耐热植物和植物组织以及用于制备和使用它们的方法和材料的制作方法

专利名称：耐热植物和植物组织以及用于制备和使用它们的方法和材料的制作方法
耐热植物和植物组织以及用于制备和使用它们的方法和材料政府支持本申请的主题受国家科学基金项目号I0S-0444031的研究资助支持。因此，政府享有此发明中的某些权利。
背景技术：
热胁迫导致降低的玉米产量(Peters等人，1971 ；Thompson，1975 ；Chang, 1981 ；Christy和Williamson，1985)。这可以归因于光合产物可利用性(photosynthate availability)和从源头至接收组织(sink tissues)的运输降低、不良授粉、细胞及谷粒尺寸和数目减少、早期种子败育和/或籽粒灌浆期缩减。胚乳的生长始于其中细胞活跃分裂的延迟期并且继之以其中细胞尺寸增加和淀粉合成出现的线性期。在延迟期期间升高的温度导致降低的产量(Jones等人，1984)。这些研究人员提出降低的产量归因于细胞及谷粒数目和尺寸减少以及种子败育。另外，在线性期期间升高的温度导致更短的籽粒灌浆期和随后更小的谷粒(Jones等人，1984)。Hunter等人(1977)和ToIlenaar及 Bruulsema(1988)发现了相似的结果。来自传统上生产超过50%美国玉米的5个州的记录显示平均日温度是23. 6°C，比籽粒灌浆期间最适温度高约2°C (Singletary等人，1994)。籽粒灌浆期间的光合产物可利用性在高温不降低，至少在大麦和小麦中如此。实际上，大麦种子和小麦种子中的蔗糖含量在高温下不变或升高(Bhullar和Jenner，1986 ；Wallwork等人，1998)。玉米中的光合作用直至 32°C 还增加(Duncan 和 Hesketh，1968 ；Hofstra 和 Hesketh，1969 ；Christy 等人， 1985)。另外，Cheikhn和Jones (1995)研究了玉米籽粒在不同温度固定14C蔗糖和己糖的能力。他们发现种子中这些糖在升高的温度处增加。上述证据表明籽粒灌浆期间受限的糖可利用性和运输入籽粒不是温度诱导的产量降低的原因。已经进行了深入研究来鉴定升高的温度期间影响籽粒灌浆的生物化学途径。 Singletary等人(1993 ； 1994)测试了在升高的温度(22°C至36°C )体外培育的玉米籽粒中的淀粉生物合成酶。他们发现与参与淀粉合成的其他酶相比，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP 酶)和可溶性淀粉合酶(SSS)更为热不稳定。他们提出AGP酶和SSS的热不稳定性对籽粒灌浆停止有贡献。Duke和Doehlert (1996)发现与25°C相比，编码淀粉合成途径的酶的几个基因(包括编码AGP酶的那些基因)的转录物在35°C减少。然而，酶测定法显示仅AGP 酶活性显著更低。他们提出这可能归因于AGP酶与其他酶相比更高的周转率。最后，通过 Qltl分析，Wilhelm等人(1999)显示与几种其他酶相比，AGP酶具有最突出的活性降低。在 57°C加热5分钟时，玉米AGP酶实际上丧失其活性的96% (Hannah等人，1980)。AGP酶催化淀粉(植物)和糖原(细菌)合成中首个承担合成的步骤。它涉及将葡萄糖-I-P (G-I-P)和ATP转变成ADP-葡萄糖和焦磷酸(PPi)。AGP酶在植物中是由两个相同小亚基和两个相同大亚基组成的异四聚体。大亚基和小亚基分别由玉米胚乳中的皱缩-2 (shrunken-2 ；Sh2)和易碎_2(brittle_2 ；Bt2)编码。AGP酶受指示细胞能量状态的小效应分子变构地调节。AGP酶在蓝细菌、绿藻和被子植物中被第一碳同化产物3-PGA激活并且被无机磷酸盐(Pi)抑制/失活。玉米胚乳AGP酶在淀粉合成中的重要性已经由该酶两种亚基任一者中突变体的籽粒表型显示。实际上，此类突变体导致皱缩的籽粒和胚乳淀粉含量的大降低(Tsai和 Nelson, 1966 ；Hannah和Nelson，1976)。也存在AGP酶催化淀粉合成中限速步骤的证据 (Stark 等人 1992 ；Giroux 等人 1996 ；Greene 等人 1998 ；Sakulsingharo ja 等人 2004 ；Obana 等人 2006 ；Wang 等人 2007)。Greene和Hannah (1998a)分离了在大亚基中具有称为HS33的单氨基酸改变的玉米AGP酶的突变形式。他们显示改变的酶更为热稳定并且稳定性归因于更强的亚基_亚基相互作用。当小麦和稻用含有HS33改变连同影响AGP酶变构特性的改变(Rev6)的Sh2变体转化(Giroux等人，1996)时，产量分别提高38%和23% (Smidansky等人，2002 ；2003) 值得注意地，该提高归因于种子数目增加，而非单个种子重量增加。用含有Rev6和HS33改变的Sh2变体转化玉米也导致提高的种子数目。种子产量 /玉米穗可以在玉米中提高直至68%。对玉米转基因事件的详细表征正在进行(Greene和 Hannah,筹备中)。提高的种子数目不能由Rev6解释，因为在玉米中单独表达时，它仅增加种子重量(Hannah，未发表)。以上研究显示了 AGP酶热稳定性在谷物产量中的重要性。Cross等人(2004)产生了由BT2的头200个氨基酸和马铃薯块茎小亚基的末尾 275个氨基酸组成的嵌合小亚基(MP)。与SH2复合的MP具有可能导致农艺学收益的几个特点(Cross等人，2004 ；Boehlein等人，2005)。