专利名称：用于在化学成分确定的培养基中培养细胞的合成表面的制作方法
用于在化学成分确定的培养基中培养细胞的合成表面 相关申请本申请要求2008 年 1 月 30 日提交的，名为 “Synthetic Surfaces forCulturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media(用于在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞的合成表面)，，的美国临时申请序列号61/062，890和2008年 1月30日提交的，名为“Stem Cell Article andScreening(干细胞制品和筛选)”的美国临时申请序列号61/062，937的优先权。领域本发明涉及细胞培养制品，更具体地说涉及用于在化学成分确定的培养基中支持未分化干细胞培养的制品。背景多能干细胞，如人类胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力， 从而在人体中形成任何成人细胞类型。这种独特的性能为开发大量严重的细胞退化疾病， 如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等的新治疗方法提供了可能性。然而，开发这种hESC治疗有障碍。此类障碍包括在细胞和组织培养中获得并维持足够量的未分化hESC和控制其分化以产生特定细胞类型。干细胞培养，如hESC细胞培养通常用细胞库或细胞储备物的少量细胞接种，然后在未分化的状态下扩增直至给定的治疗用途需要分化。为达到这点，目前在有含动物衍生的成分(如滋养层、胎牛血清或MATRIGEL )的表面或培养基存在下培养hESC或其分化细胞群。向培养环境添加这些动物衍生的东西使得细胞接触可能有害的病毒或其它传染性物质，这些有害的病毒或其它传染性物质会转移到患者或损害hESC的常规培养和维持。此外，此类生物产品易产生批次差异、免疫反应和存储寿命有限。虽然目前已在动物衍生的表面上用化学成分确定的培养基，例如MATRIGEL 和蛋白质，例如血清蛋白或胞外基质蛋白培养未分化干细胞，但尚未鉴定到利用化学成分确定的培养基和合成的非蛋白质表面的完全不含动物产品的体系来长期培养未分化细胞。简述本发明描述了可用于在化学成分确定的培养基中培养包括干细胞和未分化干细胞的真核细胞的合成表面。在合成基材上培养时，未分化的干细胞可维持未分化5、7、10代或更多代。在各种实施方式中，细胞培养制品包括具有表面的基材。将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层设置在基材表面上。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层可由包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(二 -官能或更高-官能)(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体及交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层水中的平衡水含量为约5%-约70%。肽偶联于可溶胀的(甲基) 丙烯酸酯层(conjugate)。该肽含有RGD氨基酸序列。细胞培养制品可负载未分化干细胞， 例如人胚胎干细胞在化学成分确定培养基中的培养和维持。在各种实施方式中，制备细胞培养制品的方法包括将单体沉积在细胞培养制品的基材表面上。沉积在表面上的单体包括含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体和交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体。该方法还包括在基材表面上聚合单体以形成水中平衡水含量为约5% -约70% 的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。该方法还包括将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层与肽结合， 所述肽可以是含RGD的多肽。与现有的用于培养干细胞，特别是未分化干细胞的表面相比，本文的一个或多个实施方式提供一种或多种优点。例如，合成表面减少与具有得自或衍生自动物来源的组分的表面相关的潜在污染问题。与含生物学组分的表面相比，此类表面还可改善储存寿命。能在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞进一步减少了潜在的污染问题。此外，合成表面或化学成分确定的培养基的工作性能在批次之间的差异可能较低，从而改善培养结果和预计的重现性。结合附图阅读时，从以下详述不难理解这些和其它优点。附图简述图1A-1B是涂布合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的制品的侧视图。图2A-2C是具有孔的细胞培养制品的截面的示意图。未涂布的表面OA)；涂布表面QB)；涂布的表面和侧壁OC)。图3A是偶联于多孔板中1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。图;3B是偶联于多孔板中0. 1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。