S331:首先，向步骤S32制得的捕获探针【原液浓度为lmg/mL】中加入10yL不同浓度(50、100、400、600、800、1000fmol/L)的高危型人乳头状瘤病毒目标DNA(以下简称目标DNA)和I OOyL的杂交缓冲溶液，42°C反应2h，磁力收集洗涤3次。
[0054]S332:然后，加入10yL步骤S31制得的显示探针和10yL的杂交缓冲溶液，42°C反应2h，磁力收集洗涤3次。
[0055]S333:最后，加入10yL的I3BS溶液，置于F-7000荧光光谱仪上测定荧光强度，结果见图6。
[0056]由图6可以看出:荧光强度与目标DNA浓度在O?lOOOfmol/L范围内呈良好的线性关系，回归方程为IF=0.1777[DNA](fmol/L)+10.551，(R2=0.9945)，最低检出限为5fmol/L。
[0057]本发明的检测不意图见图7。
[0058](实施例2?实施例6)
各实施例与实施例1基本相同，不同之处在于:目标DNA浓度为InM，捕获探针溶液的浓度分别为I.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.lmg/mL和0.05mg/mL。
[0059]荧光强度检测结果见图8。
[0060]由图8可以看出:0.5mg/mL的捕获探针浓度荧光强度最强，因此，0.5mg/mL的捕获探针浓度为高危型人乳头状瘤病毒检测的最佳浓度。
[0061 ](实施例7?实施例11)
各实施例与实施例1基本相同，不同之处在于:目标DNA浓度为InM，制备显示探针的氨基化娃纳米粒子溶液的浓度分别为lmg/ mL、2mg/ mL、3mg/ mL、4mg/ mL和5mg/ mL。
[0062]荧光强度检测结果见图9。
[0063]由图9可以看出:当娃纳米粒子浓度达到4mg/mL后，焚光强度趋于饱和，因此，4mg/mL的硅纳米粒子浓度为高危型人乳头状瘤病毒检测的最佳浓度。
[0064]
SEQUENCE LISTING〈110〉常州市妇幼保健院
〈120〉高危型人乳头状瘤病毒检测方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探针 〈160〉 4
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
catctgcaaa aaaata16
〈210〉 2
〈211〉 14
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 2
tcaacatccc aaaa14
〈210〉 3
〈211〉 15
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
gtcactaggc cgcca15
〈210〉 4〈211〉 15〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 4
aaaacttttc cttta15
【主权项】
1.一种高危型人乳头状瘤病毒检测方法，其特征在于具有以下步骤: S1:设计并合成特异性寡核苷酸序列;所述特异性寡核苷酸序列为下述Seql和Seq3、或者为下述Seq2和Seq4; Seql:5 ’-CATCTGCAAAAAAATA-B1tin-3 ’； Seq2:5 ’-TCAACATCCCAAAA-B1tin-3 ’；Seq3: 5 ’-NH2-GTCACTAGGCCGCCA-B1tin-3 ’ ； Seq4: 5 ’-NH2-AAAACTTTTCCTTTA-B1tin-3 ’ ； 上述Seql和Seq2为捕获DNA序列;上述Seq3和Seq4为显示DNA序列； 52:分别制备CdTe量子点、硅纳米粒子以及磁性纳米粒子； 53:将步骤SI中的显示DNA序列分别与CdTe量子点和硅纳米粒子结合得到显示探针;将步骤SI中的捕获DNA序列与磁性纳米粒子结合得到捕获探针;将待测样品先后与捕获探针以及显示探针混合，根据混合液的荧光强度判断待测样品中是否含有高危型人乳头状瘤病毒。2.