核酸检测的制作方法

专利名称：核酸检测的制作方法
核酸检测
背景技术：
本发明涉及的领域，是从样品的核酸总体中检测和富集目标核酸，尤其是对含有突变的低丰度核酸的富集。
单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中最常见的变异类型。点突变也属于常见的SNP，不过"突变"这一术语通常用于指那些发生频率低于1%，并且/或者在该突变与某种疾病之间具有已知的相关性或有功能性联系的SNP (Gibson NJ， 2006临床化学学报(Clin ChimActa.)363(l-2):32-47)。已有多种用于多态性的基因分型和稀有突变检测的方法。稀有变异的检测对病理性突变的早期发现十分重要，尤其是在癌症中。例如，对临床样品中癌症相关的点突变的检测，能够促进化学疗法过程中微小残留病的鉴定以及对复发病人体内肿瘤细胞的发现。对于环境诱变剂的照射评价、内源性DNA修复的监测以及对老年人的体细胞突变积累的研究，稀有点突变的检测也同样很重要。此外，具有更高灵敏度的稀有变异检测方法，能为产前诊断带来革命性的变化，使得对母血中胎儿细胞的表征成为可能。已有大量方法被提出，但是还没有一个方法得到广泛的接受。很多用于检测基因组DNA中低频率突变的方法都采用聚合酶链式反应(PCR)来扩增突变的和野生型的目标核酸。用于分析PCR产物从而在野生型DNA背景中鉴定出突变型产物的方法有多种，包括序列测定、寡核苷酸连接、限制性酶切、质谱测定以及等位基因特异性杂交。其他方法则采用等位基因特异性PCR选择性地扩增低频率变异核酸，包括或不包括进一步的选择步骤。例如，通过用一种特异性切割野生型产物的限制性内切酶来消化PCR产物。由于PCR过程中等位基因特异性引物的总体特异性不足，从而造成假阳性现象，现行的方法存在着固有的局限性。其结果是所有的现行方法都在灵敏度和准确性方面有局限(综述参见Jeffreys AJ和May CA,2003基因组研究(Genome Res.) 13(10):2316-24)。
大多数突变检测系统得出的检测信号都很难定量为所检测到的突变分子数目。通过多样本分析来测定样品中含有的突变分子数目，可以部分地克服这一局限，其中每一样本包
含有限的DNA (典型地为50基因组当量)(digital PCR; Vogelstein和Kinzler 1999 ProcNatlAcadSciUS A. 96(16):9236-41)。然而，这一方法所需进行的大量PCR反应，以及PCR过程中核酸错误掺入导致的背景噪音升高，很可能使其灵敏度被限制在从1000个核酸分子中检出l个变异体这一水平上。很多突变检测方法的另一局限在于它们将突变位点替换为PCR引物序列并且产生短的扩增子，这些短扩增子包含的信息量即使有也极少，无法说明假定的突变型等位基因的存在(综述参见Jeffreys AJ和May CA, 2003)。
所有这些PCR方法在检测稀有变异方面的共同问题，就在于扩增过程中的复制失真。Jeffreys和May提出了一种在PCR分析之前从基因组DNA中富集突变DNA分子的解决方法，这一方法称为通过等位基因特异性杂交的DNA富集(DEASH) (Genome research 13:2316-2324， 2003)。该方法是对利用生物素化DNA探针进行杂交反应的传统核酸富集技 术的改进。它利用等位基因特异性的寡核苷酸，将由于单碱基置换而不相同的DNA分子分 开。然而，这一DNA富集方法包括多个步骤，需要大量的起始原料，并且存在低灵敏度和 低效率的问题。
还有一种基于限制性片段长度多态性(RFLP)的富集方法，其中PCR扩增产物被能 够选择性地消化正常的或突变的等位基因的限制性内切酶消化。富集PCR法是被引入到 RFLP分析的一种改进。这一方法的原理在于制造一个仅存在于正常序列的限制酶内切酶 位点，从而实现对第一个扩增步骤所扩增的正常等位基因的选择性消化。这样就在第二个 扩增步骤阻止了非突变DNA进一步扩增，同时随着后续扩增的进行，突变的等位基因得以 富集(美国专利5,741,678; Kahn等，1991)。然而，这一方法仅限于分析那些恰好位于天然 的限制性内切酶位点的突变。要克服这一局限，可以在点突变位点附近人工引入限制性内 切酶位点，以区别正常的和突变的等位基因。在这一方法中，用于PCR的引物中被引入了 碱基对置换，仅当引物位于某个特异性点突变两侧时，得到一个限制性内切酶位点。这一 方法能选择性地鉴定位于一个已知位点的点突变，据信适用于任何基因。
错配的3，端扩增是一种利用3'端被修饰过的引物的PCR技术，这种修饰的引物只能同 一种特异性的点突变匹配。这一方法的应用有赖于特定的条件，即允许从3'端与特异性错 配碱基互补的引物处延伸，而不允许野生型序列延伸。这一方法要求每一突变都有各自的 特异性引物，并且PCR条件十分严格。
最近还开发出了称为PNA (或LNA)钳式PCR的富集方法。利用高亲和性的核酸类似 物如肽核酸(PNA)来抑制核酸的扩增(美国专利5,891,625)。然而这类方法也有其问题。 很难找到应用PNA/LNA钳的理想条件；往往需要冗长的检测与重新设计过程，并且可能 需要购买专门的设备。此外，PNA价格昂贵、难以合成，并且抑制效率往往低下。
EP1061135涉及用一种探测引物从目标核酸序列中检测和鉴定序列变异的方法。该公 布涉及利用探测引物与目标核酸在错配发生处的诊断性错配。探测引物与目标序列杂交， 并被聚合酶延伸。探测引物的延伸效率通常被直接测定，作为目标核酸中序列变异的存在 和/或同一性的指标。
尽管如此，应当认为提供用于灵敏地富集和检测稀有点突变的新的方法和探针，将为 本领域作出贡献。
发明概述
本发明的方法考虑的是从核酸样本总体中快速、灵敏和更好地富集和检测目标核酸。 改进后的方法和探针同样考虑的是，从来自有遗传病或肿瘤的病人的样品中，快速、灵敏地检测核酸分子的遗传变异。
本发明的各方面描述于下列的方面、实施方案和权利要求中。
总的来说，本发明一方面提供了一种用于从一份样品的核酸总体中富集和/或检测含 有一段特殊的目标序列(例如至少一个变异的核苷酸)的核酸分子的方法，所述方法包括:
(a) 在杂交条件下用目标核酸序列第一链的一种第一富集引物和一种第一扩增引物 处理核酸总体，从而令所述引物与目标核酸第一链退火，使得所述扩增引物的3'端与所述 富集引物的5'端相邻或位于其上游；
其中所述富集引物的核苷酸序列与所述第一链上的一段诊断区域充分互补(例如 所怀疑的变异核苷酸所处位点和所述富集引物的3'末端核苷酸，与所怀疑的变异核苷酸或 相应的非变异正常核苷酸互补)，
(b) 将上述步骤(a)的混合物置于延伸条件(例如可以包含适当的核苷三磷酸和一 种核酸聚合酶，以及步骤(a)中所述引物的适当的反向引物)，
由此，退火的富集引物的延伸依赖于目标核酸中正常或突变的核苷酸的存在，所述富 集引物延伸产物的合成进而由此或者阻碍(与包含正常核苷酸的目标核酸杂交的)扩增引 物的延伸，或者促进富集引物(与包含变异核苷酸的目标核酸)的杂交和延伸。
简言之，在本发明的一个优选的实施方案中，扩增引物的延伸(以及此后的指数扩增) 由此依赖于富集引物的不延伸。未延伸的富集引物在延伸条件下将从目标核酸序列上解 离，从而允许扩增引物的延伸通过包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域，并有利于指数扩 增的发生。
在另一个实施方案中，上述步骤(a)中的核酸模板在杂交条件下形成一种茎-环结构， 其中双链的茎包含扩增引物结合位点而环则包含目标核酸序列，其中富集引物与环上的诊 断区域退火。在步骤(b)中，富集引物在与包含一个变异核苷酸的诊断区域退火时被延 伸；延伸打开了茎-环结构，从而允许扩增引物在杂交条件下与引物结合位点退火并促进 扩增，其中当富集引物与含有正常核苷酸的诊断区域退火时不能被延伸，茎-环结构由此 保持完整并阻止扩增引物与引物结合位点退火。
如此在两个实施方案中都有两种不同的富集引物， 一种在与包含一个正常核苷酸的诊 断区域退火时被延伸，另一种在与包含一个变异核苷酸的诊断区域退火时被延伸。
在两个实施方案中，变异序列的优先扩增都依赖于一个而不是另一个富集引物的延伸。
然而，在第一个实施方案中，最终导致变异序列优先扩增的是"正常"富集引物的延伸 (通过阻碍与"正常"目标核酸退火的扩增引物的延伸)，如图l中的例子所示。在第二个实施方案中，最终导致变异序列优先扩增的是"变异"富集引物的延伸(通过 只允许与"变异"目标核酸退火的扩增引物的延伸)，如图ll中的例子所示。
优选地，富集引物自身的延伸产物被设计为不适合指数扩增，例如通过掺入一个适当 的部分或由于其自身的序列(可自我折叠从而阻止引物退火)，而令富集引物不适合复制。
如下所述，可以通过多种方式令退火的富集引物的延伸依赖于正常或变异核苷酸在目 标核酸中的存在。
例如，在引物的3'末端可以包括一个与正常或野生型序列互补的核苷酸。这为引物的 延伸所必需。在本文中认为，本发明的任何方面或权利要求中提到"3'末端核苷酸"或"3'
末端"处，可同样适用于与末端核苷酸足够接近，从而能实现相同效果——即在相应引物 与互补或非互补的诊断部位退火时，分别允许或阻止延伸——的非末端核苷酸。不过，上
述非末端核苷酸典型地只与末端相距l、 2或3个核苷酸。
例如，在引物的3'末端可以包括一个与正常或野生型序列非互补的阻碍核苷酸。然后 应用能基于这一错配而去除该末端核苷酸的条件(例如校正聚合酶)，排除阻碍效应从而 允许延伸进行。
例如，在引物的3'末端可以包括一个与正常序列互补的阻碍核苷酸。然后应用能去除 该末端核苷酸的条件(例如焦磷酸解作用)，排除阻碍效应从而允许延伸进行。
另一方面，本发明提供了一种检测目标核酸的方法，其中所述检测用一种桥探针作为 媒介，该桥探针包括经由一个桥接部分连接的至少两个结合部分，其中第一结合部分能与 一个核酸模板的一段第一区域杂交，其中第二结合部分能与该核酸模板上与该第一区域相 邻或充分相邻的一段第二区域杂交，其中该核酸模板的该第一区域包括所怀疑的变异核苷 酸。
根据所述桥接部分的长度和/或组成，以及所述核酸模板的第一区域和第二区域之间 的分离程度(若有)，可以计算出单独的结合部分的Tm (熔解温度)和/或桥探针的Tm， 并且本领域的技术人员按照本发明的公开内容可以方便地选择和修改这些变量，例如利用 常规的软件。
一种核酸模板的第一区域可以是一个引物延伸产物上延伸的目标序列的一部分，其中 所述第二区域是一种扩增引物或一种探针的一个部分。
在使用中，根据目标核酸包括的是互补的还是非互补的核苷酸，桥探针的一个结合部 分在不同的熔解温度下与目标核酸杂交。测量温度并作为所怀疑的变异核苷酸是否存在的 指征。上述桥接部分包括至少一个核苷酸或至少一个非核苷酸的化学部分。
上述桥探针和/或引物或探针可以包含检测标记物。上述第一结合部分与一个或多个 第一标记物相联，上述第二结合部分与一个或多个第二标记物相联，其中所述第一标记物 和第二标记物为接触淬灭对(contact quenching pair)，其中一种标记物为淬灭剂，其中当 探针与目标序列杂交时，第一和第二标记物处于接触淬灭关系。或者，上述第一结合部 分与一个第一标记物相联，上述第二结合部分与一个第二标记物相联，其中所述第一标记 物和第二标记物为荧光能量转移对，其中当探针与目标序列杂交时，第一和第二标记物处 于荧光共振能量转移(FRET)关系。
上述第二结合部分和引物上能与桥探针的该第二结合部分杂交的部位，可以分别与荧 光基团与淬灭剂对的一个成员相联，由此当桥探针与目标序列杂交时，上述荧光基团与淬 灭剂处于接触淬灭关系。上述淬灭剂优选地为非荧光体。上述淬灭剂可以是纳米粒子。上 述淬灭剂可以是鸟苷酸(G)残基或多聚G残基。
本发明还提供了一种分析一份生物样品中目标DNA序列的方法，所述方法包括步骤
(a) 向所述生物样品中加入有效量的扩增引物和一种核酸探针， 其中所述扩增引物之一和所述探针分别被一种荧光基团和一种淬灭剂其中之一标记，
由此当探针与包含所述标记的扩增引物的扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接 触淬灭关系；
(b) 用一种扩增方法扩增目标核酸序列；
(c) 用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及
(d) 检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。
总的来说，标记的探针与所述引物的扩增产物在距所述引物足够近处杂交从而实现荧 光的接触淬灭，本领域的技术人员能根据被标记的位点，例如引物附近的和/或部分地与 引物自身杂交的紧邻的延伸区域内，相应地跟踪到探针。典型地，5个或更少的(例如0、 1、 2、 3或4个)核苷酸将所述探针的近端与延伸扩增产物的引物的"末端"分隔开。
在另一个实施方案中， 一种分析一份生物样品中目标DNA序列的方法包括步骤
(a) 向所述生物样品中加入有效量的扩增引物和两种可与目标序列上相邻区域杂交 的核酸探针，
所述探针一种被一个接触淬灭对的一种荧光基团标记，另一种被相应的淬灭剂标记， 由此当所述探针与目标序列的扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭关 系，其中所述荧光基团与淬灭剂彼此相距5个核苷酸以内；
(b) 用一种扩增方法扩增目标核酸序列；
(c) 用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及
(d) 检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。上述方法还可进一步包括测定探针与目标核酸双链体熔解曲线的步骤。优选地，所述 核酸探针之一为一种桥探针，该桥探针包括经由一个桥接部分连接的至少两个结合部分， 其中第一结合部分能与一种核酸模板(在此即目标序列的扩增产物)的一段第一区域杂交， 其中第二结合部分能与该核酸模板上与该第一区域相邻或充分相邻的一段第二区域杂交， 其中所述桥接部分包括至少一个核苷酸或至少一个非核苷酸的化学部分，该核苷酸或化学 部分不能与所述核酸模板杂交，其中所述桥接部分的长度和/或组成，是决定单独的结合 部分的Tm和/或桥探针的Tm的因素之一，其中该核酸模板的该第一区域包括所怀疑的变异 核苷酸。
本发明还提供了相关的方法和材料(例如试剂盒和探针)。
下述各实施方案和权利要求(包括从属权利要求)的所有组合，在作必要的修正后均 适用于本发明如上所述的各方面。
附图概述