图3C显示了涂布在1微米或0. 1微米厚表面上的多肽浓度与荧光强度关系图。图4显示了对由Quantiftx) BCA试验获得的数据的多肽浓度与570nm吸光度关系图。图5是多肽浓度与根据层粘连蛋白归一化的570nm吸光度的关系图，显示了为测定HT-1080与各种基材粘附而设计的试验的结果。图6显示了在具有特定偶联多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材上，用化学成分确定的培养基培养的未分化hESC的相对数量(根据AttoWlos荧光强度)。图7A-7C是在MATRIGEL 基材(A)、含偶联肽(SEQ ID NO 4)(如图6中鉴定的) 的可溶胀(甲基)丙烯酸酯(B)、或单独可溶胀(甲基)丙烯酸酯(C)上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的集落图像。图8显示了在偶联有各种浓度肽(SEQ ID NO :4)(如图6中鉴定的)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的相对数量(根据 AttoPhos荧光强度)。图9显示了在可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材的各种实施方式上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的相对数量(根据AttoWlos荧光强度)。图IOA和IOB是可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂偶联于肽 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY"NH2(SEQ ID NO :4)之后的各实施方式中，在化学成分确定的培养条件下未分化H7hES细胞相对数量(根据AttoWlos荧光强度)的柱状图。图11是在偶联于各实施方式的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的IO-UOO-和 1000-浓度的 I-FN (SEQ ID NO :12)、s_FN(SEQ ID NO :11)和 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY_NH2 (SEQ ID NO 4)上培养的未分化H7hES细胞相对数量(根据AttoWlos荧光强度)的柱状图。
图12是显示HT-1080与偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的二硫键结合的环状多肽的相对附着(通过OD 570nm)的柱状图。图13是显示HT-1080与偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的酰胺键结合的环状多肽的相对附着(通过OD 570nm)的柱状图。图14是显示在偶联有酰胺键结合的环状多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的未分化H7hES细胞相对数量(通AttoPhos荧光强度)的柱状图。图15是显示在偶联有二硫键结合的环状多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的未分化H7hES细胞相对数量(通AttoPhos荧光强度)的柱状图。图16显示在MATRIGEL (MG)表面、偶联有确定的含RGD肽(SEQ IDNO 4) (BSP) 的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层、和偶联有确定的含RGD肽与连接基团(BSP-PE04)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上，在化学成分确定的、不含动物产物的培养基条件下培养的未分化 H7hESC的倍增时间。图17A-17C比较了接种后第7天，人间充质干细胞(hMSC)在SAP-BSP肽-丙烯酸酯上与标准TCT塑料细胞培养器皿上的存活/增殖。图18是比较在包括成分确定的培养基在内的不同培养基条件下，培养7天后TCT 和SAP-BSP上hMSC细胞数量的柱状图。图19比较了用本发明细胞培养表面的一种实施方式与MATRIGEL 涂层培养时， H7hESC在10代中的倍增时间。图20显示了在MATRIGEL 对照或SAP-BSP表面培养10代的H7hESC的hESC-特异性标记的流式细胞术分析结果。图21A是显示在SAP-BSP肽偶联的丙烯酸酯表面上分化的心肌细胞的辅肌动蛋白和Nkx2.5+染色的荧光图像。图21B显示α辅肌动蛋白的流式细胞术数据，图21C显示在本发明细胞培养表面的实施方式上自H7hESC分化的Nkx2. 5心肌细胞的流式细胞术数据。图22是比较有血清存在和没有血清存在的条件下，HT-108-细胞在TCT、SAP-BSP 表面上的HT1080细胞增殖数据(通过490nm吸光度)的柱状图。图23比较在有血清存在和没有血清存在的条件下，HT-1080细胞在TCT和(甲基) 丙烯酸酯涂层和BSP偶联的涂层上的形态的图像。图24是比较SA-P、胶原I和CellBind 处理的Topas 上存活细胞估计数量(LDH 活性的吸光度)的柱状图。图1-2所绘附图不一定按比例。图1-2中所用的类似数字指类似的组分。然而， 应该知道在给定附图中用某数字指代某组分并非限制另一附图中用相同数字标记的组分。 此外，利用不同数字指代诸组分并非表示不同编号的组分不能相同或相似。详述以下详述参考构成其一部分的附图，显示的