那些特点中的一些特点是与野生型玉米胚乳AGP酶(BT2/SH2)相比在缺少激活物3-PGA的情况下提高的活性、增加的3-PGA亲和力和升高的热稳定性。初步数据显示表达于玉米胚乳中的具备含有AGP酶变体的转基因MP 的玉米植物导致淀粉产量增加(Hannah，未发表的数据)。发明简述本发明涉及用于向植物或植物组织提供增加的热条件抗性和/或增加的淀粉生物合成的材料和方法。与升高的温度通常观察到的产量损失相比较，植物或植物组织增加的热条件抗性引起降低的产量损失。本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有氨基酸突变的植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在另一个实施方案中，多核苷酸编码由(如美国专利号 7，173，165中所述的)来自两种不同植物的序列组成并且包含本发明氨基酸突变的嵌合植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。该嵌合AGP酶中的突变协同地增强热稳定性。本发明也包括由本发明的多核苷酸编码的突变植物AGP酶小亚基。对热稳定性以及动力学特性与变构特性的表征显示当本发明的多核苷酸在植物如单子叶植物胚乳中表达时，提供了增加的淀粉产量。附图简述

图1显示由与SH2 —起表达BT2、BT2-TI、MP、MP-TI的大肠杆菌细胞产生的糖原。 来自仅单独表达SH2、BT2、BT2-TI和MP的细胞产生的糖原。糖原以葡萄糖单位测量。误差线显示标准差(N = 3)。图2A和图2B显示来自与互补亚基SH2 —起表达BT2、BT2-TI、MP、MP-TI的大肠杆菌细胞的粗提取物的斑点印迹结果。通过使用针对BT2的单克隆抗体使AGP酶显影。通过使用 ImageJ(http://rsb. info. nih. gov/ij/)估计斑点的密度。图3显示AGP酶变体在来自未诱导大肠杆菌细胞的粗提取物和部分纯化的蛋白质提取物中的比活性。活性以反方向测量。n.d.=检测不到。误差线显示标准差(N = 3)。 图4显示AGP酶的纯化。纯化的重组BT2/SH2、TI/SH2、MP/SH2和MP-TI/SH2的 SDS-PAGE。使用来自 Biorad 的 Precision Plus ProteinAll Blue Standard 作为标记。左边上部箭头指向大亚基。左边下部箭头指向小亚基。图5A和图5B显示纯化的BT2/SH2、BT2-TI/SH2和MP/SH2的热稳定性。每种AGP 酶的半寿期(T1/2)表示为均值士标准误。ρ-值通过Prizm(Graph pad, San Diego CA)执行的F检验估计。在图5A中，测试以正方向进行。在图5B中，测试以反方向进行。图6A和图6B显示纯化的MP/SH2和MP-TI/SH2的热稳定性。每种AGP酶的半寿期(T1/2)表示为均值士标准误。ρ-值通过Prizm(Graph pad, San Diego CA)执行的F检验估计。在图6A中，分析以正方向进行。在图6B中，分析以反方向进行。图7A-7C显示BT2和TI的3D建模。图7A是BT2单体的预测3D结构。TI改变由红色圆圈标出。直接参与亚基-亚基相互作用的BT2区域由黄色框突出显示。图7B显示Thr462(l，2)的碳原子与Pro60 (4，5)和Leu61 (3)的那些碳原子的距离。图7C显示 Ile462(l，2，3，4)的碳原子与Pro60 (5，6)和Leu61(7，8)的那些碳原子的距离。通过使用 FirstGlance Jmol确定Thr462和Ile462接触残基。深灰色球指示Thr462和Ile462的碳原子。浅灰色球指示接触残基的碳原子。氧原子和氮原子分别由红色和蓝色指示。图8显示AGP酶亚基-亚基相互作用的强度。在酵母双杂交系统中，使用SH2作为诱饵并且使用BT2、TI和MP作为捕获物。使用定量半乳糖苷酶测定法来量化诱饵与捕获物之间的相互作用。误差线表示2Χ标准误(N = 4)。序列简述SEQ ID NO 1是包含了编码本发明突变多肽(Tl)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 2是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO :3是包含了编码本发明突变多肽(MP-TI)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :4是本发明突变多肽(ΜΡ-ΤΙ)的氨基酸序列。SEQ ID NO 5是本发明突变多肽(TI+YC)的氨基酸序列。SEQ ID NO 6是本发明突变多肽(TI+QTCL)的氨基酸序列。SEQ ID NO 7是本发明突变多肽(TI+ETCL)的氨基酸序列。SEQ ID NO 8是本发明突变多肽(MP-TI+YC)的氨基酸序列。SEQ ID NO 9是本发明突变多肽(MP-TI+QTCL)的氨基酸序列。SEQ ID NO 10是本发明突变多肽(MP-TI+ETCL)的氨基酸序列。