根据权利要求1所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法，其特征在于:上述步骤S2中所述的CdTe量子点为亲和素化的CdTe量子点；上述步骤S2中所述的CdTe量子点的平均粒径为3?5nm;上述步骤S2中所述的娃纳米粒子为戊二醛交联的氨基化娃纳米粒子;上述步骤S3中所述的娃纳米粒子的平均粒径为90?I 1nm;上述步骤S2中所述的磁性纳米粒子为亲和素化的氨基化Fe3O4磁性纳米粒子;上述步骤S2中所述的磁性纳米粒子的平均粒径为45?50nmo3.根据权利要求1或2所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法，其特征在于:上述步骤S3中显示DNA序列的生物素化端与CdTe量子点结合，氨基化端通过戊二醛交联剂与硅纳米粒子结合。4.根据权利要求1所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法，其特征在于:上述步骤S3中娃纳米粒子的浓度为lmg/ mL?I Omg/ mL。5.根据权利要求1所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法，其特征在于:上述步骤S3中捕获探针的浓度为0.lmg/mL?lmg/mL。6.—种高危型人乳头状瘤病毒检测方法采用的寡核苷酸序列，其特征在于:为下述Seql和Seq3、或者为下述Seq2和Seq4; Seql:5 ’-CATCTGCAAAAAAATA-B1tin-3 ’； Seq2:5 ’-TCAACATCCCAAAA-B1tin-3 ’；Seq3: 5 ’-NH2-GTCACTAGGCCGCCA-B1tin-3 ’ ； Seq4: 5 ’-NH2-AAAACTTTTCCTTTA-B1tin-3 ’ ； 上述Seql和Seq2为捕获DNA序列;上述Seq3和Seq4为显示DNA序列。7.一种高危型人乳头状瘤病毒检测方法采用的寡核苷酸探针，其特征在于:包括捕获探针和显示探针;所述捕获探针由捕获DNA序列与磁性纳米粒子结合得到;所述显示探针由显示DNA序列分别与CdTe量子点和硅纳米粒子结合得到； 所述捕获DNA序列为下述Seql或者Seq2;所述显示DNA序列为下述Seq3或者Seq4; Seql:5 ’-CATCTGCAAAAAAATA-B1tin-3 ’； Seq2:5 ’-TCAACATCCCAAAA-B1tin-3 ’；Seq3: 5 ’-NH2-GTCACTAGGCCGCCA-B1tin-3 ’ ； Seq4: 5 ’-NH2-AAAACTTTTCCTTTA-B1tin-3 ’。8.根据权利要求7所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法采用的寡核苷酸探针，其特征在于:所述的CdTe量子点为亲和素化的CdTe量子点;所述的CdTe量子点的平均粒径为3?5nm;所述的娃纳米粒子为戊二醛交联的氨基化娃纳米粒子;所述的娃纳米粒子的平均粒径为90?I 1nm;所述的磁性纳米粒子为亲和素化的氨基化Fe304磁性纳米粒子;所述的磁性纳米粒子的平均粒径为45?50nmo9.根据权利要求7或8所述的高危型人乳头状瘤病毒检测方法采用的寡核苷酸探针，其特征在于:所述显示DNA序列的生物素化端与CdTe量子点结合，氨基化端通过戊二醛交联剂与娃纳米粒子结合。
【专利摘要】本发明公开了一种高危型人乳头状瘤病毒检测方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探针，包括设计并合成捕获DNA序列和显示DNA序列；分别制备CdTe量子点、硅纳米粒子以及磁性纳米粒子；将显示DNA序列分别与CdTe量子点和硅纳米粒子结合得到显示探针；将捕获DNA序列与磁性纳米粒子结合得到捕获探针；将待测样品先后与捕获探针以及显示探针混合，根据混合液的荧光强度判断待测样品中是否含有高危型人乳头状瘤病毒。本发明的检测方法具有操作简便、成本低、稳定性好、准确性高、灵敏度高等特点，克服了现有高危型人乳头状瘤病毒检测方法的不足，可作为一种快速、超灵敏的新型技术来检测人乳头状瘤病毒。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671206
【申请号】CN201610179679
【发明人】缪婷婷, 江华, 王周平, 虞斌, 董一善
【申请人】常州市妇幼保健院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月25日