图l为本发明的一个实施方案的示意图，显示一种富集引物与一段诊断区域的退火， 其中富集引物的3'末端核苷酸(T，胸腺嘧啶核苷)与目标序列上诊断区域的正常核苷酸 (A，腺嘌呤核苷)相匹配，而与变异的核苷酸(C，胞嘧啶核苷)不匹配。退火的富集 引物在包含正确核苷酸的正常模板上得到延伸，并阻碍从上游的扩增引物处的延伸。退火 的富集引物在包含变异核苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而允许上游的扩增引 物延伸通过诊断区域。富集引物的延伸产物能以线性方式被部分地复制，而扩增引物的延 伸产物能得到指数扩增。
图2为本发明的一个实施方案的示意图，显示一种富集引物与一段诊断区域的退火， 其中富集引物的3，末端被一个磷酸基团封闭的核苷酸(G，鸟嘌呤核苷)，与诊断区域的 变异核苷酸(C，胞嘧啶核苷)相匹配，而与正常的核苷酸(A，腺嘌呤核苷)不匹配。 在包含正确核苷酸的正常模板上，退火的富集引物末端的G被一种DNA聚合酶的校正活性 去除，富集引物得到延伸，从而阻碍上游扩增引物的延伸。退火的富集引物在包含变异核 苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而允许上游的扩增引物延伸通过诊断区域。富 集引物的延伸产物能以线性方式被部分地复制，而扩增引物的延伸产物能得到指数扩增。
图3为本发明的一个实施方案的示意图，显示一种富集引物与一段诊断区域的退火， 其中富集引物的3'末端核苷酸(ddT，双脱氧胸苷单磷酸)与诊断区域的正常核苷酸(A， 腺嘌呤核苷)相匹配，而与变异的核苷酸(C，胞嘧啶核苷)不匹配。与包含正确核苷酸 的正常模板退火的富集引物，在其末端的T残基被一种DNA聚合酶的焦磷酸解活性去除之 后得到延伸，其中该富集引物的延伸产物阻碍上游扩增引物的延伸。退火的富集引物在包 含变异核苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而允许上游的扩增引物延伸通过诊断区域。富集引物的延伸产物能以线性方式被部分地复制，而扩增引物的延伸产物能得到指 数扩增。
图4为本发明的一个实施方案的示意图，显示一种富集引物与一段诊断区域的退火， 其中富集引物的3'末端核苷酸(T，胸腺嘧啶核苷)与目标序列上诊断区域的正常核苷酸 (A，腺嘌呤核苷)相匹配，而与变异的核苷酸(C，胞嘧啶核苷)不匹配。
与包含正确核苷酸的正常模板退火的富集引物，在包含至少一种修饰的脱氧核苷三磷 酸的延伸条件下得到延伸。延伸链内的富集引物被5'核酸外切酶活性所降解，而(包含修 饰的脱氧核苷三磷酸的)延伸链能抗这种裂解作用，由此阻碍上游扩增引物的延伸。
退火的富集引物在包含变异核苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而允许上游 的扩增引物延伸通过诊断区域。
(被部分降解的)富集引物的延伸产物能以线性方式被部分地复制，而扩增引物的延 伸产物能得到指数扩增。
图5为本发明的一个实施方案的示意图，显示一种包含5'端尾序列的富集引物。该5' 端尾序列与目标序列第二链的第二扩增引物序列相同或充分相同，该第二链与目标序列的 第一链互补，而富集引物和第一扩增引物能够与该第一链退火。上述富集引物与一段诊断 区域退火，其中富集引物的3，末端核苷酸(T，胸腺嘧啶核苷)与目标序列上诊断区域的 正常核苷酸(A，腺嘌呤核苷)相匹配，而与变异的核苷酸(C，胞嘧啶核苷)不匹配。 退火的富集引物在包含正确核苷酸的正常模板上得到延伸；该延伸链阻碍从上游的扩增引 物处的延伸。退火的富集引物在包含变异核苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而 允许上游的扩增引物延伸通过诊断区域。当富集引物的延伸产物被置于变性和杂交条件下 时，折叠形成一种封闭了第二扩增引物结合位点的茎-环结构，而扩增引物的延伸产物能 得到指数扩增。
图6说明的是各种桥探针与目标核酸的杂交。(A)当一种桥探针与目标核酸杂交时， 该桥探针的两端互相指向对方。该桥探针的两端与不同的标记物相联。当该桥探针与目标 核酸杂交时，导致上述两个标记物位置紧邻。(B)当一种桥探针与目标核酸杂交时，该 桥探针的两端指向同一方向。该桥探针与两种标记物相联。当该桥探针与目标核酸杂交时， 导致上述两个标记物位置紧邻。(C)当一种桥探针与目标核酸杂交时，该桥探针的两端 指向互相背离。两个结合部分带有不同的标记物。杂交导致上述两个标记物位置紧邻。(D) 两个结合部分与目标核酸杂交，其中目标核酸上与第一结合部分杂交的区域和与第二结合 部分杂交的区域相隔一段距离。(E)桥探针与标记物l相联，另一探针与标记物2相联。 当这两种探针与目标核酸杂交时，上述两种标记物位置紧邻。(F)两种核酸探针与目标 序列上相邻区域杂交，所述探针一种被一个接触淬灭对的一种荧光基团标记，另一种被相 应的淬灭剂标记，由此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬
16灭关系。(G)、 (H)和(I)扩增引物和一种可以为桥探针的核酸探针分别被荧光基团与淬灭剂 对的一个成员标记，由此当探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭 关系。
图7说明的是本发明提供的用于富集和检测样品中点突变的一种方法的一个典型反 应。该反应中， 一种第一扩增引物和一种富集引物与目标核酸的第一链退火； 一种第二扩 增引物和一种桥探针与目标核酸的第二链退火，该第二链与目标核酸的第一链互补。上述 富集引物与一段诊断区域退火，其中富集引物的3'末端核苷酸(T，胸腺嘧啶核苷)与目 标序列上诊断区域的正常核苷酸(A，腺嘌呤核苷)相匹配，而与变异的核苷酸(C，胞 嘧啶核苷)不匹配。上述桥探针的第一结合部分，与目标核酸的第二链上的诊断区域退火， 其中该诊断区域包含一个所怀疑的变异核苷酸。上述桥探针的第二结合部分与上述目标核 酸第二链上诊断区域相邻的一段目标区域退火，并且该退火的目标区域与同上述富集引物 序列充分相同的目标核酸区域不重叠或只有有限的重叠。也就是说，上述桥探针和富集引 物之间没有或只有有限的互补性，从而避免二者相互退火。上述桥探针带有标记物，并在 与目标核酸杂交或从目标核酸上解离时产生一种可检测的信号。上述桥探针可用于扩增和 富集时的实时检测，或者也可用于终点检测时的熔解曲线分析。上述桥探针的第一结合区 域在不同的熔解温度下与完全匹配的目标核酸或错配的目标核酸杂交，熔解温度被测量并 作为所怀疑的变异核苷酸是否存在的指征。
图8说明的是一种利用一组桥探针扫描未知突变的方法。
图9显示对实施例2和3中桥探针进行熔解曲线分析的结果。


图10显示利用一种桥探针来检测一个SNP或点突变。
图ll说明的是一种利用一种富集引物和扩增引物富集和域检测目标核酸的方法；所 述目标核酸能够形成一种茎-环结构。
图12显示带有5'尾序列的扩增引物。(A)通过延伸一种带有5'尾序列的第一扩增引 物，得到能形成茎-环结构的核酸模板。上述5'尾序列由与第二扩增引物结合位点互补的核 苷酸或非核苷酸序列组成。也就是说，上述5'尾序列包含与第二引物序列相同或充分相同 的核苷酸或非核苷酸序列。上述第一和第二扩增引物能分别与上述第二和第一扩增引物的 延伸产物杂交。(B)通过延伸带有相同5'尾序列的第一和第二扩增引物，得到能形成茎-环结构的核酸模板。上述5'尾序列由与一种第三扩增引物结合位点互补的核苷酸或非核苷 酸序列组成。也就是说，上述5，尾序列包含与所述第三引物序列相同或充分相同的核苷酸 或非核苷酸序列。上述第三引物可以是任意一种与目标序列无关的通用引物。(C)显示 一种与(B)图中类似的结构，不过该结构中还包括一种与目标核酸第二链上诊断区域退 火的第二富集引物。发明详述
本发明指向从混合的核酸总体中检测和富集目标核酸的灵敏的和改进的方法和探针， 所述方法和探针应用于检测和监控试样中基因表达或稀有突变的化验中。
I.材料
A. 样品中的目标核酸
样品是指任何包含或推测包含核酸的物质，包括从一个或多个个体分离得到的组织或 液体样品。本文所用术语"核酸"、"多聚核苷酸"和"寡核苷酸"是指引物、探针、待检测的 寡聚体片段、寡聚体对照以及未标记的阻碍寡聚体，并应属于(包含2-脱氧-D-核糖的)多 聚脱氧核苷酸，属于(包含D-核糖的)多聚核糖核苷酸，以及属于作为一种嘌呤或嘧啶碱 基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任意其他类型的多聚核苷酸。本文所用术语"核 酸"、"多聚核苷酸"和"寡核苷酸"在长度方面并无有意的区别，并且上述术语可以互相替换 使用。上述术语指的仅是分子的一级结构。因此，上述术语既包括双链和单链DNA，也包 括双链和单链RNA。寡核苷酸包含由约至少6个核苷酸构成的一段对应于指定核苷酸序列 上一段区域的序列，优选至少10至12个核苷酸，更优选至少15至20个核苷酸。
本文所用术语"目标序列"或"目标核酸序列"是指有待扩增或检测或二者皆是的一段 区域。目标序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸。目标序列可以是RNA、 cDNA、 基因组DNA或者来自致病的微生物或病毒的DNA。目标序列还可以是经化学试剂、各种 酶类以及物理暴露处理过的DNA。 一份样品中令人感兴趣的目标核酸序列可以以单链 DNA或RNA，如cDNA、 mRNA、其他RNA，或以解离的互补链的形式存在。可以通过物 理的、化学的或酶学的方法实现目标核酸互补链的解离。
B. 引物
本文所用术语"引物"是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当被置 于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始点， 其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和缓 冲条件。引物优选地为单链，以获得最高的扩增效率，但也可以是双链的。引物的长度必 须足以在诱发试剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于多种因素，包括 温度、引物的来源以及方法的用途。
本文所用涉及核苷酸的术语"与......互补"是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸
碱基配对。即腺苷三磷酸与尿苷三磷酸或胸苷三磷酸互补，鸟苷三磷酸与胞苷三磷酸互补。 根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷三磷酸与鸟苷三磷酸可以碱基配 对，不应将它们视为互补的。根据本说明书的目的同样应当认为，尽管在某些情况下胞苷三磷酸与腺苷三磷酸可以碱基配对，也不应将它们视为互补的。此原理同样适用于胞苷三 磷酸与尿苷三磷酸之间。
本文中的引物是经过选择从而与待扩增的各特异性序列的不同链"充分"互补的。也就 是说引物与它们各自的对应链必须充分互补以能与之杂交。因此，引物序列不必反映模板 的精确序列。例如，当富集引物包含一段3'末端核苷酸与所怀疑的变异核苷酸或相应的 正常核苷酸互补的核苷酸序列，所述引物的5'端可以与一段非互补的核苷酸片段相联，同 时所述引物序列的其余部分与目标碱基序列的诊断部位互补。不过，引物通常具有精确互 补性，除非非互补的核苷酸如上文所述那样位于一个预先确定的引物末端。
但是应当认为，在某些情况下，引物延伸产物的合成即使在一个非互补的3'末端残基 存在时也可能被诱发。这种假性结果可以由过低的退火/孵育温度(此种情况下可提高所 述温度)、过长的孵育/退火时间(此种情况下可减少所述时间)、过高的盐浓度(此种 情况下可降低所述盐浓度)、过高的酶或核苷三磷酸浓度、不适当的pH值，或者不适当的
寡核苷酸引物长度引起。通过有意地再引入一个或多个错配的残基，或者在需要时在诊 断引物内引入缺失或插入，而进一步减弱杂交时的结合以令所述引物不稳定，可以避免假 性结果。
本文所用术语"富集引物"是指具有一段与所怀疑的变异核苷酸所处的诊断区域充分 互补的核苷酸序列的引物。当一种富集引物与目标序列退火时，它可依赖于所怀疑的变异 核苷酸是否存在而被延伸或不被延伸。在一个实施方案中，当与包含所怀疑的变异核苷酸 的诊断区域退火时，退火的富集引物可以是不可延伸的，所述富集引物由此在延伸条件下 从目标核酸上解离，从而允许扩增引物的延伸通过包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域。 当与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火时，退火的富集引物得到延伸从而合成富集引 物延伸产物，上游扩增引物的延伸由此被富集引物延伸产物所阻碍。在另一个实施方案中，
核酸模板在杂交条件下形成一种茎-环结构。双链的茎部分包含扩增引物结合位点；环包 含目标核酸序列。富集引物与环上的诊断区域退火。当与包含变异核苷酸的诊断区域退 火时，所述富集引物得到延伸，延伸打开了茎-环结构，从而允许扩增引物与引物结合位 点退火并促进扩增。当与包含正常核苷酸的诊断区域退火时，所述富集引物不能被延伸， 茎-环结构由此保持完整并能阻止扩增引物与引物结合位点退火。
优选地，富集引物的一个末端核苷酸为经过选择，从而与所怀疑的变异核苷酸或相应 的正常核苷酸之一互补的，由此当所述富集引物与包含一个特定核苷酸的诊断区域退火 时，所述富集引物的延伸产物得到合成，而当所述富集引物与不包含目标核酸序列的该特 定核苷酸的诊断区域退火时，所述延伸产物不被合成。
本文所用术语"诊断区域"是指目标核酸序列上其存在与否有待检测的区域，所述区域 包含作为其末端核苷酸或内部核苷酸的潜在的变异核苷酸。应当认为，术语"变异核苷酸"、 "正常核苷酸"或"突变核苷酸"的使用是视情况而定的，并且可以是可相互替换的。在一种情况下， 一个核苷酸可以被称为变异核苷酸或者突变核苷酸，而在另一种情况下，它可以 被称为正常核苷酸。
富集引物可以包含令所述富集引物的延伸产物不适合指数扩增的部分(化学基团)。 在一个实施方案中，所述部分可以是一个阻碍部分(或者称为不可复制部分)，其中所述 富集引物的全部或部分的复制被阻碍，由于缺乏引物结合位点，由所述富集引物延伸链模 板产生的引物延伸分子由此不适合作为进一步引物延伸的模板。所述阻碍部分可以是碳氢 化合物臂、羟乙基鸟嘌呤(hydroxyethylguanine， HEG)、非核苷酸连接、碱基核糖(abasic ribose)、核苷酸衍生物或者染料。所述阻碍部分可以位于距富集引物3，末端18个核苷酸 以内处。优选地，所述阻碍部分可以位于距富集引物3'末端6个核苷酸以内处。更优选地， 所述阻碍部分可以位于距富集引物3'末端3个核苷酸以内处。
