区域的5'末端的第一 5' -侧翼区域，所述第一 5' -侧翼区域 包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物； 连接到所述中心核苷酸区域的3'末端的第一 3' -侧翼区域，所述第一 3' -侧翼区域 包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和 第二5' -侧翼区域和/或第二3' -侧翼区域，其中： 所述第二5' -侧翼区域连接到所述第一 5' -侧翼区域的5'末端，比天然的DNA或RNA 具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；且 所述第二3' -侧翼区域连接到所述第一 3' -侧翼区域的3'末端，比天然的DNA或RNA 具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失； 其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。3. 根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括这样 的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，所述中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶 H识别。4. 根据权利要求3所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域的核苷酸独立 地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。5. 根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-20个 DNA核苷酸。6. 根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-12个 DNA核苷酸。7. 根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立 地选自RNA核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸。8. 根据权利要求7所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述核苷酸类似物独立地选自LNA 核苷酸、BNA核苷酸、2' -O-Me RNA核苷酸、2' -O-甲氧乙基RNA核苷酸。9. 根据权利要求8所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立地选 自2' -O-Me RNA核苷酸和2' -0-甲氧乙基RNA核苷酸的核苷酸。10. 根据权利要求1-9的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域 中的核苷酸中的至少一个被硫代磷酸酯化。11. 根据权利要求10所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的所有核 苷酸都被硫代磷酸酯化。12. 根据权利要求1-11的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第一侧翼区域中 的核苷酸是桥接的核苷酸。13. 根据权利要求1-12的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述桥接的核苷酸独 立地选自 LNA、cEt BNA、酰胺 BNA 和 cMOE BNA。14. 根据权利要求1-13的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域 和所述第一侧翼区域中的核苷酸类似物中的至少一个被硫代磷酸酯化。15. 根据权利要求1-14的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述低蛋白质-亲和 力核苷酸独立地选自2' -0-甲基RNA核苷酸、2' -0-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cM0E BNA、 2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、 UNA和5-丙炔基尿嘧啶。16. 根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷 酸包括第二5' -侧翼区域。17. 根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷 酸包括第二3' -侧翼区域。18. 根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷 酸包括第二5' -侧翼区域和第二3' -侧翼区域。19. 根据权利要求1-18的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷 酸还包括连接到所述嵌合反义多核苷酸的3' -末端和/或5' -末端的功能部分。20. 根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分具有选自标记功 能、纯化功能和祀向递送功能的功能。21. 根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分经由可切割的接头 部分连接到所述嵌合反义多核苷酸。22. 根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分是选自脂质、肽和 蛋白质的分子。23. 根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、脂肪酸、月旨 溶性维生素、糖脂和甘油酯。24. 根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、生育酚和 生育三烯酚。25. 根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述肽选自受体配体片段和抗体 片段。26. 根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述蛋白质选自受体配体和抗 体。27. 根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸能够在 25摄氏度下在pH7. 2, IOOmM氯化钠、IOmM磷酸钠的缓冲液中与细胞转录产物杂交。28. 根据权利要求27所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心区域与所述嵌合反义多 核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物完全地互补。29. 根据权利要求27所述的嵌合反义多核苷酸，其中当所述嵌合反义多核苷酸与所述 嵌合反义多核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物杂交时，所述第二5' -侧翼区域和/或所 述第二3' -侧翼区域包括至少一个错配的碱基。30. 根据权利要求29所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第二5'-侧翼区域和/或所 述第二3' -侧翼区域的所有碱基都是错配的。31. -种双链反义试剂，所述双链反义试剂包括根据权利要求1至18和27至30中的 任一项所述的嵌合反义多核苷酸和退火至所述嵌合反义多核苷酸的互补链。32. 根据权利要求31所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述互 补链还包括连接到3' -末端和/或5' -末端的功能部分。33. 根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分具有独立地选自标记功 能、纯化功能和祀向递送功能的功能。34. 根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分经由可切割的接头部分 被独立地连接到所述嵌合反义多核苷酸和/或所述互补链。35. 根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分是独立地选自脂质、肽 和蛋白质的分子。36. 根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、脂肪酸、 脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。37. 根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、生育酚 和生育三烯酚。38. 根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述肽独立地选自受体配体片段和抗 体片段。39. 根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述蛋白质独立地选自受体配体和抗 体。40. 根据权利要求31所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述嵌 合反义多核苷酸能够在25摄氏度下在pH7. 2, IOOmM氯化钠、IOmM磷酸钠的缓冲液中与细胞 转录产物杂交。41. 一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反 义多核苷酸或根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂，和药物学上可接受的 载体。42. -种修饰细胞内转录产物的功能的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的 步骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利 要求31至40的任一项所述的双链反义试剂。43. -种改变细胞内的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括施用组合物至所述细 胞的步骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据 权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂。44. 一种改变细胞内的蛋白质结构的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步 骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利要 求31至40的任一项所述的双链反义试剂。45.-种用于治疗患者的方法，所述患者具有特征在于改变靶基因的表达水平、功能或 编辑的状况，所述方法包括：施用治疗上有效量的药物组合物至所述患者，所述药物组合物 包含： (a) 至少一种根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或至少一种根据 权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂；和 (b) 药物学上可接受的载体。
【专利摘要】公开了可用于借助于反义效应改变靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域它们自身的侧翼为第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸，所述第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂还包括退火至反义链的互补链。多核苷酸可用于修饰细胞内的RNA转录水平、miRNA活性或蛋白质水平。
【IPC分类】A61P43/00, A61K48/00, C12N15/09, A61K31/7088
【公开号】CN105008533
【申请号】CN201480012261
【发明人】横田隆德, 仁科一隆, 水泽英泽, 和田健
【申请人】国立大学法人东京医科齿科大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年3月3日
【公告号】CA2901983A1, WO2014132671A1