专利名称：一种提高rtn4b蛋白产量的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，发明涉及一种新的提高RTN4B表达量的 技术手段和方法。
背景技术：
RTN家族是一个近年来所发现的新的基因家族。其中神经内分泌特异性蛋白 NSP(neuroendocrine-specific protein)后被统一命名为RTN1，是该家族的第一个 成员。根据NSP基因组序列、cDNA序列和核酸序列数据库比较，发现了另外三个人 RTN家族成员(NSP类基因I， II, III)。其中两个(NSP-like基因I, II)相继被克 隆，并被命名为RTN2和RTN3。 RTN4类似于RTN1和RTN2，同样有C-木端相同的三 个异构体(即RTN4A, 4B， 4C) 。 RTN4异构体与RTN1/NSP， RTN2， RTN3异构体一样有
着共同的c-末端，并且四者的c-末端都有高度同源性。
研究表明，RTN4B广泛存在于人的各个组织之中(肝脏除外)可以明显促进 鸡胚尿囊膜处和小鼠角膜处的血管增长。创伤愈合实验表明，人RTN4B蛋白可明显 促进创伤愈合，包括增强细胞的粘附力。RTN4B蛋白可以用于促进创伤处血管愈合， 可以作为创伤愈合药物，尤其是血管生长促进药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高RTN4B蛋白产量的方法。
本发明提供了一种提高RTN4B蛋白产量的方法，它包括使用DF0或者氯化 钴等类似缺氧条件的方法提高RTN4B的表达量。
本发明提供了一种提高RTN4B蛋白的产量的方法，即在组织或者细胞的培 养环境中加入去铁胺或者氯化钴，加入的量为l-500uM (即umol/L)，处理时 间在6小时以上。
本发明中，使用加入50-250n M的去铁胺的方法提高RTN4B的产量，处理 时间为12-48小时。
本发明中，使用加入50-250 " M的氯化钴的方法提高RTN4B的产量，处理 时间为12-48小时。
本发明中，去铁胺的用量可以为90-120 u M。
本发明中，氯化钴的用量可以为75-110wM。
本发明中，DFO是去铁胺(例如，sigma， D9533) ， CoCL是氯化钴(例 如，sigma， 232696)。
本发明中，"组织或者细胞的培养环境"是指常规的培养环境。例如，在 37°C、 0)2含量5% (体积比)的培养箱环境中培养细胞。
本发明中，术语"RTN4B蛋白"指可促进创伤愈合的、序列与NCBI登陆号 AAG12177所示多肽序列至少70%同源性的RTN4B多肽及其变异形式。这些变异形式 包括(但并不限于)若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最 佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个 或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如， 在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。 又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该术语还包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RTN4B DNA杂交的DNA所编码的 蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他 多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明 还包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人RTN4B多肽序列的至少 约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸， 更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还包括人RTN4B蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人RTN4B多 肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种
技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其 他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨 基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、 Y-氨基酸)的类似 物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的具有代表性的多肽。
本发明中，可以将RTN4B蛋白与药学上的载体或者赋形剂组成的促进创伤愈 合的药物组合物。本发明中，所述的创伤愈合药物是血管生长促进药物。
本发明蛋白，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含 有治疗有效量的蛋白质和药学上pJ接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限 于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式 相匹配。本发明的人RTN4B蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄 糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下 制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/ 千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明可以有效的提高RTN4B的表达量，为生产创伤愈合的药物提供更多的 原料。同时，本发明所采用的方法歩骤少，成本低，效率高，可以用于大批量 的制备RTN4B相关的创伤愈合药物。
图1是DF0 (去铁胺，sigma， D9533)和CoCl2 (氯化钴，sigma， 232696) 在不同时间对原代培养大鼠肝细胞内RTN4B表达的影响图。
图2为荧光素酶实验结果图。BASIC为pGL3空载体，A2B2为装有rtn4b 基因启动子区的pGL3载体，basic— 为未加DF0实验组，basic+ 为加 DF0实验组，A2B2-为未加DF0实验组，A2B2+ 为加DF0实验组，**表示 p<0. 01差异显著。 '
具体实施例方式
实施例1DF0和CoCl2不同剂量对原代培养大鼠肝细胞内RTN4B表达的影响
1. 第一天，原代培养大鼠肝细胞接种24孔板，2Xl(T个细胞/孔。
2. 第二天，吸取原来的培养基，分别加入含有DFO和CoCl,的培养基。 设立DF0和CoCh浓度梯度为0ii M，50y M, 100 y M， 150 " M， 200 u M， 250 u M。
3. 24h后收取细胞样品，Western检测RTN4B蛋白。 结果显示，随着DF0或者CoCl,用量的增加，RTN4B的产量也增加。
实施例2 DF0和CoCl,不同时间对原代培养大鼠肝细胞内RTN4B表达的影响
1. 第一天，原代培养大鼠肝细胞种24孔板，2X10'5个细胞/孔。
2. 第二天，吸取原来的培养基，分别加入含有100uM DF0和CoCL的培养基。
3. 0h， 6h, 12h， 24h, 36h， h时间点分别收取细胞样品，Western检测RTN4B蛋白。
结果显示，随着时间的增加，RTN4B的产量也增加。
实施例3 通过荧光素酶实验检测DF0和CoC 12对RTN4B转录的影响
1. 将RTN4B基因一段长约1.2kb片段克隆到pGL3载体并命名为A2B2.。
2. 共转染A2B2以及SV40-p RL (内参质粒)到H印G2细胞。
3. 24h后加入含有100u M DF0或CoCl2。
4. 24h后弃去培养基，加入500 u 1/孔洗一遍。
5. 加入100yl/孔PLB (passive lysis buffer),裂解15分钟。
6. 吸取样品，10，000转/分，离心30秒。
7. 吸取样品，加入冷光仪专用管中。
8. 放入冷光仪，检测荧光素酶活性。
结果显示，DF0和CoCL可以明显促进RTN4B产量的增加。
权利要求
1.一种提高RTN4B蛋白产量的方法，其特征在于，在组织或者细胞的培养环境中加入1-500μM的去铁胺或者氯化钴，处理时间为6小时以上。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用加入50-250 ti M的去铁 胺的方法提高RTN4B的产量，处理时间为12-48小时。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用加入50-250 y M的氯化 钴的方法提高RTN4B的产量，处理时间为12-48小时。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，去铁胺的用量为90-120uM。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，氯化钴的用量为75-110ixM。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的提高RTN4B蛋白产量方法。RTN4B广泛存在于人的各个组织之中，可以明显促进血管增长和增强细胞的粘附力，因而，可以作为创伤愈合药物，尤其是血管生长促进药物。本发明提供了一种提高RTN4B蛋白的产量的方法，即在组织或者细胞的常规培养环境中加入去铁胺或者氯化钴。从而为生产创伤愈合的药物提供更多的原料。同时，本发明所采用的方法步骤少，成本低，效率高，可以用于大批量的制备RTN4B相关的创伤愈合药物。
文档编号C12P21/02GK101353641SQ20071004426
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月26日 优先权日2007年7月26日
发明者龙 余, 唐丽莎, 季国庆, 波 秦 申请人:复旦大学