SEQ ID NO :11是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 5)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 12是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 6)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 13是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 7)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 14是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 8)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 15是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 9)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 16是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO 10)的核苷酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 17是可以根据本发明使用的寡核苷酸。SEQ ID NO 18是可以根据本发明使用的寡核苷酸。SEQ ID NO :19是可以根据本发明使用的寡核苷酸。SEQ ID NO 20是可以根据本发明使用的寡核苷酸。SEQ ID NO 21是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO 22是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO 23是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO 24是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO 25是本发明突变多肽(Tl)的氨基酸序列。SEQ ID NO :26是马铃薯块茎AGP酶小亚基蛋白的氨基酸序列。发明详述本发明涉及用于提供热条件抗性增加和/或淀粉生物合成增加的植物的材料和方法。与升高的温度通常观察到的产量损失相比较，植物增加的热条件抗性引起降低的产量损失。本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有氨基酸突变的植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米胚乳 AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，置换的氨基酸是异亮氨酸。在一个实施方案中，突变植物AGP 酶小亚基是玉米胚乳AGP酶小亚基。在一个例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其片段或变体。在一个具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，突变植物AGP 酶小亚基来自大麦、小麦、高粱、马铃薯或稻。在一个具体实施方案中，突变大麦、小麦、高粱或马铃薯 AGP 酶小亚基分别包含 SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22、SEQID NO 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码可以额外包含如公开的国际专利申请W02005/019425 (Hannah和Linebarger)中所述氨基酸突变的突变植物AGP酶小亚基。在一个实施方案中，由该多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶第36氨基酸位置相对应的酪氨酸用半胱氨酸置换。突变AGP酶小亚基也可以任选地包含在分别与野生型玉米胚乳AGP酶第34和35氨基酸位置相对应的丝氨酸和苏氨酸氨基酸之间插入的氨基酸。在具体实施方案中，在AGP酶小亚基第34和35位置处的氨基酸之间插入的氨基酸是谷氨酸或谷氨酰胺。在例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO=IUSEQ ID NO 12或SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，多核苷酸编码由(如美国专利号7，173，165中所述的)来自两种不同植物的序列组成并且还包含本发明氨基酸突变的嵌合植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在具体实施方案中，置换的氨基酸是异亮氨酸。在一个实施方案中， 嵌合AGP酶小亚基包含来自一种植物的羧基端部分和来自另一种植物的氨基端部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含大致具有第一植物AGP酶小亚基氨基端的头150个至250个氨基酸的氨基端序列和大致包含第二植物AGP酶小亚基羧基端的末端300个或更少残基的羧基端序列。因而，嵌合亚基的羧基端可以包含第二植物的羧基端的末尾300或 299或298或297或296或295个残基等。所述亚基序列可以来自单子叶或双子叶植物或者单子叶和双子叶植物的AGP酶。在本发明的范围内包括单子叶植物，例如稻、小麦、大麦、 燕麦、高粱、玉米、百合和谷子。双子叶植物可以包括例如烟草、大豆、马铃薯、甘薯、萝卜、卷心菜、油菜、苹果树和莴苣。