本发明所公开方法中所用的引物包含一段与目标序列互补的3，序列，所述3，序列通常 用于引发延伸反应。引物的这一部分被称为富集引物的3'引发部分。在另一个实施方案中， 富集引物可以在引发部分的5'处包含与目标序列互补或不互补的额外序列；该额外序列被 称为尾。在一个实施方案中，富集引物包含一段与所述富集引物延伸产物上的引物结合位 点互补或充分互补的5'尾序列。所述富集引物延伸产物当被置于变性和杂交条件时，折叠 形成一种阻碍进一步的引物结合的茎-环结构。
所述富集引物可以是由天然核苷酸和磷酸二酯键构成的常规寡核苷酸，也就是说，它 不包含非核苷酸、连接性化学部分或者修饰的核苷酸。在上述实施方案中，富集引物的部 分或全部可以被核酸酶活性降解。当与目标核酸上包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火 时，所述富集引物在包含至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸的延伸条件下，被一种带有5'核 酸外切酶活性的DNA聚合酶延伸。富集引物的部分或全部被所述5'核酸外切酶活性降解， 而延伸链的部分或全部能抗这种裂解作用(图4)。
在一个实施方案中，通过将富集引物设计成具有一个与正常核苷酸互补的适当的末端 核苷酸，从而令富集引物延伸产物的合成阻碍上游扩增引物的延伸，实现对一种给定的核 苷酸变异，如一个点突变的富集和检测。当富集引物与包含变异核苷酸的诊断区域退火时， 该富集引物错配的3，端不能被延伸，并在延伸条件下使得富集引物从模板上解离。有鉴于 此，本文中提到的"适当的末端核苷酸"，是指引物上在使用中可能的合成会从其处启始的 末端核苷酸。因此，由于用于聚合反应的试剂通常会在引物的3'端启始合成，适当的末端 核苷酸也就通常是3'末端核苷酸。为了防止富集引物的3'末端核苷酸或其他核苷酸被核酸 酶活性消化，富集引物可以包含能令其全部或部分抗核酸酶裂解的修饰的核苷酸或键。优 选地，在3'端和/或5，端的最后5个核苷酸或键是经修饰的，以令富集引物能抗核酸酶裂解。 更优选地，3'端和/或5'端的最后一个核苷酸或键是经修饰的，以令富集引物能抗核酸酶裂 解。能令引物抗核酸酶裂解的任何一种修饰都可以被使用。
例如硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、LNA、 PNA、低聚-2'-氧甲基-核苷酸
20(01igo-2'-OMe-nucleotides )或类似物。
在另一个实施方案中，通过将富集引物设计成具有一个与所怀疑的变异核苷酸互补的适当的末端核苷酸，实现对一种给定的核苷酸变异的富集和检测。此种情况下，所述富集引物的3'末端核苷酸经过修饰，从而不适合聚合酶的延伸，由此与包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域退火的富集引物为不可延伸的。当所述富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火时，该富集引物错配的3'末端核苷酸被一种核酸聚合酶的校正活性去除，从而令所述富集引物可被延伸。在另一个实施方案中，富集引物具有一个与诊断区域的正常核苷酸互补的、被封闭的3'末端核苷酸。当与模板上的正常核苷酸匹配时，被封闭的3'末端核苷酸被一种酶的焦磷酸解活性去除，所述酶优选为一种DNA聚合酶。富集引物3'端的封闭可以通过本领域已知的任何方法实现。封闭部分为能被加到核酸上从而抑制由核酸聚合酶催化的核酸聚合反应的化学部分。封闭部分典型地位于富集引物由核苷酸或其衍生物构成的3'末端。例如，通过将一个封闭基团与末端的3'羟基相联，该3'羟基在聚合反应中就不再能接受核苷三磷酸。大量不同基团都能被用于封闭富集引物的3'端。这些基团的例子包括烷基、非核苷酸连接、硫代磷酸酯、烷二醇残基、肽核酸和缺少3'羟基的核苷酸衍生物(例如蛹虫草菌素、双脱氧核苷酸或乙酰化核糖核苷酸)。
本文所用术语"第一扩增引物"是指能与富集引物上游的目标序列杂交并被用于扩增的引物。当在一个反应中用到第一和第二"扩增引物"时，该扩增引物对扩增一段跨越诊断区域的目标区域。 一种"扩增引物"具有的一段核苷酸序列使其能在与其互补体分离后，与另一种扩增引物的延伸产物杂交，由此一种引物延伸产物就作为了另一扩增引物的延伸产物的合成模板。当两种不重叠的不同寡核苷酸与同一条线性互补的核酸序列上不同区域退火，并且其中一种寡核苷酸的3，端指向另一种的5，端时，前者称为"上游"寡核苷酸而后者称为"下游"寡核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，能形成茎-环结构的核酸模板可以通过延伸一种带有5'尾序列的第一扩增引物而得到。上述5，尾序列由与第二扩增引物结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列组成。也就是说，上述5'尾序列包含与第二引物序列相同或充分相同的核苷酸或非核苷酸序列。上述第一和第二扩增引物能分别与上述第二和第一扩增引物的延伸产物杂交。或者，能形成茎-环结构的核酸模板，可以通过延伸带有相同5'尾序列的第一和第二扩增引物而得到。上述5，尾序列由与一种第三扩增引物结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列组成。也就是说，上述5'尾序列包含与第三引物序列相同或充分相同的核苷酸或非核苷酸序列。上述第三引物可以是任意一种与目标序列无关的通用引物。
富集引物或扩增引物可以是标记的寡核苷酸。本文所用术语"标记物"是指任何一种能被用于提供一种可检测的(优选为可以计量的)信号，并能与核酸或蛋白质相联的原子或分子。标记物提供的信号可以通过荧光、放射性、比色法、重量分析、磁性、酶活性以及类似途径检测。在一个实施方案中，本发明指向富集同一个样品中一种以上的所怀疑的变异核苷酸。 此种情况下，可以在一个反应中包括一种以上靶向不同的SNP或突变的富集引物。
B.探针
本文所用术语"探针"是指基于其自身至少一段序列与模板核酸的一段模板序列之间 的互补性，而能与模板核酸的一段序列形成一种双链结构的标记的寡核苷酸。探针通常不 包含与用于引发扩增的序列互补的序列。不过在本发明的一些实施方案中，探针的确包含 与引物的一个部分互补的序列。通常所述探针的3'末端为"封闭的"，以阻止探针掺入到引 物延伸产物中。不过在本发明的一些实施方案中， 一些探针同时还作为引物起作用，因此 所述探针的3'末端为未封闭的。"封闭"可以通过使用非互补的碱基或通过将一个化学部分， 如生物素或磷酸基团，添加到最后一个核苷酸的羟基上来实现。依赖于所选择的部分，所 述化学部分还可以作为一种用于后续检测或者捕获与之相联的核酸的标记物，而起到双重 作用。封闭还可以通过去除3'-羟基或使用缺少3'-羟基的核苷酸如双脱氧核苷酸而实现。
本发明的各种探针可以被联合使用。使用的探针优选为一种桥探针。桥探针包括经由 一个桥接部分连接的至少两个结合部分，其中第一结合部分能与一种核酸模板的一段第一 区域杂交，其中第二结合部分能与该核酸模板上与该第一区域相邻或充分相邻的一段第二 区域杂交。
本文所用术语"相邻"或"充分相邻"是指在所述与其互补的核酸模板链上，所述第二结 合部分相对于所述第一结合部分的位置。与桥探针的第一和第二结合部分杂交的两段模板 区域可以是连续的，即在两段模板区域之间没有间隔。或者，与桥探针的第一和第二结合 部分杂交的两段模板区域可以被1至约200个核苷酸间隔开，更优选约1至100个核苷酸。或 者，当本方法如本文曾述及那样被用于PCR富集和检测方法时，"相邻性"可以存在于待扩 增序列内的任何地方，或者扩增引物下游的任何地方。
一种核酸模板的第一区域可以是一种目标核酸上所感兴趣的一段区域，所述区域可以 是包括所怀疑的变异核苷酸的一段诊断区域(图6A、 B、 C、 D)。或者， 一种核酸模板 的第一区域可以是一种引物延伸产物上的一段区域，其中第二区域是一种引物或探针的一 部分(图6G、 H)。另一方面， 一种核酸模板的第一区域和第二区域可以都是一种引物或 探针的部分(图61)。
桥接部分在探针上位于结合部分之间。桥接部分可以包含一个核苷酸或非核苷酸的化 学部分，并可以为任意长度。然而，对于模板核酸的第一区域和第二区域之间一段给定的 间隔距离，桥接部分的长度和/或组成能够调节单独的结合部分的Tm或者作为一个连接的 分子的桥探针的Tm。按照定义，熔解温度(Tm)是指当一半的DNA双链体解离成为单链 时的温度，是双链体稳定性的一种指征。桥接部分包括一些不适合作为DNA聚合酶的模板 的非核苷酸化学部分是有利的，因为如此可以减少非特异性的延伸启始。 一些化学部分还可以是更具柔韧性的，也就是说不具有如天然核苷酸连接一样的刚性，并且因此易于折叠 并可能提高低Tm的结合部分实际的Tm值。这类非核苷酸部分可以包括但不限于HEG、非 核苷酸连接、核苷酸衍生物或类似物，或者染料。桥接部分不仅连接两个结合部分，还调 节着桥探针，尤其是桥探针的具有较低Tm的那个结合部分的结合特性。通常，当一个结 合部分具有比另一个结合部分更高的Tm时，这两个结合部分被视作单独的分子。桥接部 分的长度会影响结合部分，尤其是具有较低Tm的结合部分与模板退火或解离的温度。依 赖于与桥探针的两个结合部分杂交的模板核酸的两段区域之间的距离，作为一个连接的分 子的桥探针，如同当被视为单独分子时的结合部分一样，当桥接部分的长度同与桥探针的 两个结合部分杂交的两段模板区域之间的距离在长度上接近时，通常具有较高的Tm值。 这一规律只可用于与桥探针的两个结合部分杂交的两段模板区域之间的距离不很长，尤其 不超过200个核苷酸的情况下。出于此种考虑，桥接部分的长度范围可以在0至200个核苷 酸或相当物之间，更优选约1至1 OO个核苷酸或相当物之间。
与桥接部分的两端相联的结合部分被设计为能与目标核酸的一段特异性序列形成一 种稳定的特异性杂交体。结合部分可以为所需要的任何长度，通常优选为2至60个核苷酸 长度，最优选为6至40个核苷酸长度。结合部分可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、类似物 或非核苷酸的化学部分。
结合部分可以与一段特异性的目标核酸序列互补，并可以被设计成对一个基因座位处 的某一特定突变具有特异性。优选地，至少一个结合部分(第一结合部分)与所怀疑的变 异核苷酸所处的一段诊断区域互补。两个或更多的结合部分与各自包含一个变异核苷酸的 多个诊断区域互补也同样是可取的。
在本发明的使用中， 一种桥探针的不同结合部分可以同时与一段互补的核酸退火。或 者，每个结合部分可以被设计成具有不同的杂交特性，尤其当与匹配或错配的目标核酸杂 交时。出于更好地理解本发明的内容考虑，为每一结合部分定义了两种不同的熔解温度 (Tm)。当每一结合部分被视为一段单独的寡核苷酸时的熔解温度为Tm-s;当一种桥探 针的结合部分被视为一个连接的分子时的实际熔解温度为Tm-p。对于一个结合部分的一段 给定序列，其Tm-s为不变的常数，而其Tm-p部分地依赖于桥接部分的长度和/或组成。当 与一个适当的桥接部分搭配时， 一个结合部分的Tm-p通常高于其Tm-s。这对检测点突变 或单个核苷酸的差异非常有用。
在一个实施方案中，第一结合部分与一段包含一个所怀疑的变异核苷酸的诊断区域杂 交，同时第二结合部分与邻近所述诊断区域的一段区域杂交。所述第二结合部分的Tm-s 被设计为高于所述第一结合部分的Tm-s。设计具有不同Tm的寡核苷酸涉及的知识为本领 域所熟知。例如，具有较高G/C含量的一段较长的寡核苷酸可以具有较高的Tm。由于具有 较高的Tm-s，所述第二结合部分将会在较高的退火温度下首先与目标核酸退火。由于所述 第一结合部分通过一个适当的桥接部分与所述第二结合部分相连接，该第一结合部分的 Tm-p要高于其Tm-s。例如，如果一种桥探针的第二结合部分具有65t:的Tm-s，该桥探针的第一结合部分具有较低的36'C的Tm-s，该第一结合部分实际的Tm-p则有可能为55'C。 由于具有较低的Tm-s，所述第一结合部分通常长度较短。将所述第一结合部分设计为长度 较短的是有利的，由此可以得到较低的Tm-s，而Tm-p则较高。在别的探针设计中，探针 在具有适当的较高Tm时，却可能会失去或只有有限的识别单个核苷酸差异的能力，与此 不同的是，本发明的探针设计具有识别单个核苷酸差异的强大能力。所述第一结合部分在 宽范围的不同Tm-p下与匹配或错配的诊断区域杂交，这可以容易地观察到。如前述例子， 所述第一结合部分可以在55"C时与一段匹配的诊断区域杂交，而在50'C时与错配的诊断区 域杂交，温度上的这种差异可以很容易地加以区别。
可能促进探针结合的对所述探针的改进包括但不限于向所述探针中掺入带正电荷的 或中性的磷酸二酯键，以减弱探针和目标核酸的多聚阴离子主链之间的斥力(参见Letsinger 等，1988， J. Amer. Chem. Soc. 110:4470);向所述探针中掺入烷基化或卣化的基团如5-溴尿 苷，以促进碱基堆积；向所述探针中掺入核糖核苷酸，以促使探针:目标核酸双链体形成 具有增强的碱基堆积的"A"型结构；用2，6-二氨基嘌呤(氨基腺苷)替换所述探针中部分或 全部的腺苷；以及掺入核苷酸衍生物如LNA (锁核酸)，PNA (肽核酸)或类似物。
由桥接部分连接的两个结合部分可以多种取向存在。所述桥接部分的一端可以与第一 结合部分的5'端相联，并且该桥接部分的另一端可以与第二结合部分的3'端相联(图6A、 C和D)。在另一个实施方案中，所述桥接部分的一端可以与第一结合部分的5'端相联，并 且该桥接部分的另一端可以与第二结合部分的5'端相联。或者，所述桥接部分的一端可以 与第一结合部分的3'端相联，并且该桥接部分的另一端可以与第二结合部分的3'端相联(图 6B)。
所述桥探针的结合部分可以与一段核酸模板以不同方式杂交，从而使所述结合部分的 末端可以指向不同的方向。在一个实施方案中，当一种桥探针与一段核酸模板杂交时，该 桥探针的两端互相指向对方。这种杂交形式可以使所述桥探针的两端紧邻(图6A)。在另 一个实施方案中，当一种桥探针与一段核酸模板杂交时，该桥探针的两端指向互相背离(图 6C和D)。在又一个实施方案中，当一种桥探针与一段核酸模板杂交时，该桥探针的两端 指向同一方向(图6B)。