了装置、系统和方法的数个具体实施方式
。要理解，也考虑了其它实施方式，可作出其它实施方式而不偏离本发明的范围或构思。因此，以下详述并非限制性的。除非另有规定，本文使用的所有科学和技术术语具有本领域常规使用的含义。本文提供的定义有助于理解本文经常使用的某些术语，并不意味着限制本发明的范围。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的单数形式 “一个”、“一种”和“该”包括复数形式。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的术语“或”通常按其包括“和/或”的意义使用。就某种方法而言，本文所用的“提供”某制品表示制备、购买、制造、供应或以其它方式获得该制品从而该制品可用于该方法中。肽序列在本文中以其单字母或三字母密码指代。这些密码可互换使用。本文所用的“单体”表示能与另一单体聚合的化合物(无论该“单体”是与另一单体相同还是不同的化合物)，该化合物的分子量低于约1000道尔顿。在许多情况中，单体的分子量低于约400道尔顿。本文所用的“合成涂层”或“合成聚合物层”表示设置在细胞培养基材上的聚合物材料层。聚合涂层不包括动物衍生的材料或成分。例如，合成涂层不具有从动物来源分离的蛋白质。在各实施方式中，本文所述的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层(SA)层提供合成涂层。 在各实施方式中，合适的粘着多肽或多肽的组合可偶联于合成涂层，形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯-肽偶联层(SAP层)。本文所用的“肽”和“多肽”表示可化学合成或可重组衍生，但不是作为完整蛋白自动物来源分离的氨基酸序列。为本发明的目的，肽和多肽不是完整的蛋白。肽和多肽可包含作为蛋白质的片段的氨基酸序列。例如，肽和多肽包含的序列可以是已知的细胞粘附序列， 例如RGD。在一些实施方式中，本发明肽长3-30个氨基酸。在一些实施方式中，本发明肽是 15聚体、12聚体、10聚体等。在各实施方式中，肽可包含接头序列，例如KGG(LysGlyGly)或 KYG(LysTyrGly),该接头序列提供Lys残基从而为肽偶联提供官能团。肽可以乙酰化(例如，Ac-LysGlyGly)或酰胺化(例如，SerLysSer-NH2)以保护它们免于被，例如外肽酶切断。 应该知道，公开某序列时，要考虑这些改进形式。在额外的实施方式中，肽可以偶联于间隔部分，例如PEO。PEO可以是，例如PEO4或PEO12或任何长度的间隔基团。本文所用的“(甲基)丙烯酸酯单体”表示具有至少一个烯键式不饱和部分(丙烯酸酯部分或甲基丙烯酸酯部分)的化合物。本文所用的“聚(甲基)丙烯酸酯”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酸酯单体在内的一种或多种单体形成的聚合物。术语“水凝胶”已用于描述细胞培养表面。“水凝胶”定义各异，包括吸水量大于或等于其干重的30%或最高10，000%的凝胶或明胶。接触水时，水凝胶溶胀但不溶解。术语 “水凝胶”是极为宽泛的术语，描述了具有宽泛的水溶胀和吸水特征的各种材料。本文所用的“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯”或“SA”表示用至少一种烯键式不饱和单体(丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体)制备的合成聚合物层，该单体至少具有一定交联程度，还具有吸水或水溶胀特征。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可以是合成的。即，它们不含有衍生自动物或动物提取物的成分。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可偶联于多肽或蛋白质(“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯-多肽”、“SA-多肽”或“SAP”)。多肽或肽是蛋白质的片段，可以合成它们，从而将它们制成合成的、非动物来源的材料。可在动物来源的材料分离蛋白质。 该SA和SAP材料可以指层、涂层、表面、材料或本领域已知指代适合细胞培养的表面的任何其它术语。可进一步鉴定具体的肽序列。例如，SAP表面可偶联于含RGD的多肽，可标识为 SAP-RGD0或者，SAP表面可偶联于特定含RGD的肽，例如KGGNGEPRGDTYRAY (SEQ ID NO 4)， 掺入小鼠骨头唾液(Bonesialo)蛋白(BSP)的RGD粘附表位，可偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯聚合物(SAP)从而形成SAP-BSP涂层。在本发明的实施方式中，术语“可溶胀的(甲