在一个实施方案中，该嵌合蛋白的头200个左右的氨基端氨基酸来自玉米胚乳AGP酶小亚基的氨基端并且羧基端氨基酸来自马铃薯块茎AGP酶小亚基的羧基端并包括与本发明第462氨基酸位置相对应的突变。在具体实施方案中，本发明嵌合蛋白的羧基端区包含马铃薯块茎的AGP酶小亚基的末尾276个氨基酸。在例举的实施方案中，该嵌合蛋白包含玉米胚乳AGP酶小亚基的一部分和马铃薯块茎AGP酶小亚基的一部分。在具体实施方案中，该嵌合蛋白含有a)来自玉米胚乳AGP酶小亚基的头199个氨基酸 (即，第1直至第199氨基酸)和马铃薯块茎AGP酶小亚基的羧基末端，其中使用对保藏为 Genbank登录号X61186的蛋白质所示的氨基酸序列，所述羧基末端始于第246氨基酸(即， 第246直至第521氨基酸)(或，如Harmah等人，2001中那样使用针对马铃薯AGP酶亚基的编号系统，备选地始于第175氨基酸)，和b)与本发明第462氨基酸位置相对应的突变。 在例举的实施方案中，植物嵌合AGP酶小亚基包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码了可以额外包含在公开的国际专利申请WO 2005/019425 (Hannah和Linebarger)中所述氨基酸突变的突变植物AGP酶小亚基。在又一个实施方案中，由该多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基也包含氨基酸突变，其中第36位置处的酪氨酸用半胱氨酸置换。突变AGP酶小亚基也可以任选地包含分别在第34和第35 位置处的丝氨酸与苏氨酸氨基酸之间插入的氨基酸。在具体实施方案中，在突变AGP酶小亚基第34和35位置之间插入的氨基酸是谷氨酸或谷氨酰胺。在例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列或其片段或变体。本发明也涉及用于增加热稳定性和/或增加淀粉生物合成和增加植物或植物组织的作物产量的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括将本发明的一种或多种多核苷酸导入植物。在某些实施方案中，导入植物的多核苷酸编码一种或多种多肽，所述多肽包含任一 SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8,SEQID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ ID NO 24 或SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另外的具体实施方案中，该多核苷酸包含 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO : 16所示的核苷酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，该多核苷酸稳定地并入植物或植物组织的基因组。该多核苷酸可以包含引起该多核苷酸和/或所编码多肽的表达增加的调节元件，如启动子和/或增强子序列。在具体实施方案中，启动子序列是提供组成型或组织特异性(例如胚乳)表达的一种启动子。可以任选地对含有该多核苷酸的植物或植物组织或植物子代筛选本发明多核苷酸或多肽增加的表达。在一个实施方案中，将本发明的一种或多种多核苷酸的多重拷贝导入植物或植物组织并且稳定地并入该植物的基因组。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸以本文中所述的表达构建体提供。 本发明也涉及由本发明多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基多肽。在一个实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其片段或变体。在其他实施方案中，该多肽包含 SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24 或 SEQ ID NO 25 所示的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，该多肽包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列或其片段或变体。在又一个实施方案中，该多肽包含任一 SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示的氨基酸序列或其片段或变体。本发明也涉及包含一种或多种本发明突变AGP酶小亚基多肽的突变植物AGP酶。 该突变植物AGP酶也可以包含一种或多种野生型AGP酶大亚基多肽。在具体实施方案中， 突变植物AGP酶包含一种或多种突变AGP酶小亚基多肽，其中任一所述突变AGP酶小亚基多肽可以包含 SEQID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :21、SEQ IDNO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24或SEQ ID NO 25的氨基酸序列或任一这种序列的片段或变体，其中突变AGP酶相对于野生型AGP酶展示出增加的热稳定性。在一个实施方案中，该突变植物酶包含本发明的两个突变AGP酶小亚基，其中突变多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变。 