在一个实施方案中，桥探针的第二结合部分与一种引物的一个部分互补，而所述桥探 针的第一结合部分与该引物延伸链上一段序列的一个部分互补。所述第二结合部分的3'端 与所述引物的一个适当位置被一对相互作用的标记物对标记，由此当所述桥探针与所述引 物延伸链杂交时，此二标记物处于FRET或接触淬灭关系(图6G、 H)。所述引物上的标 记物可以位于任何位置，只要能与桥探针上的标记物相互作用即可。在另一个实施方案中， 一种桥探针的第二结合部分与引物/第二探针的5'部分互补，而其第一结合部分与该引物/ 第二探针的3'部分互补。所述第二结合部分的3'端与所述引物/第二探针的5'端被一对相互 作用的标记物对标记(图61)。在这一实施方案中，当所述引物或第二探针与一段目标核 酸杂交时，所述桥探针将与该引物或第二探针部分或全部解离，从而产生可检测的信号。在这一实施方案中，优选地，与所述桥探针的结合部分杂交的所述引物或第二探针的模板 区域为任意序列，并可设计为在不同的引物或探针之间保持一致。与所述引物或第二探针 结合的所述桥探针，从而可以是能被一组引物或第二探针共享的一种通用探针。
在另一个实施方案中，提供了一组用于扫描未知突变的桥探针。多种桥探针被设计为 覆盖一段目标核酸序列上感兴趣的整个区域。其中每种桥探针可以被不同的染料标记。将 与所述目标核酸杂交的桥探针的熔解特性，同与正常目标核酸和被怀疑包含突变的目标核 酸杂交的桥探针的熔解特性进行比较(图8)。
优选地，桥探针包含检测标记物。当所述探针与一段目标核酸杂交时，或当所述探针 与一段目标核酸解离时，所述标记物产生可检测的信号。 一种桥探针可以包含一种单独的 标记物；或者一种桥探针可以包含一种第一标记物和一种第二标记物(图6A、 B、 C)。 一种桥探针和与之相互作用的引物/探针可以分别包含一种第一标记物和第二标记物(图 6E、 F、 G、 H、 I)。
在一个实施方案中，上述第一结合部分与一种第一标记物相联，上述第二结合部分与 一种第二标记物相联，其中所述第一标记物和第二标记物为接触淬灭对，其中一种标记物 为淬灭剂，其中当探针与目标序列杂交时，第一和第二标记物处于接触淬灭关系。
在另一个实施方案中，上述第一结合部分与一种第一标记物相联，上述第二结合部分 与一种第二标记物相联，其中所述第一标记物和第二标记物为荧光能量转移对，其中当探 针与目标序列杂交时，第一和第二标记物处于荧光共振能量转移(FRET)关系。
在又一个实施方案中， 一种桥探针可能需要与另一种寡核苷酸探针或引物共同起作 用，如图6E、 6G、 6H、和6I中所示。在图6E中， 一种桥探针和另一种探针与目标序列的 相邻区域杂交，所述探针一种被一个FRET或接触淬灭对的一种荧光基团标记，另一种被 相应的淬灭剂标记，由此当所述探针与目标序列的扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭 剂处于或接触淬灭关系，其中所述荧光基团与淬灭剂彼此相距5个核苷酸以内。在图6G和 6H中， 一个扩增反应包含扩增引物和一种桥探针，其中所述扩增引物之一和所述探针分别 被一种荧光基团和一种淬灭剂其中之一标记，由此当该探针与扩增产物杂交时，所述荧光 基团与淬灭剂处于接触淬灭关系，其中该标记的探针与目标核酸序列的一个扩增拷贝在距
该标记的引物5个核苷酸以内杂交，或者该标记的探针与目标核酸序列和该标记的引物的 一个部分杂交。
已知在同质性杂交分析中，两种相互作用的荧光基团可以分别与两种不同的寡聚脱氧 核糖核苷酸探针的末端相联，也可与同一寡聚脱氧核糖核苷酸探针的两端相联。目标核酸 通过将供体荧光基团与受体荧光基团相互拉拢，从而允许二者之间发生能量传递，或者通 过将二者互相分离从而避免能量的传递，而得到显示(Marras S.A.E.等2002,核酸研究 (Nucleic Acids Res.) 30(21))。同质性杂交分析的最早形式利用了一对在其各自的5'端和3'端带有标记的寡聚脱氧核糖核苷酸探针，所述探针被设计为与一段目标链上的相邻位点结 合，从而将受体和供体部分互相拉拢(欧洲专利EPO070685以及CardulloR.A.等1988)。 第二种方法则利用一对相互互补的寡聚脱氧核糖核苷酸，其中的一种寡聚脱氧核糖核苷酸 作为一种单链目标序列的探针。 一种寡聚脱氧核糖核苷酸的5'端被一种供体荧光基团标 记，而另一种寡聚脱氧核糖核苷酸的3'端被一种受体荧光基团标记，由此当这两种寡聚脱 氧核糖核苷酸互相退火时，所述两种标记物互相接近。由于小的互补寡聚脱氧核糖核苷酸 的互相结合处于一种动态平衡，目标核酸链竞争性地与探针结合，导致标记的寡聚脱氧核 糖核苷酸相互分离(Morrison L.E.等1989,分析生物化学(Anal. Biochem.), 183:, 231-244)。在第三种方法中，供体和受体荧光基团与作为探针的同一种寡聚脱氧核糖核苷酸的 两端相联。由于寡聚脱氧核糖核苷酸在溶液中的表现类似一种无规线团，其两端会偶然地 互相接近，导致能量转移的一种可测量的改变。然而当所述探针与其目标核酸结合时，该 探针-目标核酸螺旋结构的刚性使探针的两端彼此远离，避免了上述供体和受体部分之间 的相互作用(ParkhurstK.M.和Parkhurst,L丄1995,生物化学(Biochemistry), 34:, 285-292)。 在第四种方法中，被称为分子信标的单链寡聚脱氧核糖核苷酸，在其探针序列的两端具有 彼此互补的短的附加序列，使得末端的标记物可以通过一种发夹茎结构的形成而彼此紧 邻。此种探针与其目标核酸的结合形成了一种相对刚性的探针-目标核酸杂交体，杂交体 的形成导致发夹茎结构的破坏和供体部分从受体部分邻近位置离开，从而令该供体的荧光 恢复(Tyagi S.和Kramer，F.R. 1996,自然生物技术(Nat. Biotechnol.), 14:, 303—308)。除了 这些基于杂交的方案及其变更方案之外，还可以利用DNA聚合酶的5'—3'核酸内切酶活 性，对PCR过程中与模板链结合的双重标记的无规线团状探针进行酶切("TaqMan" tm探 针)，从而令供体和受体部分分离并使得核酸的合成可以被实时地监测(Heid C.A., Stevens,J., Livak，K丄和Williams,P.M. 1996,基因组研究(Genome Res.), 6:, 986~994)。
如果一种受体荧光基团被拉近至与一种供体荧光基团20至100A范围的距离内，该受 体荧光基团的荧光强度增强，而该供体荧光基团的荧光强度减弱。这是由于从供体到受体 荧光基团的荧光共振能量传递(FRET)效率升高。然而如果这两种部分的距离被拉得更 近，该供体和受体荧光基团的荧光强度则都会减弱。在这种紧密的距离，大多数被吸收的 能量都以热的形式散失，而只有一小部分能量以光的形式发射，这一现象有时被称为静态 淬灭或接触淬灭(Lakowicz J.R. 1999,荧光分析法原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy). Kluwer Academic/Plenum Publishers,纽约,NY)。
在相邻的探针中以及在无规线团状探针中，供体和受体部分彼此维持在以FRET为主 要淬灭机制的距离。另一方面，当竞争性的杂交探针以及分子信标未与目标核酸杂交时， 上述两种部分彼此非常接近，接触淬灭成为淬灭的主要机制。接触淬灭的一个有用特征是 所有荧光基团的淬灭都相类似，无论该荧光极端的发射光谱是否与该淬灭剂的吸收光谱具 有重叠，而后者是决定FRET效率的关键条件之一 (Tyagi S.，Bmtu,D.P.和Kramer,F.R. 1998, 自然生物技术(Nat. Biotechnol.)， 16:, 49-53)。
对利用荧光标记探针的同质性分析的一种进一步简化，是利用非荧光染料作为受体或淬灭剂。通过非荧光染料的淬灭导致的是可以被直接测量的荧光强度的变化，而不是更加 难以监测的发射光谱状态的改变。这一改进还能带来更高程度的多通道检测，因为原本会 被淬灭剂的荧光占据的光谱部分，由此可以留给额外的荧光基团的荧光，以检测更多种的 目标核酸(MarrasS.A.， Kramer,F.R.和Tyagi，S. 1999，遗传分析(Genet. Anal.)， 14:, 151—156)。
近来，包括从核苷酸到金颗粒在内的若干独特的非荧光淬灭剂，已被引入到荧光探针 的使用中(Dubertret B., Calame，M.和Libchaber,A丄2001,自然生物技术(Nat. Biotechnol.), 19:, 365-370)。其中一些淬灭剂被报道具有高至数千倍的淬灭效率。
在以上所讨论的领域内，研究者们所主要利用的方法，基于的是检测探针与目标序列 杂交时，标记物的增强的荧光。FRET是这些方法背后的主要机制。所述杂交探针(美国 专利6，174,670)利用两种依赖于FRET效应的荧光染料。该方法限制了单个反应中所能检 测的目标核酸的种类。
在本发明中，发明人发现探针与目标序列杂交时，对由于接触淬灭而导致的标记物的 荧光减弱进行检测，比FRET更加灵敏。在本发明的一个实施方案中， 一个扩增反应包含 扩增引物和一种核酸探针，其中所述扩增引物之一和所述探针分别被一种荧光基团和一种 淬灭剂之一标记，由此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬 灭关系。所述核酸探针之一可以是一种桥探针。
在本发明的另一个实施方案中， 一个扩增反应包含扩增引物和两种与目标序列的相邻 区域杂交的核酸探针，所述探针之一被一对接触淬灭对的一种荧光基团标记，另一种探针 则被相应的淬灭剂标记，由此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于 接触淬灭关系，其中所述荧光基团与淬灭剂彼此相距5个核苷酸以内。所述核酸探针之一 可以是一种桥探针。
出于有效的接触淬灭考虑，荧光基团与淬灭剂优选彼此相距约0至10个核苷酸。更优 选，所述荧光基团与淬灭剂彼此相距约0至5个核苷酸。最优选，所述荧光基团与淬灭剂彼 此相距约0至2个核苷酸。所述淬灭剂优选为非荧光体。所述淬灭剂可以是一种纳米粒子。 所述纳米粒子可以是一种金纳米粒子。上述淬灭剂还可能是G残基或多聚G残基。
在上述这些实施方案中，所述标记物可以是相互作用的荧光基团或非荧光的染料或任 何实体。此类相互作用的标记物的一个例子是一对荧光基团-淬灭剂对。本文所用术语"荧 光基团"是指在一定范围的激发波长下吸收光能，并以一个不同范围的波长发射光能的基 团。荧光标记物的例子包括但不限于Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350， Alexa Fluor 488， AlexaFluor532， AlexaFluor 546， Alexa Fluor 568 ， Alexa Fluor 594， AlexaFluor 633， Alexa Fluor660和AlexaFluor680) ， AMCA， AMCA-S,氟硼荧(BODIPY)染料(BODIPYFL， BODIPYR6G， BODIPYTMR， BODIPYTR， BODIPY 530/550， BODIPY 558/568， BODIPY 564/570， BODIPY 576/589， BODIPY 581/591 ， BODIPY 630/650， BODIPY 650/665)，羧基罗丹明6G，羧基-X-罗丹明(ROX) ， Cascade Blue, Cascade Yellow,花青染料(Cy3， Cy5， Cy3.5， Cy5.5)，磺酰，Dapoxyl, 二烷基氨基香豆素(Dialkylaminocoumarin) ， 4，, 5，-二氯-2，,7，-二甲氧基-荧光素，DM-NERF，伊红，赤藓红，荧光素，FAM，羟基香豆素， 近红外染料(IRDye) (IRD40, IRD700, IRD 800) ， JOE，丽丝胺罗丹明B， Marina蓝， 甲氧基香豆素，萘荧光素(Naphthofluorescein)，俄勒冈绿488，俄勒冈绿500，俄勒冈绿 514，太平洋蓝(Pacific Blue) ， PyMPO，芘，罗丹明6G，罗丹明绿，罗丹明红，对甲氨 基船绿(Rhodol Green) ， 2', 4', 5', 7'-四溴砜-荧光素(2，，4，，5，,
7，-Tetra-bromosulfone-fluorescein)，四甲基罗丹明(TMR)，羧基四甲基罗丹明(TAMRA)， 德克萨斯红和德克萨斯红-X。
本文所用术语"淬灭剂"包括任何当与一种激发态的荧光标记物紧邻时，能够吸收该荧 光标记物的能量，并能令此能量散逸的基团。淬灭剂可以是一种荧光的淬灭剂或一种非荧 光的淬灭剂，后者也被称为暗淬灭剂。以上所列的荧光基团当被拉拢至另一荧光基团相邻 位置时能起到淬灭剂的作用，其中所发生的淬灭可以是FRET淬灭或者接触淬灭。优选使 用不发射任何可见光的暗淬灭剂。暗淬灭剂的例子包括但不限于DABCYL (4- (4'-二甲 基对胺基偶氮苯)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯，二芳基罗丹明羧酸(diarylrfiodaminecarboxylic acid)，琥珀酰亚胺酯(QSY-7) ， 4，， 5'-二硝基荧光素羧酸，琥珀酰亚胺酯(QSY-33)， quencherl，"黑洞淬灭剂"(BHQ-l,BHQ-2和BHQ-3)，核苷酸类似物，鸟苷酸残基，纳 米粒子，以及金粒子。
C.核苷三磷酸
本文所用术语"核苷三磷酸"是指DNA或RNA中存在的核苷，因此包括以腺嘌呤、胞嘧 啶、鸟嘌呤、胸腺喷啶或尿嘧啶作为碱基，以脱氧核糖或核糖作为糖基的核苷。脱氧核糖 核苷通常与DNA聚合酶一起使用。然而应当认为，能与某种常规碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、 鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)进行碱基配对的其他修饰的碱基也可以使用。这类修饰的碱 基包括如8-氮鸟嘌呤和次黄嘌呤。
本文所用术语"核苷酸"是指DNA或RNA中存在的核苷酸，因此包括以腺嘌呤、胞嘧啶、 鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶作为碱基，以脱氧核糖或核糖作为糖基的核苷酸。然而应当认 为，能与某种常规碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)进行碱基配对的 其他修饰的碱基，也可以用于本发明所用的引物中。这类修饰的碱基包括如8-氮鸟嘌呤和 次黄嘌呤。