本发明也涉及包含一种或多种本发明突变AGP酶小亚基多肽的突变植物AGP酶和一种或多种突变AGP酶大亚基多肽。在一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽可以是任一美国专利号 5，589，618 ；5，650，557 ；5，872，216 ；6，069，300 ；6，184，438 ；6，403，863 ；6，809，235 ； 7，173，165 ；7，312，378 ；和6，969，783中所述的任一那些突变AGP酶大亚基多肽。在一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽包含Rev6突变。在另一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽包含如美国专利号 6，069，300 ；6，403，863 ；6，809，235 ；7，312，378 及 6，969，783 和公开的国际专利申请号 WO 99/58698 ；W02003/0070901 ；WO 98/22601 及 WO 02/072784 中所述的一种或多种热稳定(HS)突变，例如HS33突变。在一个实施方案中，该突变植物AGP 酶包含本发明的两个突变AGP酶小亚基多肽，其中所述突变AGP酶小亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变，如本文中所述。在另一个实施方案中，该突变植物AGP酶包含两个突变AGP酶大亚基多肽，其中所述突变AGP酶大亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变。在又一个实施方案中，该突变植物AGP酶包含本发明的两个突变AGP 酶小亚基多肽和两个突变SH2多肽，其中所述突变AGP酶小亚基多肽和突变AGP酶大亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变，如本文中所述。本发明也涉及用于提供相对于野生型植物AGP酶具有增加的热稳定性的突变植物AGP酶的方法。在一个实施方案中，该方法包括在AGP酶中与野生型或突变AGP酶大亚基一同并入或提供一种或多种本发明的突变AGP酶小亚基多肽。在一个实施方案中，该AGP 酶包含多肽亚基的四聚体，其中1个、2个或更多个亚基是本发明的突变多肽。在一个实施方案中，该AGP酶也包含突变AGP酶大亚基多肽亚基，如包含Rev6和/或热稳定性突变如 HS33的突变大亚基。本发明也涉及本发明的植物、植物组织和植物细胞，它们包含本发明的多核苷酸或由本发明的多核苷酸编码的蛋白质，或者表达本发明的突变多肽或其片段或变体，或者包含或表达本发明的突变植物AGP酶。植物组织包括但不限于种子、接穗和根状茎。在本发明的范围内的植物包括单子叶植物，如稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、 洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。在本发明的范围内的植物也包括双子叶植物，如番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝(kale)、扁豆、大豆、菜豆、 烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜(radish)、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘 (包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。在本发明的范围内也构思了含有本发明多核苷酸的草本植物。草本植物包括欧芹、鼠尾草、迷迭香、百里香等。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞是玉米(Zea mays)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞是转基因植物、植物组织或植物细胞。在另一个实施方案中， 植物、植物组织或植物细胞是已经通过育种程序获得的一种植物、植物组织或植物细胞。在本发明中有用的多核苷酸可以在表达构建体中提供。本发明的表达构建体通常包括在该表达构建体待于其中表达的预定宿主细胞中有功能的调节元件。因而，本领域普通技术人员可以选择用于细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞中的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。如本文中所用，术语“表达构建体”指引起有效连接的核酸序列转录的核酸序列的组合。如本文中所用，术语“有效连接”指所述组件的毗连，其中所述组件处在允许它们以其意图方式发挥功能的关系中。通常。有效连接的组件处于相邻关系中。本发明的表达构建体可以包含与编码本发明突变多肽的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。使用本领域已知的标准技术，可以将启动子并入多核苷酸。可以在本发明的表达构建体中使用启动子的多重拷贝或多种启动子。在优选的实施方案中，启动子可以在表达构建体中离转录起始位点以该启动子在其天然遗传环境中距转录起始位点大约相等的距离布局。允许这种距离的某些变化，而不明显减少启动子活性。在表达构建体中一般包括转录起始位点。