在本发明的一个实施方案中，其中利用了一种带有5，核酸外切酶活性的DNA聚合酶， 延伸条件包括全部四种脱氧核苷三磷酸，其中至少一种为取代的(或修饰的)。所述取 代的脱氧核苷三磷酸应被修饰为能抑制所述DNA聚合酶的5，核酸外切酶活性的裂解。这 类修饰的脱氧核苷三磷酸的例子可以包括2，-脱氧腺苷5'-氧-(l-硫代三磷酸)，5-甲基脱 氧胞苷5，-三磷酸，2，-脱氧尿苷5，-三磷酸以及7-脱氮-2，-脱氧鸟苷5，-三磷酸。D.酶
本发明所公开的方法利用核酸聚合酶来进行引物的延伸。任何核酸聚合酶都可以使 用。在一些实施方案中，其中富集引物的延伸阻碍了从扩增引物启始的延伸，所使用的聚 合酶优选为不含链置换活性的聚合酶，例如TaqDNA聚合酶或Taq聚合酶的Stoffel片段。在 其他实施方案中，其中富集引物包含一个若不被除去即会阻止引物延伸的3'阻碍基团，所 使用的DNA聚合酶包含一种校正活性或焦磷酸解活性，例如Pfo， PWO， Pfic， Vent DNA 聚合酶，AmpliTaqFS或热测序酶(ThermoSequenase)。在其他实施方案中，其中富集引 物的延伸促进扩增引物的杂交和延伸，所使用的聚合酶优选为具有链置换活性或5'至3'核 酸外切酶活性的聚合酶，例如Vent (exo-)聚合酶，Taq聚合酶。所使用的DNA聚合酶尤 其优选为热稳定的DNA聚合酶。
II方法
在先的方法(美国专利5，891,625)利用低聚核苷酸类似物，例如可与核酸牢固杂交的 PNA或LNA，来抑制核酸扩增过程。按照本公开内容，本发明的方法实施简便，并且具有 高度的特异性。在本文所主张的一些特定的实施方案中，富集引物与诊断区域退火，并仅 当目标序列的该诊断区域包含一个特定核苷酸时得到延伸。在一个实施方案中，富集引物 的延伸产物特异性地阻碍自一种上游引物处启始的延伸，由此阻止包含所述特定核苷酸的 目标区域的扩增，而包含变异核苷酸的目标区域则得到指数扩增。在另一个实施方案中， 富集引物的延伸令模板的一种茎-环结构打开，从而允许扩增引物退火并延伸。扩增反应 利用一对在所述诊断区域外与目标序列退火的扩增引物，而一些在先的方法利用直接与诊 断区域退火的扩增引物，其中PCR的错误经常被误认为稀有突变存在的阳性结果。此外， 本发明中的扩增产物针对目标核酸进行了富集，可以用本发明所提供的桥探针或其他任何 方法，例如实时PCR、 DNA测序以及类似方法，对其进行可靠的分型和分析。
应当认为，尽管本发明的方法特别关注对包含点突变的目标核酸诊断区域的富集和检 测，所述方法可同样应用于富集和检测带有缺失或插入，包括多于一个核苷酸的缺失和插 入，的诊断区域。本发明对富集包含多于一个核苷酸的置换的目标区域也颇有价值。在这 方面，只需知道相关的核苷酸以便设计所需的适当的富集引物即可。因此，本文所用术语 "变异的核苷酸"应被理解为不仅可以是一种置换，在所需的互补性(例如探针或引物的互 补性)得到相应调整的情况下，还可以潜在地是一种插入或缺失。
本发明提供的一种方法用于从一份样品的核酸总体中，富集和/或检测包含至少一个 变异的核苷酸的一种目标核酸，所述方法包括
(a)用包含目标核酸序列的核酸模板第一链的一种富集引物和一种扩增引物处理核 酸总体，以形成(引物与包含变异的或正常的核苷酸的目标核酸之间)双链体的混合物， 其中所述富集引物和扩增引物能按照扩增引物的3，端位于富集引物的5，端上游(通常相邻
29或充分相邻)这样的位置与模板退火，其中所述富集引物的核苷酸序列与所怀疑的变异核 苷酸所处的一段诊断区域充分互补，其中所述双链体包括与模板退火的富集引物和扩增引 物，或者包括与模板退火的富集引物；
(b)将上述步骤(a)的混合物置于包含适当的核苷三磷酸和一种核酸聚合酶的延伸 条件，以延伸那些可延伸的退火的引物，从而合成引物延伸产物。
如下所述，在一个实施方案中，当富集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域退 火时，该退火的富集引物不能被延伸，而当所述富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊断 区域退火时，该退火的富集引物得到延伸，从而合成富集引物延伸产物，其中所述富集引 物的延伸或者阻碍扩增引物的延伸，或者促进扩增引物的杂交和延伸。更具体地说，在步 骤(a)中，所述富集引物和扩增引物都与核酸模板退火，然后在步骤(b)中，当所述富 集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域退火时，该退火的富集引物不能被延伸，所 述富集引物由此在延伸条件下从目标序列上解离，从而允许扩增引物的延伸通过包含所怀 疑的变异核苷酸的诊断区域，其中当所述富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退 火时，该退火的富集引物得到延伸，从而合成富集引物延伸产物，扩增引物的延伸由此被 所述富集引物的延伸产物所阻碍。
在另一个实施方案中，在步骤(a)中，核酸模板在杂交条件下形成一种茎-环结构， 其中双链的茎包含扩增引物结合位点而环则包含目标核酸序列，其中富集引物与环上的诊 断区域退火，而在步骤(b)中，当与包含变异核苷酸的诊断区域退火时，所述富集引物 得到延伸，延伸打开了茎-环结构，从而允许扩增引物与引物结合位点退火并促进扩增， 其中所述富集引物当与含有正常核苷酸的诊断区域退火时不能被延伸，茎-环结构由此保 持完整并阻止扩增引物与引物结合位点退火。在该实施方案中，所述方法进一步包括步 骤(c)，在允许扩增引物与开放的茎-环模板的引物结合位点退火的杂交条件下，处理步 骤(b)中的混合物；步骤(d)，将步骤(C)中的混合物置于延伸条件下，以延伸退火
的扩增引物，其中所述延伸条件包括适当的核苷三磷酸、 一种核酸聚合酶以及一种具有链
置换活性的试剂或一种具有5'至3'核酸外切酶活性的试剂，其中所述链置换活性使得富集 引物的延伸产物被置换，其中所述5'至3'核酸外切酶活性使得富集引物的延伸产物被降解。 基于所述富集引物或核苷三磷酸上所带的标记物，所述富集引物延伸产物的降解可能导致 产生可检测的信号。优选地，上述步骤(a)至(d)在一个扩增反应中反复进行，所述扩 增反应可以是PCR或等温扩增。所述链置换活性优选由所述聚合酶提供。所述5'至3'核酸 外切酶活性优选由所述聚合酶提供。
富集引物可以包含令所述富集引物的延伸产物不适合指数扩增的部分。在一些实施方 案中，所用的核酸聚合酶可以是一种具有或不具有校正活性的DNA聚合酶。如果使用的是 一种具有校正活性的DNA聚合酶，富集引物可以包含修饰的核苷酸或键，尤其是3'末端核 苷酸或键，以使所述富集引物能抗核酸酶裂解。所述富集引物可以是由天然核苷酸和磷酸 二酯键构成的常规寡核苷酸，也就是说，它不包含化学基团或者修饰的核苷酸。在上述实 施方案中，所述富集引物的部分或全部被核酸酶活性降解。当与目标核酸上包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火时，所述富集引物在包含至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸的延伸 条件下，被一种带有5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶延伸。富集引物的部分或全部被所述 5'核酸外切酶活性降解，而延伸链的部分或全部能抗这种裂解作用。
本发明提供的另一种方法包括步骤
(a) 用目标核酸序列第一链的一种第一富集引物和一种第一扩增引物在杂交条件下
处理核酸总体，以形成双链体的混合物，所述双链体包括与目标核酸退火的所述富集引物 和扩增引物，其中所述富集引物的核苷酸序列与所怀疑的变异核苷酸所处的诊断区域充分
互补，其中所述富集引物的一个3'末端核苷酸与所怀疑的变异核苷酸互补，所述富集引物 的该3'末端核苷酸经过修饰从而不适合聚合酶的延伸，由此与包含所怀疑的变异核苷酸的 诊断区域退火的富集引物不能被延伸，其中当所述富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊 断区域退火时，该富集引物错配的3'末端核苷酸被一种核酸聚合酶的校正活性去除，从而 令所述富集引物可被延伸，其中所述双链体包括以令所述扩增引物的3'端与所述富集引物 的5'端相邻或位于其上游的方式，与该富集引物和该扩增引物退火的目标核酸；
(b) 将上述步骤(a)的混合物置于包含适当的核苷三磷酸和一种具有校正活性的核 酸聚合酶的延伸条件，以延伸那些可延伸的退火的引物，从而合成引物延伸产物，其中当 退火的富集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域退火时，由于3'端受到阻碍，该退 火的富集引物不能被延伸，所述富集引物由此在延伸条件下从目标序列上解离，此延伸条 件可包括较杂交条件中更高的温度，从而允许所述扩增引物的延伸通过包含所怀疑的变异 核苷酸的诊断区域，其中当退火的富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火时， 由于错配的3'末端核苷酸被去除，该退火的富集引物得到延伸以合成所述富集引物的延伸 产物，扩增引物的延伸由此被所述富集引物的延伸产物所阻碍。
在本发明的又一个实施方案中， 一种富集引物包含一个与正常核苷酸匹配的封闭的3' 末端核苷酸，而该3'末端核苷酸与诊断区域的变异核苷酸之间则为错配。当所述富集引物 的该末端核苷酸被一种DNA聚合酶的焦磷酸解活性去除之后，退火的该富集引物在包含正 确核苷酸的正常目标序列模板上得到延伸，其中所述富集引物的延伸产物阻碍上游扩增引 物的延伸。退火的该富集引物在包含变异核苷酸的模板上不被延伸并从模板上解离，从而 允许上游的扩增引物延伸通过诊断区域。所述富集引物的延伸产物能以线性方式被部分地 复制，而扩增引物的延伸产物能得到指数扩增。
在本发明的另一种方法中，富集引物可以在其引发部分的5'处包含一段核苷酸或非核 苷酸的尾序列，其中该5，尾序列与所述富集引物延伸产物上的引物结合位点互补或充分互 补。所述富集引物的延伸产物在变性和杂交之后，折叠形成一种封闭了第二扩增引物结合 位点的茎-环结构，而扩增引物的延伸产物能得到指数扩增。
本发明的另一种方法包括步骤(a)用目标核酸序列第一链的一种第一富集引物和 一种第一扩增引物，以及与目标核酸序列该第一链互补的该目标核酸序列第二链的一种桥 探针和一种第二扩增引物，在杂交条件下处理样品，以形成双链体的混合物，所述双链体包括与目标核酸退火的所述富集引物和扩增引物，其中所述富集引物的核苷酸序列与目标 核酸第一链上所怀疑的变异核苷酸所处的诊断区域充分互补，其中所述桥探针的第一结合 部分与目标核酸第二链上的诊断区域充分互补；(b)将上述步骤(a)的混合物置于包含 适当的核苷三磷酸和一种核酸聚合酶的延伸条件，以延伸那些可延伸的退火的引物，从而 合成引物延伸产物，其中当所述富集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的诊断区域退火时， 该退火的富集引物不能被延伸，所述富集引物由此在延伸条件下从目标序列上解离，此延 伸条件可包括较杂交条件中更高的温度，从而允许所述扩增引物的延伸通过包含所怀疑的 变异核苷酸的诊断区域，其中当退火的富集引物与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火 时，该退火的富集引物得到延伸以合成所述富集引物的延伸产物，扩增引物的延伸由此被 所述富集引物的延伸产物所阻碍。
上述方法可进一步包括在一种扩增方法中重复步骤(a)和(b)。可以在所使用的任 何扩增体系——例如PCR、 SDA、 LAMP、 3SR以及类似体系——中包括上述步骤。优选 PCR作为整合上述步骤的扩增方法。
在本文所描述的方法中，所提供的样品为被怀疑包含目标核酸和所感兴趣的核苷酸变 异的样品。样品中包含的目标核酸可以是双链的基因组DNA或者在必要时是cDNA，然后 利用任何为本领域的技术人员所知的适当的变性方法，包括物理的、化学的或酶学的方法， 使上述基因组DNA或cDNA变性。用于解链的一种优选的物理方法包括将核酸加热至令其 完全(>99%)变性。典型的热变性方法包括从约80'C至约105。C范围的温度，和从数秒至 数分钟范围的时间。作为变性之外的另一选择，目标核酸可以以一种单链形态，例如单链 的RNA或DNA病毒，存在于样品中。
然后将变性的核酸链与寡核苷酸引物在杂交条件下共同孵育，所述杂交条件令引物能 与核酸单链结合。富集引物与诊断区域退火并得到延伸或不被延伸。扩增引物在上述富集 引物的上游与核酸链退火，并在得到延伸时通过上述诊断区域，或其延伸被所述富集引物 的延伸产物所阻碍。在一方面， 一个反应包括一种第一扩增引物和一种第一富集引物与目 标序列的第一链退火，以及一种第二扩增引物与目标序列的第二链退火，所述第二链与所 述目标序列的第一链互补。在另一方面， 一个反应包括一种第一扩增引物和一种第一富集 引物与目标序列的第一链退火，以及一种第二扩增引物和一种第二富集引物与目标序列的 第二链退火，所述第二链与所述目标序列的第一链互补。
在一个实施方案中，核酸模板形成一种茎-环结构。所述能形成茎-环结构的核酸模板， 可以通过延伸样品中目标核酸上的一种第一扩增引物而得到。所述第一扩增引物包含一个 5'尾序列，该5，尾序列由与第二扩增引物结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列组成。上 述第一和第二扩增引物能在与其互补体或所述茎-环结构分离之后，分别与上述第二和第
一扩增引物的延伸产物杂交。所述核酸模板可以通过延伸样品中目标核酸上的第一和第二 扩增引物而得到。在另一个实施方案中，第一和第二扩增引物包含相同的5'尾序列，其中 所述5，尾序列由与一种第三扩增引物的结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列组成。在反应中，所述第三扩增引物的浓度远高于所述第一和第二扩增引物的浓度。所述第三扩增引 物在反应中的浓度可以比所述第一和第二扩增引物的浓度高出至少2倍。优选地，所述第 三扩增引物在反应中的浓度可以比所述第一和第二扩增引物的浓度高出至少3倍。
上述扩增引物被设计为其在双链体序列上的相对位置，能满足由所述第一扩增引物合 成的延伸产物，在与其模板(互补体)分离后，作为所述第二扩增引物延伸的模板。