如果该表达构建体将在植物细胞中提供或导入植物细胞，则可以使用植物病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S (包括增强的CaMV 35S启动子(见，例如美国专利号5，106，739))或CaMV 19S启动子或木薯叶脉花叶病毒启动子。可以用于植物中表达构建体的其他启动子包括例如prolifera启动子、Ap3启动子、热休克启动子、根癌农杆菌 (A. tumefaciens)的T-DNA 1'-或2'-启动子、多聚半乳糖醛酸酶启动子、来自碧冬茄属(petunia)的查尔酮合酶A(CHS-A)启动子、烟草PR-Ia启动子、遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子、alcA基因启动子、pin2启动子(Xu等人、1993)、玉米WipI启动子、玉米trpA基因启动子(美国专利号5，625，136)、玉米⑶PK基因启动子，并且也可以使用RUBISCO SSU 启动子(美国专利号5，034，322)。可以使用组织特异性启动子，例如果实特异性启动子，如番茄的E8启动子(登录号AF515784 ；Good等人(1994))。果实特异性启动子如花器官特异性启动子可以随本发明的表达构建体一起使用以在植物的花器官中表达本发明的多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括美国专利号6，462，185 ；5, 639，948和5，589，610 中所述的任意启动子序列。也可以使用种子特异性启动子和其他种子特异性启动子，如来自(例如菜豆的)菜豆蛋白基因或(例如大豆的)大豆球蛋白基因的启动子。胚乳特异性启动子包括但不限于MEGl (EPO专利号ΕΡ1528104)和Wu等人(1998)、Furtado等人 (2001)和Hwang等人(2002)描述的那些胚乳特异性启动子。根特异性启动子如在美国专利号6，455，760或美国专利号6，696，623中或在公开的美国专利申请号20040078841 ； 20040067506 ；20040019934 ；20030177536 ；20030084486 或 20040123349 所述的任意启动子序列可以随本发明的表达构建体一起使用。还构思了组成型启动子(如CaMV、遍在蛋白、 肌动蛋白或NOS启动子)、发育调节型启动子和诱导型启动子(如可以受热、光、激素或化学品诱导的那些启动子)随本发明的多核苷酸表达构建体一起使用。本发明的表达构建体可以任选地含有转录终止序列、翻译终止序列、编码信号肽的序列和/或增强子元件。转录终止区一般可以从真核或病毒基因序列的3'非翻译区获得。转录终止序列可以位于编码序列下游以引起有效终止。信号肽序列是一般在蛋白质氨基末端存在的短氨基酸序列，该序列负责将有效连接的成熟多肽再定位至各式各样的从特定细胞器区室至蛋白质作用部位的翻译后细胞目的地和胞外环境。构思了通过使用有效连接的信号肽序列将基因产物靶向至预期细胞和/或胞外目的地用于本发明的多肽。经典增强子是增加基因转录的和也可以包含于表达构建体中的顺式作用元件。经典增强子元件是本领域已知的，并且包括但不限于CaMV35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件和SV40增强子元件。增强基因表达的内含子介导增强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录的区域内部并且是方向依赖的。实例包括玉米皱缩-1增强子元件 (Clancy 禾口 Hannah，2002)。指导从表达构建体转录出的mRNA多腺苷酸化的DNA序列也可以包含于表达构建体中，并且包括但不限于章鱼碱合酶信号或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体也可以包括指导其他基因转座的多核苷酸序列，即转座子。本发明的多核苷酸可以由RNA或DNA组成。优选地，多核苷酸由DNA组成。本发明也包括与本文中所公开多核苷酸在序列上互补的那些多核苷酸。本发明的多核苷酸和多肽可以以纯化或分离的形式提供。因为遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸序列可以编码本发明的突变多肽。 显示全部可能三联密码子(并且其中U也代表T)和由每个密码子编码的氨基酸的表在 Lewin(1985)中描述。此外，产生编码相同或基本上相同的本发明多肽的备选多核苷酸序列完全在本领域内技术人员技能范围内。这些变体或备选多核苷酸序列属于本发明的范围。 如本文中所用，称谓“基本上相同的”序列指编码不实质上改变由本发明多核苷酸所编码多肽的功能活性的氨基酸置换、缺失、添加或插入的序列。本发明的范围内也包括编码本发明野生型或突变多肽的核苷酸序列的等位变体。在本发明的范围内也构思了置换除本发明的野生型或突变多肽和/或AGP酶中特别例举或天然存在的那些氨基酸之外的氨基酸。例如，非天然氨基酸可以置换突变AGP酶小亚基多肽的氨基酸，只要具有置换的氨基酸的突变多肽基本上保留与其中氨基酸没有被置换的突变多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的实例包括但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2，4- 二氨基丁酸、α -氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、Y -氨基丁酸、ε -氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、 正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如β -甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、 N-甲基氨基酸和常见的氨基酸类似物。非天然氨基酸也包括具有衍生化侧基团的氨基酸。 另外，蛋白质中的任意氨基酸可以是D(右旋)形式或L(左旋)形式。本发明的范围内也包括本发明的野生型或突变AGP酶小亚基或大亚基多肽的蛋白质序列的等位变体。氨基酸通常可以划分为以下类别非极性、不带电荷极性、碱性和酸性。这样的保守性替换属于本发明的范围，其中具有一个类别的氨基酸的本发明突变AGP酶小亚基多肽和/或野生型或突变AGP酶大亚基多肽被相同类别的另一种氨基酸替换，只要具有该置换的多肽仍基本上保留与没有该置换的多肽相同的功能活性(例如，AGP酶的酶的活性和/或增加的热稳定性)。本发明范围内构思了编码在序列中具有一个或多个氨基酸置换的突变 AGP酶小亚基多肽和/或野生型或突变AGP酶大亚基多肽的多核苷酸。下表1提供属于每个类别的氨基酸的一系列实例。
权利要求
1.编码突变植物AGP酶小亚基蛋白或所述蛋白质的功能性片段的多核苷酸，所述的蛋白质包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基蛋白第462位置处的苏氨酸氨基酸相对应的氨基酸由表达所述突变AGP酶小亚基以形成AGP酶时赋予增加的热稳定性的氨基酸替换。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其中赋予增加的热稳定性的所述替换氨基酸是异亮氨酸。
3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的突变AGP酶小亚基是玉米胚乳AGP酶小亚基。
4.根据权利要求1的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变植物AGP酶小亚基蛋白包含任一 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :21、 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24 或 SEQ ID NO 25 所示的氨基酸序列或其功能性片段。
5.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含任一SEQ IDNO=U SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列或其功能性片段。
6.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在表达构建体中提供。
7.编码嵌合的植物AGP酶小亚基蛋白或所述蛋白质的功能性片段的多核苷酸，其中所述嵌合的AGP酶蛋白质包含来自第一植物的植物AGP酶小亚基的氨基端区中的氨基端序列和来自第二植物的植物AGP酶小亚基的羧基端区中的羧基端序列，并且所述嵌合的植物 AGP酶小亚基蛋白包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基蛋白第462位置处的苏氨酸氨基酸相对应的氨基酸由表达所述突变AGP酶小亚基以形成AGP酶时赋予增加的热稳定性的氨基酸替换。
8.根据权利要求7的多核苷酸，其中所述的氨基端序列包含所述第一植物的AGP酶的所述亚基氨基端区的头150个至250个氨基酸并且所述的羧基端序列包含所述第二植物的 AGP酶的所述亚基羧基端区的末尾300个残基或更少残基。
9.根据权利要求7的多核苷酸，其中赋予增加的热稳定性的所述替换氨基酸是异亮氨酸。
10.根据权利要求7至9任一项的多核苷酸，其中所述的氨基端区来自玉米胚乳AGP酶小亚基。
11.根据权利要求7至9任一项的多核苷酸，其中所述的羧基端区来自马铃薯块茎AGP酶小亚基。
12.根据权利要求7的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述植物AGP酶小亚基蛋白包含任一 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO 10 所示的氨基酸序列或其功能性片段。
13.根据权利要求7的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含任一SEQID N0:3、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示的核苷酸序列或其功能性片段。
14.根据权利要求7至13任一项的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在表达构建体中提{共。
15.多肽，其由以下多核苷酸编码a)根据权利要求1至6任一项的多核苷酸；或b)根据权利要求7至14任一项的多核苷酸。
16.转化的或转基因的植物或植物组织或细胞，其包含a)根据权利要求1至6任一项的多核苷酸；或b)根据权利要求7至14任一项的多核苷酸；或c)a)和b)两者的多核苷酸。
17.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中植物或植物组织或细胞也表达玉米AGP酶大亚基。