本发明在应用中，富集引物必须在扩增引物的延伸将富集引物的结合位点封闭之前， 首先与互补的核酸退火。可利用多种技术以实现这点。可以将所述富集引物定位为其5'端 距所述扩增引物的3'端相对较远，从而给予该富集引物更长的退火时间。还可以利用具有 比扩增引物更高的Tm的富集引物。例如，所述富集引物可以被设计为比所述扩增引物更 长。所述富集引物的核苷酸组成可以被设计为具有比所述扩增引物更高的G/C含量，并由 此具有更高的热稳定性。与此类似，可以向富集引物中掺入包含碱基类似物的修饰的核苷 酸，与典型地存在于天然核酸中的碱基相比，所述碱基类似物能形成更加稳定的碱基对。
还可以通过调整热循环参数，来利用所述富集引物与扩增引物之间热稳定性的差异。 例如，在热循环的变性步骤之后，可以引入一个允许富集引物结合但不允许扩增引物结合 的中间温度，然后再将温度升高至延伸温度(例如72'C)，由此允许匹配的富集引物延伸 而令未延伸的富集引物熔解。中间温度与延伸温度的循环可以按照期望重复足够多次，以 使匹配的富集引物在尽可能多的目标模板上得到延伸。然后可以降低温度以允许扩增引物 退火和延伸。
在本发明的一些实施方案中，富集引物的延伸产物起着上游引物延伸的一种阻碍物的 作用，并且优选为不被作为扩增模板使用，可以利用向所述富集引物中惨入能阻碍其部分 或全部的复制的一种不可复制部分，并且优选此方式来实现这点。原则上，富集引物所包 含的上述不可复制部分(阻碍部分)可以是任何不被聚合酶识别为合适模板的部分。优选 地，所述阻碍部分(例如dR-生物素、dR-胺)能够通过在寡核苷酸的体外合成过程中掺入 合适的前体(例如亚磷酰胺)，而插入到合成的寡核苷酸中。
在适当量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、 dGTP、 dCTP和dTTP)或其如前所述 的类似物的存在下，寡核苷酸引物依赖于模板的延伸反应，在包含适当的盐、金属阳离子 和pH缓冲体系的反应介质中，被一种聚合剂所催化。合适的聚合剂为已知可催化依赖于引 物和模板的DNA合成的酶类。利用所述DNA聚合酶类催化DNA合成的反应条件为本领域 所熟知。
焦磷酸解作用是DNA聚合作用的逆反应。在焦磷酸盐存在下，3'末端核苷酸从DNA 双链体上解离，产生三磷酸盐和3，末端变短的DNA双链体[dNMP]n + PPi— [dNMP]n— i + dNTP。在本发明的一种方法中，需要利用焦磷酸解作用来活化3'端被封闭的富集引物，其 中的延伸条件可以包括适合焦磷酸解作用的适当条件，这一点为本领域所熟知。
33当一种富集引物得到延伸时，其上游的一种扩增引物或其上游的一种针对另一个诊断 区域的富集引物也被延伸，但当它们的延伸链到达所述下游富集引物的延伸产物处时，它 们的延伸将停止。如果所述富集引物包含不可复制(阻碍)部分，或所述富集引物延伸产 物上的富集引物部分被降解，则所述富集引物延伸产物不能得到进一步扩增。此处所说的 "进一步扩增"特指指数扩增。在一些实施方案中，允许富集引物延伸产物(尽管不是完整 产物)的线性复制(或者多项式扩增(polynomial amplification))(图l、 2、 3和4)。在 另一个实施方案中，富集引物延伸产物的线性扩增和指数扩增均被阻止(图5)。当一种 退火的富集引物不能被延伸时，它将从模板上解离，从而两种扩增引物之间的目标序列进 行指数扩增，目标序列由此得到富集。
本发明的方法进一步包括对富集的目标序列的检测。检测可以在富集过程中同时进 行，例如实时检测。在富集/扩增反应中可以包括一种检测探针。任何检测探针均可使用； 一种优选的检测探针为桥探针。或者也可以在富集反应结束时进行检测。探针可以在所述 富集反应开始时或结束时加入。可以进行熔解曲线分析来检测所怀疑的变异核苷酸在富集 的扩增产物中的存在。通过检测，优选获得定量数据。
对目标核酸的富集效果还可以在富集过程结束之后来进行检测或验证，这种检测或验 证可以通过多种方法实现，例如通过实时PCR或DNA测序。
图7中描述了本发明利用一种桥探针进行检测的一种典型方法。所述桥探针一方面由 于其第一结合部分具有较短的长度和较高的Tm，从而具有更强的识别单个核苷酸差异的 能力，另一方面由于其第二结合部分与目标区域以外的区域杂交，从而避免了与富集引物 的全长退火，其中富集引物被设计为与所述目标区域杂交。应当认为本发明中的桥探针具 有广泛的应用。所述桥探针能与任何扩增方法，例如PCR、 SDA、 LCR、 RCA、 LAMP、 NASBA或类似方法，联合用于检测目标核酸。所述桥探针还可以用于终点检测和熔解曲 线分析。
在本发明的一个实施方案中， 一种分析一份生物样品中目标DNA序列的方法包括步
骤
(a) 向生物样品中加入有效量的扩增引物和一种核酸探针，其中所述扩增引物之一 和所述探针分别被一种荧光基团和一种淬灭剂其中之一标记，由此当该探针与扩增产物杂 交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭关系，其中该标记的探针与目标核酸序列的一 个扩增拷贝在距该标记的引物5个核苷酸以内杂交，或者该标记的探针与目标核酸序列和 该标记的引物的一个部分杂交；
(b) 用一种扩增方法扩增目标核酸序列；
(c) 用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及
(d) 检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。所 述核酸探针优选为 一种桥探针。在本发明的另一个实施方案中， 一种分析一份生物样品中目标DNA序列的方法包括步
骤
(a) 向所述生物样品中加入有效量的扩增引物和两种可与目标序列上相邻区域杂交 的核酸探针，所述探针之一被一对接触淬灭对的一种荧光基团标记，另一种探针则被相应 的淬灭剂标记，由此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭
关系，其中所述荧光基团与淬灭剂彼此相距5个核苷酸以内；
(b) 用一种扩增方法扩增目标核酸序列；
(C)用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及 (d)检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。优 选地，所述核酸探针之一为一种桥探针。
上述扩增方法可以是一种等温扩增。优选地，扩增为优选为PCR的热循环扩增。
上述方法还可进一步包括测定探针与目标核酸双链体熔解曲线的步骤。
可以利用一种桥探针来进行SNP分型或突变检测。在一个实施方案中(图10A)，等 位基因特异性的第一引物被一种第一荧光基团，如Fam标记，而等位基因特异性的第二引 物被一种第二荧光基团，如Hex标记。所述荧光基团可以与上述引物3'端附近的一个T残基 相联。如果目标SNP或目标突变存在于样品中，则一个或全部两个所述等位基因特异性的 引物得到延伸，从而合成引物延伸链。 一种3'端被一种淬灭剂，如BHQ-1标记的桥探针的 第一结合部分，与上述引物延伸链杂交，而其第二结合部分与引物序列杂交。杂交将上述 荧光基团与淬灭剂拉拢至处于接触淬灭关系。至关重要的是，上述桥探针的桥接部分要有 l至3个不与引物杂交的核苷酸，以令引物不能与之退火从而不能在探针上延伸。同样重要 地，与引物杂交的上述第二结合部分长度应较短但足以与其目标序列杂交。上述桥接部分 还可以包含非核苷酸的化学部分，以令其不能作为聚合酶的模板从而不能被聚合酶复制。 上述探针与引物延伸产物的杂交令荧光减弱，因此所检测的一种特定荧光的减弱就成为特 定的SNP或突变存在的一种指征。
在另一个实施方案中(图10B)，能与一个SNP的邻近区域退火的扩增引物之一，被 一种荧光基团，如Fam标记。所述荧光基团可以与所述引物3'端附近的一个T残基相联。在 检测反应中，上述标记的引物得到延伸，从而合成引物延伸链。 一种3'端被一种淬灭剂， 如BHQ-1标记的桥探针的第一结合部分，与上述引物延伸链杂交，而其第二结合部分与引 物序列杂交。与上述桥探针的第一结合部分结合的第一区域包含SNP或突变位点。杂交令 上述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭关系。至关重要的是，上述桥探针的桥接部分要有l 至3个不与引物杂交的核苷酸，以令引物不能与之退火从而不能在探针上延伸。同样重要 地，与引物杂交的上述第二结合部分长度应较短但足以与其目标序列杂交。上述桥接部分 还可以包含非核苷酸的化学部分，以令其不能作为聚合酶的模板从而不能被聚合酶复制。 由于所述探针上淬灭剂的淬灭效应，所述探针与引物延伸产物的杂交令标记物的荧光减 弱，由此所测量的特定荧光信号在特定Tm值下的减弱，就成为特定的SNP或突变存在的一种指征。所述桥探针结合的Tm可以通过熔解曲线分析确定。
本发明的方法可以包括确定令探针的荧光削减比率最大的温度之步骤。反应中的荧光 作为温度的一个函数可以在聚合酶链式反应过程中测定。
如果单链产物能由所述标记的引物产生，将极大地提高上述反应的灵敏度。 一种产生 单链的终产物的方法可以是一种被称为聚合酶链式置换反应(Polymerase Chain Displacement Reaction, PCDR)的方法(Fu, G. 2007，国际专利申请号PCT/GB2007/003793)。 在PCDR反应中包含一种能导致产生单链的终产物的连接的引物，同时可以利用一种桥探 针来检测目标序列。
在如美国专利6，174，670所述的杂交探针设计中， 一对标记的探针被设计为彼此相邻地 与目标序列杂交，并以FRET方式相互作用，其中供体和受体荧光基团不应彼此直接接触， 因为直接接触将使所述荧光基团的辐射强度减弱。因此，每一探针各自的目标序列通常 相隔至少5个核苷酸，以避免接触淬灭，并令受体的荧光辐射最大化。而在本发明的实施 方案中， 一对标记的探针被设计为彼此相邻地与目标序列杂交，并以接触淬灭方式相互作 用，其中荧光基团和淬灭剂应彼此直接接触，因为直接接触将令淬灭效应最大化，从而减 弱荧光基团的辐射。因此，每一探针各自的目标序列通常相距5个核苷酸以内，以实现接 触淬灭。利用接触淬灭而不是FRET有几点好处。首先，本发明的方法允许最大限度的多 通道检测，而在基于FRET的探针中，受体和供体荧光基团各自都将占用一个检测通道， 限制了所能检测的目标核酸种类。其次，接触淬灭更加有效，因而其信号减弱比FRET所 导致的更加显著。第三，设计FRET探针比设计接触淬灭探针更加复杂。对于FRET探针， 两种探针必须被置于一个适当的距离内以满足FRET的发生；供体荧光基团的发射光谱与 受体的吸收光谱之间的光谱重叠是FRET效率的一个重要决定因素。在接触淬灭中，光谱 重叠并不是淬灭效率的重要决定因素，在不存在光谱重叠时，淬灭效率同样保持很高。
在另一个实施方案中，提供了多种桥探针以实现对多种目标核酸、对一种目标核酸中 的多个变异核苷酸或进行未知突变扫描的多通道检测。每种桥探针包括经由一个桥接部分 连接的至少两个结合部分，其中第一结合部分能与一种核酸模板上所感兴趣的一段区域杂 交，其中第二结合部分能与同该核酸模板上所感兴趣的区域相邻或充分相邻的一段区域杂 交。上述一种核酸模板上所感兴趣的区域可以是带有所怀疑的变异核苷酸的一段诊断区 域。
本发明的方法所使用的试剂可以被包装为检测试剂盒。所述检测试剂盒包括针对一种 目标核酸序列上各诊断区域的富集引物，在一种富集引物的3'端具有一个与所怀疑的变异 核苷酸或与相应的正常核苷酸互补的末端核苷酸，由此在使用中，当所述富集引物的该末 端核苷酸与包含相应的正常核苷酸的诊断区域退火时，所述富集引物的一种延伸产物得到 合成，而当所述富集引物的该末端核苷酸与包含变异核苷酸的诊断区域退火时，所述富集 引物不能被延伸；检测试剂盒还包括用于扩增包含上述富集引物与之退火的诊断区域的一段目标序列的相应第一和第二引物。所述试剂盒还可以包含扩增和检测分析所需的其他经 适当包装的试剂和材料，例如扩增引物、缓冲液、dNTP和/或聚合剂，以及进行检测的说 明书。
在另一个实施方案中， 一种检测试剂盒包括针对一种目标核酸序列上各诊断区域的探 针和引物，其中所述探针和引物所包含的标记物为接触淬灭对，当所述探针和引物与目标 核酸杂交时，所述标记物处于接触淬灭关系。所述试剂盒还可以包括一种桥探针，该桥探 针包括经由一个桥接部分连接的至少两个结合部分，其中第一结合部分能与一种核酸模板 的一段第一区域杂交，其中第二结合部分能与该核酸模板上与该第一区域相邻或充分相邻 的一段第二区域杂交。所述核酸模板的第一区域可以是一种目标核酸上所感兴趣的一段区 域，所述区域可以是包括所怀疑的变异核苷酸的一段诊断区域。
因此，本发明的特定试剂盒为针对本文所述方法的应用而经适当调整的试剂盒，例如 包括富集引物和扩增引物的混合物，以及包括针对本文所述任何一种方法的说明书。因此 就第一方面而言，所述富集引物典型地具有一个与所怀疑的变异核苷酸或相应的正常核苷 酸互补的3'末端核苷酸。典型地，所述扩增引物被设计为以令其3'端与所述富集引物的5' 端紧邻或位于所述富集引物5'端上游的方式，与目标核酸退火。所述富集引物优选包含令 所述富集引物的延伸产物不适合指数扩增(即令其如上所述地不能被复制)的部分。可供 选择地，所述富集引物还包含令其全部或部分抗核酸酶裂解的修饰的核苷酸或键。所述试 剂盒还可以包括一种包含5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶。
在此将根据下述非限制性的实施例对本发明进行进一步的描述。本领域的技术人员将 能据此想出本发明的其他实施方案。
鉴于本文所引用的所有参考文献的公开内容可能被本领域的技术人员用以实现本发 明，特此将其明确引入本文以供参考。
实施例
实施例l
下述实验中所用的所有引物和探针均由EUROGENTEC, UK.合成。实时PCR和熔解曲 线分析在Bio-Rad Chromo4或Stratagene MX3005P实时PCR仪上进行。弓I物被设计为从包含 一段正常的BRAF基因片段和一段突变的BRAF基因片段(携带V599E突变)的质粒，扩增 一段BRAF基因的目标DNA序列。该基因片段包含以下序列
ggaaagcatctcacctcatcctaacacatttcaagccccaaaaatcttaaaagcaggttatataggctaaatagaactaatcattgttttagacat acttattgactctaagaggaaagatgaagtactatgttttaaagaatattatattacagaattatagaaattagatctcttacctaaactcttcataat gcttgctctgataggaaaatgagatctactgttttcctttacttactacacctcagatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattt tggtctagctacagtgaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatggtaagaattgaggctattttt
37ccactgattaaatttttggccctgagatgctgctgagttactagaaagtcattgaaggtctcaactatagtattttcatagttcccagtattcac
引物序列为
BrafF2 GGAAAGCATCTCACCTCATCCTAACAC Bra伍ndR2 GACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCA BmFAMR2 GGACCCACTCCATCG1GATTTC2A
其中"l"表示dR-生物素，"2"表示硫代磷酸酯键。所有的核酸序列均按5'至3'书写，除 非另有说明。此处的BmFAMR2为一种富集引物。
引物被稀释至终浓度为10pM。扩增反应利用以下成分并在下述条件下进行。10xPCR 缓冲液(stoffel片段缓冲液，产自Applied Biosystems) 2.5 10 mM dNTPs 0.5 pl，引物 (若加入)各0.5nl， Stoffel片段，AmpliTaqDNA聚合酶(5U/^1) 0.25(al，质粒DNA0.5pl (105分子)，加水至终体积为25pl。反应在BioMetraPCR仪上按以下参数进行94。Cl分 钟；94。C15秒，57'C30秒，68'C1秒，6(TC15秒，40个循环。反应中所加入的引物如下
管号123456789
BrafF2+++++++++
BraffindR2++-++-++-
BrafFamR2- ++-++-++
正常DNA+++
突变DNA+++
M/N=1/100DNA__+++-—-
M/N4/100DNA是指包含突变DNA和正常DNA的质粒DNA比例为1: 100。
PCR反应结束后将DNA扩增产物上样至琼脂糖凝胶。2、 4、 5、 7和8号管的DNA由GATC ltd.利用引物BrafendR2和BrafendinR2 (具有序列GCCTCAATTCTTACCATCCACAA)进行测序。5 号PCR管中富集了突变的PCR产物显示测序的碱基为突变型，而4号管中未被富集的PCR 产物则显示测序的碱基为正常型。
实施例2
对一种与匹配和错配的模板杂交的桥探针的熔解曲线分析
一种桥探针PadLfam被设计为具有序列 GAGCCGTCGGTGGTCaaaaaaaaaaCATGACGAGCCCTA，其中其5，端被6-Fam标记，3，端 被BHQ-1标记。结合部分以大写字母表示，桥接部分以小写字母表示。
并设计以下两种寡核苷酸模板PadLTemp ATAGACCACCGACGGCTCATTAGGGCTCGTCATGTAAC ，禾口PadLTempM ATAGACCACCGACGGCTCATTAGGGCTAGTCATGTAAC，其中PadLTempM包含一处 以下划线表示的单核苷酸差异。上述桥探针PadLfam以如图6A所示的方式与其模板杂交。如图9A所示进行熔解曲线分 析。在与上述桥探针杂交的匹配的模板(标示线2)和带有一处单核苷酸差异的模板(标 示线l)之间观察到6度的Tm差异。
实施例3
一种桥探针的桥接区域的不同长度影响Tm
如下所述设计两种桥探针SunDab和SunDabA13，其3'末端均被Dabcyl标记。探针 SunDab没有桥接部分，而探针SunDabA13包含由13个A组成的桥接部分。 一种第二探针 SunFam包含两个分别与上述桥探针的第一结合部分和第二结合部分互补的区域，并在其5' 端被6-Fam标记。另一种寡核苷酸SumTemp被设计为具有一个与上述第二探针的一个部分 互补的区域。结合区域的配对情况如下所示，其中"F"表示6-Fam， "Q"表示dabcyl，"-"表 示无核苷酸，'T'表示互补碱基对，"P"表示磷酸基团。
nirii ii.mriimm:miiii
.STOdab 3, ^TGGCG—-—^---------—---C戟CATOGCACCTG，TCTCC 5'
iiiirra'iiiiiiiiiiii raiiimiiiiiiiiiiiiinii
熔解曲线分析按以下所示的寡核苷i酸组合进行:管号1 246
SunFam+ +++++
SunDab- +-+--
SunTemp- -++-+
SunDabA13— —--++
如图9B所示，结果证明桥接部分的差异(2号管和5号管)对Tm有重大影响。上述具 有长桥接部分的桥探针SunDabA13显示出较高的Tm，尤其当结合部分序列较短时(5号 管)。
实施例4
利用属于接触淬灭对的标记物的扩增反应扩增引物和探针为BraffindinR2， GCCTCAATTCTTACCATCCACAA; BraffindR2， GACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCA; BraFAMR2 ，
GGACCCACTCCATCG1GATTTC2A ("l"表示dR-生物素，"2"表示硫代磷酸酯键)； BraPCDRF， ctacacctcagatatatttcttcatgaag， 5'端丰皮Fam^H己；BraBridge， ATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCaaagaGGTGTAG， 3 ，端被BHQ-1标记。
上述扩增引物BraPCDF和上述探针BraBridge分别被Fam和BHQ-l标记，从而当所述探 针与扩增产物杂交时，上述荧光基团和淬灭剂处于接触淬灭关系。
引物被稀释至终浓度为10pM。扩增反应利用以下成分并在下述条件下进行10xPCR 缓冲液(NEB thermo buffer) 2.5nl， 10 mM dNTPs 0.5^1，引物(若加入)各0.5pl， Vent(exo-) 或Taq DNA聚合酶(5U/ixl) 0.25|nl，质粒DNA 0.5^1 (10分子)，加水至终体积为25^d。反 应在BioRad chromo4实时PCR仪上按以下参数进行94 。C 1分钟；94 °C9秒，51 °C30秒(读 取荧光)，72。C30秒，5rC30秒(读取荧光)，72。C30秒，36个循环。反应中所加入的引 物如下
管号12345678
BraPCDRF++++++++
BraBRIDGE++++++++
BraFamR2-+-+-+-+
BraffindinR2++--++--
BrafendR2--++--++
Vent++++----
Taq----++++
正常DNA(弁3744)++++++++
利用实时PCR方法扩增目标核酸序列；用能被Fam吸收的492nm波长的光照射此生物 学样品；检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。
在所有反应中均观察到荧光信号的减弱，表明目标核酸存在于所有样品中。
实施例5
扩增引物对被设计为其中一种引物包含一段与另一种引物的序列相同的5'尾序列。 扩增引物和探针如下JKR3ccF2，
GATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA; JKFamdR，
GTTTTACTTACTCTCGTCTCCAC6GAA，此引物中11号位的"T，，为BHQ-1 (dT) ， "6"为Fam-dR。
引物被稀释至终浓度为10pM。扩增反应利用以下成分并在下述条件下进行10xPCR 缓冲液(NEB thermo buffer) 3)il， 5pl甜菜碱，10 mM dNTPs 0.5pl，引物JKR3 1.25(al，引 物JKR3ccF2 0.5nl， JKFamdR lpl(若加入)，Taq DNA聚合酶(5U/pl) 0.25^1，质粒DNA 0.5pl (105分子)，加水至终体积为25nl。反应在Stratagene MX3005实时PCR仪上按以下参数进行 94。Cl分钟；95。C15秒，61。C18秒，54。C18秒，72。C18秒,60。C20秒，72。C25秒，72°C30 秒(每一温度下均收集数据)，40个循环。上述质粒模板为包含V617突变的突变型DNA 和野生型DNA的混合物。上述方法包括利用实时PCR方法扩增目标核酸序列；用能被Fam 吸收的492nm波长的光照射此生物学样品；检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光 基团发射的温度依赖的荧光。
变性的110130^2引物延伸产物在退火条件下形成一种茎-环结构。113引物由于所述茎-环结构而不能退火。上述富集引物JKFamdR与环部分退火，并且当其与突变的核苷酸退火 时得到延伸。JKFamdR引物的延伸打开了茎-环结构，从而允许R3引物的退火和延伸。由 于Taq聚合酶的5，至3'核酸外切酶活性，R3引物的延伸令富集引物的延伸产物被降解。如 果所用聚合酶具有链置换活性，所述富集引物的延伸产物也可被置换。如果所述富集引物 与野生型DNA退火，此时该野生型DNA包含的一个核苷酸与所述引物的末端核苷酸形成 错配，则所述富集引物不被延伸，茎-环结构由此保持完整。这就导致了对包含突变核苷 酸的DNA的富集。所述富集引物包含标记物Fam和BHQ。富集引物延伸产物的降解产生荧 光信号。这一反应允许在同一管内对目标核酸进行富集和检测。
4权利要求
1.一种用于从样品的核酸总体中，富集和/或检测包含至少一个变异的核苷酸的目标核酸的方法，所述方法包括(a)用所述目标核酸序列第一链的富集引物和扩增引物处理所述样品，以形成双链体的混合物，其中所述双链体的混合物包括在杂交条件下与所述目标核酸模板退火的所述富集引物，其中所述富集引物的核苷酸序列与所怀疑的变异核苷酸所处的诊断区域充分互补，并且其中所述扩增引物能以令所述扩增引物的3’端与所述富集引物的5’端紧邻或位于所述富集引物5’端上游的方式，与所述目标核酸退火；(b)将上述步骤(a)的混合物置于包含适当的核苷三磷酸和核酸聚合酶的延伸条件，以延伸可被延伸的退火的引物，从而合成引物延伸产物，其中所述富集引物的延伸允许包含所述变异核苷酸的所述目标核酸的扩增。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述富集引物的延伸或者阻碍从与包含正常核苷 酸的所述目标核酸退火的所述扩增引物启始的延伸，或者促进所述扩增引物与包含变异核 苷酸的所述目标核酸的杂交和延伸。
3. 根据权利要求l或权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中包括第一富集引物 和第一扩增引物，并且其中所述双链体包括与所述富集引物和所述扩增引物以令所述扩增 引物的3'端与所述富集引物的5'端紧邻或位于所述富集引物5'端上游的方式退火的所述 目标核酸；并且在步骤(b)中，当所述富集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的所述诊断 区域退火时，退火的富集引物不能被延伸，所述富集引物由此在延伸条件下与所述目标序列解离，从而允许所述扩增引物的延伸 通过包含所怀疑的变异核苷酸的所述诊断区域，其中当所述富集引物与包含相应的正常核 苷酸的所述诊断区域退火时，退火的富集引物得到延伸以合成所述富集引物的延伸产物， 所述扩增引物的延伸由此被所述富集引物的延伸产物所阻碍。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述富集引物的3'末端核苷酸或 者与所怀疑的变异核苷酸互补，或者与相应的正常核苷酸互补。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在扩增反应中重复 步骤(a)和(b)。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述富集引物包含令所述富集引物 的延伸产物不适合指数扩增的部分。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述部分为不适合作为核酸聚合酶模板的阻碍部分，其中所述富集引物的全部或部分的复制被阻碍。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阻碍部分为碳氢化合物臂、非核苷酸键、肽 核酸、核苷酸衍生物、碱基核糖或者染料。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3'末端少 于3个核苷酸处。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3'末端少 于6个核苷酸处。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3'末端少 于18个核苷酸处。
12. 根据权利要求6所述的方法，其中所述部分为所述富集引物的引发部分的5'处的 核苷酸或非核苷酸的尾序列，其中所述5'尾序列与所述富集引物的延伸产物上的引物结合 位点互补或充分互补。
13. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述富集引物包含令所述富集引 物的全部或部分能抗核酸酶裂解的修饰的核苷酸或键。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中在3，端和/或5'端的最后5个核苷酸或键是经 修饰的，以令所述富集引物能抗核酸酶裂解。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中在3'端和/或5'端的最后1个核苷酸或键是经 修饰的，以令所述富集引物能抗核酸酶裂解。
16. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述适当的核苷三磷酸包括至少一种令延伸链的部分或全部能抗核酸酶裂解的修饰的脱氧核苷三磷酸，其中所述富集引物 包含令其部分或全部可被核酸酶活性降解的天然的核苷酸和磷酸二酯键。
17. 根据权利要求1至5中任一项或权利要求16所述的方法，其中所述核酸聚合酶包 含5'核酸外切酶活性，其中所述富集引物当与所述目标序列上包含相应的正常核苷酸的所 述诊断区域退火时得到延伸，其中所述富集引物的部分或全部被所述5'核酸外切酶活性降 解，而所述延伸链的部分或全部能抗裂解。