18.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中植物或植物组织或细胞表达AGP 酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
19.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
20.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物或植物组织或细胞是单子叶的。
21.根据权利要求20的植物或植物组织或细胞，其中所述的单子叶植物或植物组织或细胞选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
22.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物是玉米(Zeamays)或所述的植物组织或细胞来自玉米。
23.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物或植物组织或细胞是双子叶的。
24.根据权利要求23的植物或植物组织或细胞，其中所述的双子叶植物或植物组织或细胞选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘 (包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
25.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物组织是种子、接穗或根状茎。
26.突变植物AGP酶，包含权利要求15的一种或多种突变多肽。
27.提高植物对热胁迫条件的抗性和/或增加植物的淀粉生物合成的方法，所述方法包括将一种或多种多核苷酸并入植物的基因组中并且表达由所述多核苷酸编码的蛋白质， 其中所述的多核苷酸是或包含a)根据权利要求1至6任一项的任一多核苷酸；和/或b)根据权利要求7至14任一项的任一多核苷酸。
28.根据权利要求27的方法，其中植物也表达玉米AGP酶大亚基。
29.根据权利要求27的方法，其中植物表达AGP酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
30.根据权利要求27的方法，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
31.根据权利要求27的方法，其中所述植物是单子叶的。
32.根据权利要求31的方法，其中所述的单子叶植物选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、 高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
33.根据权利要求27的方法，其中所述植物是玉米。
34.根据权利要求27的方法，其中所述植物是双子叶的。
35.根据权利要求34的方法，其中所述的双子叶植物选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
36.用于制备具有AGP酶的植物的方法，所述AGP酶在该植物中相对于具有野生型AGP 酶的植物提供增加的热稳定性和/或增加的淀粉生物合成，所述方法包括将一种或多种多核苷酸导入植物细胞并且从所述的植物细胞培育植物，其中所述的多核苷酸是或包含a)根据权利要求1至6任一项的任一多核苷酸；和/或b)根据权利要求7至14任一项的任一多核苷酸。
37.根据权利要求36的方法，其中植物也表达玉米AGP酶大亚基。
38.根据权利要求36的方法，其中植物表达AGP酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
39.根据权利要求36的方法，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
40.根据权利要求36的方法，其中所述植物是单子叶的。
41.根据权利要求40的方法，其中所述的单子叶植物选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、 高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
42.根据权利要求36的方法，其中所述植物是玉米。
43.根据权利要求36的方法，其中所述植物是双子叶的。
44.根据权利要求43的方法，其中所述的双子叶植物选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
全文摘要
本发明涉及用于向植物或植物组织提供增加的热条件抗性和/或增加的淀粉生物合成的材料和方法。与升高的温度处通常观察到的产量损失相比较，植物或植物组织增加的热条件抗性提供降低的产量损失。本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。本发明也包括由本发明的多核苷酸编码的突变植物AGP酶小亚基。本发明也涉及包含本发明多核苷酸的植物和用于制备该类植物的方法。
文档编号C12N15/52GK102203256SQ200980112664
公开日2011年9月28日 申请日期2009年3月26日 优先权日2008年4月9日
发明者L·C·哈拿, N·杰奥尔杰利斯 申请人:佛罗里达大学研究基金公司