18. 根据权利要求4所述的方法，其中当所述富集引物的3'末端核苷酸与所怀疑的变 异核苷酸互补时，所述富集引物的所述3'末端核苷酸为经过修饰从而不适合被聚合酶延伸 的，与包含所怀疑的变异核苷酸的所述诊断区域退火的所述富集引物由此为不可延伸的，其中当所述富集引物与包含相应的正常核苷酸的所述诊断区域退火时，所述富集引物错配 的3'末端核苷酸被酶的校正活性去除，从而令所述富集引物可被延伸。
19. 根据权利要求4所述的方法，其中当所述富集引物的3'末端核苷酸与相应的正常 核苷酸互补时，所述富集引物的所述3'末端核苷酸为经过修饰从而不适合被聚合酶延伸 的，其中当所述富集引物与包含所述正常核苷酸的所述诊断区域退火时，所述富集引物的 所述匹配的3'末端核苷酸通过焦磷酸解作用被去除，从而令所述富集引物可被延伸，其中 当所述富集引物与包含所述变异核苷酸的所述诊断区域退火时，所述富集引物的所述错配 的3'末端核苷酸不被焦磷酸解作用去除，从而依然不可延伸。
20. 根据权利要求5所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述核酸模板在杂交条件下形 成茎-环结构，其中双链的茎包含扩增引物结合位点而所述环包含所述诊断区域，并且其中所述富集 引物与环上的所述诊断区域退火，并且其中在步骤(b)中，所述富集引物当与包含所述变异核苷酸的所述诊断区域退 火时得到延伸，所述延伸打开了茎-环结构，从而允许所述扩增引物在杂交条件下与所述 扩增弓I物结合位点退火从而促进扩增，并且其中在步骤(b)中，所述富集引物当与包含正常核苷酸的所述诊断区域退火时 不被延伸，所述茎-环结构由此保持完整并阻止扩增引物与所述引物结合位点退火。
22. 根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括步骤(c)，在允许所述扩增 引物与任何开放的茎-环模板的所述引物结合位点退火的杂交条件下，处理步骤(b)的混 合物，以及步骤(d)，将步骤(c)的混合物置于延伸条件下，以延伸任何退火的扩增引 物，其中所述延伸条件包括适当的核苷三磷酸、核酸聚合酶以及具有链置换活性的试剂或 具有5'至3'核酸外切酶活性的试剂，其中所述链置换活性使得所述富集引物的延伸产物被置换，并且其中所述5'至3'核酸 外切酶活性使得所述富集引物的延伸产物被降解。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中步骤(a)至(d)在扩增反应中反复进行，所 述扩增反应为PCR或等温扩增。
24. 根据权利要求22所述的方法，其中所述链置换活性由所述核酸聚合酶提供。
25. 根据权利要求22所述的方法，其中所述5'至3'核酸外切酶活性由所述核酸聚合 酶提供。
26. 根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述核酸模板通过延伸带有5，尾序列的第 一扩增弓i物而得到，其中所述5'尾序列包含与第二扩增引物的结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列，并且其中所述第一和第二扩增引物能在与各自的互补体解离之后，分别与所述第二和第一扩增引物的延伸产物杂交。
27. 根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述核酸模板通过延伸分别包含相同的5'尾序列的第一扩增引物和第二扩增引物而得到，其中所述5'尾序列包含与第三扩增引物的结合位点互补的核苷酸或非核苷酸序列，其中在反应中，所述第三扩增引物的浓度相对于所述第一和第二扩增引物的浓度为过量的。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述第三扩增引物的浓度比所述第一和第二扩增引物中任一种的浓度高出至少3倍。
29. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述反应混合液还另外包含针对所述目标序列的第二链的富集引物和/或扩增引物，其中所述第二链与所述目标序列的第一链互补。
30. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶为热稳定的酶。
31. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法进一步包括检测富集的所述目标核酸。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述检测用桥探针作为媒介，所述桥探针包括经由桥接部分连接的至少两个结合部分，其中第一结合部分能与核酸模板的第一区域杂交，并且其中第二结合部分能与所述核酸模板上与所述第一区域相邻或充分相邻的第二区域杂交，并且其中所述核酸模板的所述第一区域包含所怀疑的变异核苷酸，其中所述桥接部分的序列包含至少一个核苷酸或至少一个非核苷酸的化学部分，其中所述核苷酸或化学部分不能与所述核酸模板杂交，并且其中所述桥接部分的长度和/或组成被设计为可决定单独的结合部分的熔解温度和/或所述桥探针的熔解温度。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸模板的所述第一区域为引物的延伸产物中所延伸出的部分上的区域，其中所述第二区域为所述引物或探针的部分。
34. 根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸模板的所述第一和第二区域均为扩增引物或探针的部分。
35. 根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述桥探针的结合部分在不同 的熔解温度下与含有匹配的或错配的核苷酸的所述目标核酸杂交，其中所述熔解温度被测 量并作为所怀疑的变异核苷酸是否存在的指征。
36. 根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述桥接部分的一端与所述第 一结合部分的5'端相联，并且所述桥接部分的另一端与所述第二结合部分的3'端相联。
37. 根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述桥接部分的一端与所述第 一结合部分的5'端相联，并且所述桥接部分的另一端与所述第二结合部分的5'端相联，或者其中所述桥接部分的一端与所述第一结合部分的3'端相联，并且所述桥接部分的 另一端与所述第二结合部分的3'端相联。
38. 根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中当所述桥探针与目标核酸杂交 时，所述桥探针的两端互相指向对方。
39. 根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中当所述桥探针与目标核酸杂交 时，所述桥探针的两端指向互相背离。
40. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中当所述桥探针与目标核酸杂交 时，所述桥探针的两端指向同一方向。
41. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述探针和/或所述引物包含检 测标记物。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述第一结合部分与第一标记物相联并且所述 第二结合部分与第二标记物相联，其中所述第一标记物和第二标记物为接触淬灭对，其中所述标记物之一为淬灭剂， 并且其中当所述探针与所述目标序列杂交时，所述第一和第二标记物处于接触淬灭关系。
43. 根据权利要求41所述的方法，其中所述第一结合部分与第一标记物相联并且所述 第二结合部分与第二标记物相联，其中所述第一标记物和第二标记物为荧光能量转移对，并且其中当所述探针与所述目标序列杂交时，所述第一和第二标记物处于荧光共振能 量转移关系。
44. 根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述第二结合部分和所述引物能与所述桥探针的所述第二结合部分杂交的部分，分别与荧光基团和淬灭剂组成的结合对的成员之一相联，根据此当所述桥探针与所述引物的延伸链杂交时，所述荧光基团和淬灭剂处于接触淬灭关系。
45. 根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为非荧光体。
46. 根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为纳米粒子。
47. 根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为G残基或多聚G残基。
48. —种用于分析生物样品中目标DNA序列的方法，所述方法包括步骤(a) 向所述生物样品中加入有效量的扩增引物和核酸探针，其中所述扩增引物之一和所述探针分别被荧光基团和淬灭剂之一标记，如此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭关系，其中所述标记的探针与所述目标核酸序列的扩增拷贝在距所述标记的引物5个核苷酸以内杂交，或者所述标记的探针与所述目标核酸序列和所述标记的引物的部分杂交；(b) 用扩增方法扩增所述目标核酸序列；(c) 用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及(d) 检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。
49. 一种用于分析生物样品中目标DNA序列的方法，所述方法包括步骤(a) 向所述生物样品中加入有效量的扩增引物和两种可与所述目标序列上的相邻区域杂交的核酸探针，所述探针之一被一对接触淬灭对的荧光基团标记，另一种探针则被相应的淬灭剂标记，如此当所述探针与扩增产物杂交时，所述荧光基团与淬灭剂处于接触淬灭关系，其中所述荧光基团与淬灭剂彼此相距5个核苷酸以内；(b) 用扩增方法扩增所述目标核酸序列；(c) 用能被所述荧光基团吸收的选择性波长的光照射所述生物样品；以及(d) 检测所述荧光基团的荧光发射或监测所述荧光基团发射的温度依赖的荧光。
50. 根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述荧光基团与所述淬灭剂彼此相距约0至2个核苷酸。
51. 根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述扩增为等温扩增。
52. 根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述扩增为热循环扩增。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述扩增为PCR。
54. 根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为非荧光体。
55. 根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为纳米粒子。
56. 根据权利要求55所述的方法，其中所述纳米粒子为金纳米粒子。
57. 根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述淬灭剂为G残基或多聚G 残基。
58. 根据权利要求48至57中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测定探针与目 标核酸双链体熔解曲线的步骤。
59. 根据权利要求48至58中任一项所述的方法，其中所述核酸探针之一为桥探针， 所述桥探针包括经由桥接部分连接的至少两个结合部分， 其中第一结合部分能与核酸模板的第一区域杂交，并且其中第二结合部分能与所述核酸模板上与所述第一区域相邻或充分相邻的第二 区域杂交，并且其中所述核酸模板的所述第一区域包含所怀疑的变异核苷酸， 其中所述桥接部分的序列包含至少一个核苷酸或至少一个非核苷酸的化学部分，其中所述核苷酸或化学部分不能与所述核酸模板杂交，并且其中所述桥接部分的长度和/或组成被设计为可决定单独的结合部分的熔解温度和/或所述桥探针的熔解温度。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述核酸模板的所述第一区域为引物的延伸产 物中所延伸出的部分上的区域，其中所述第二区域为所述引物或探针的部分。
61. 根据权利要求59所述的方法，其中所述桥探针的结合部分之一在不同的熔解温度 下与含有匹配的或错配的核苷酸的所述目标核酸杂交，其中所述熔解温度被测量并作为所 怀疑的变异核苷酸是否存在的指征。
62. —种用于从样品的核酸总体中，检测包含至少一个变异核苷酸的目标核酸的试剂 盒，所述试剂盒包括针对目标核酸序列上各诊断区域的富集引物，在所述富集引物的3'端具有与所怀疑的 变异核苷酸或与相应的正常核苷酸互补的末端核苷酸，如此当使用时，所述富集引物的延 伸产物得到合成，所述延伸产物的合成或者阻碍扩增引物的延伸，或者促进所述扩增引物 的杂交和延伸；用于扩增目标序列的相应的第一和第二引物，其中所述目标序列包含与所述富集引物 退火的诊断区域；以及如上述各权利要求中任一项所阐述的，针对目标核酸序列上各诊断区域的探针和引物，其中所述探针和引物包含构成接触淬灭对的标记物，当所述探针和引物与目标核酸杂交时，所述标记物处于接触淬灭关系。
63. —种用于实现权利要求32至47或59至61中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括如所述权利要求中任一项所阐述的桥探针，并任选地包括一种或多种(i) 用作对照的目标DNA模板；(ii) 一种或多种适用于扩增所述目标DNA的引物。
全文摘要
本发明提供用于从样品的核酸总体中富集和/或检测包含至少一个变异核苷酸的核酸的方法和试剂盒。所述方法利用富集引物和桥探针来富集和检测目标核酸。富集引物的延伸允许包含所述变异核苷酸的目标核酸的扩增。
文档编号C12Q1/68GK101680029SQ200880012820
公开日2010年3月24日 申请日期2008年2月29日 优先权日2007年3月1日
发明者富国良 申请人:奥西泰克有限公司