8基)丙烯酸酯”代表了吸水、在水中溶胀但不在水中溶解的各种交联的丙烯酸酯或甲基丙烯 酸酯材料。可通过式1所示的平衡水含量(EWC)描述和检测该吸水特征式1 :EWC(% ) = (W凝胶-W干)/(W凝胶 *100)本文所用的“具有”、“包括”、“包含”等以其开放含义使用，通常表示“包括，但不限于”。应该知道，“基本上由...构成”、“由...构成”等归类在“包含”等内。因此，从包含亲水性单体、交联单体和含羧基单体的单体混合物形成的SA表面可以从基本上由，或由亲水性单体、交联单体和含羧基单体构成的混合物形成。本发明描述了具有合成表面以供培养未分化干细胞的制品。所述表面可支持未分化干细胞在化学成分确定的培养基中增殖和维持。1.细胞培养制品参看图1A，示出了用于培养细胞的制品100的侧视图。该制品100包括具有表面 15的基底材料基材10。将可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层20设置在基材或基底材料10的表面15上。尽管未示出，但要理解，将可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层20设置在基材或基底材料10的一部分上。基材或基底材料10可以是适于培养细胞的任何材料，包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它们的任意组合，或者一种材料在另一种材料上的涂层。此类基材或基底材料10包括玻璃材料，如钠钙玻璃、耐火玻璃、高硼硅酸耐热玻璃、石英玻璃；硅； 塑料或聚合物，包括树枝状聚合物如聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、 聚(乙酸乙烯酯-合-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环状烯烃聚合物、 氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如乙酸乙烯酯_马来酸酐共聚物、苯乙烯_马来酸酐共聚物、乙烯_丙烯酸共聚物或者它们的衍生物等。本文所用的“环状烯烃共聚物”表示由多于一种单体形成的聚合物，其中至少一种单体是环状烯烃单体，至少一种其它单体不是环状烯烃单体。在许多实施方式中，用乙烯和降冰片烯(norbonene)单体形成环状烯烃共聚物。环状烯烃共聚物树脂可以商品名 TOPAS 自波戴克塑料公司(Boedeker Plastics, Inc)商业购得。适于细胞培养的制品100的例子包括单孔和多孔板，如6、12、96、384和1536孔板、罐、培养皿、烧瓶、多层烧瓶、烧杯、平板、滚瓶、载玻片(如有室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋、膜、中空纤维、珠和微载体、杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器、CellStack 和发酵罐。可溶胀(甲基)丙烯酸酯(SA)涂层20提供在其上偶联一种或多种多肽70的表面25。当然，所述一种或多种多肽70还可在表面25之下的位置偶联于SA层20。本文所用“偶联于”表示共价结合。多肽70与SA层20的共价结合可通过连接基团发生。多肽70 可以是环状或线形的，或可含有环状部分和线形部分。出于本发明的目的，“肽”和“多肽”可互换使用。可将任何合适的SA涂层20施加于基材10的表面15上或在其上形成。在各种实施方式中，SA涂层包含一种或多种亲水性(甲基)丙烯酸酯单体、一种或多种二-官能或更高-官能(甲基)丙烯酸酯单体(“交联的”(甲基)丙烯酸酯单体)和一种或多种含羧基单体的反应产物，或基本上由所述反应产物构成或由它们构成。可利用任何合适的亲水性(甲基)丙烯酸酯单体。合适的亲水性 (甲基)丙烯酸酯单体的例子包括甲基丙烯酸2-羟乙酯、二(乙二醇)乙基醚甲基丙烯酸酯、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯等。在各种实施方式中，可利用除(甲基)丙烯酸酯以外的亲水性单体以形成SA涂层。除亲水性(甲基)丙烯酸酯单体外，可包含这些其它亲水性单体， 或用这些其他亲水性单体替代。此类其它亲水性单体应能与用于形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20的混合物中的(甲基)丙烯酸酯单体聚合。可用于形成SA涂层的其它亲水性单体的例子包括1-乙烯基-2-吡咯烷酮、丙烯酰胺、3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵等。无论使用(甲基)丙烯酸酯单体还是其它单体，在各种实施方式中，亲水性单体在水中具有一定溶解度，即在100克水中溶解1克或更多的单体。任何合适的二 -官能或更高-官能(甲基)丙烯酸酯单体，例如二甲基丙烯酸四(甘醇)酯或二丙烯酸四(甘醇)酯可用作交联单体。可利用具有羧基官能团的任何合适(甲基)丙烯酸酯单体，从而能在单体通过聚合结合到SA涂层20后用于与多肽70偶联。羧基官能团能采用NHS/EDC 化学方法偶联肽或多肽。合适的含羧基的(甲基)丙烯酸酯的例子包括丙烯酸2-羧乙酯和丙烯酸。在各种实施方式中，从分别包含以下(以体积百分比计)的单体形成SA层20 亲水性(甲基)丙烯酸酯单体(约60-90)、含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体(约10-40)和交联(甲基)丙烯酸酯单体(约1-10)。应该知道可通过选择单体形成SA层的方式来控制 SA层的平衡水含量(EWC)。例如，高度亲水性和较高百分比的亲水性单体应产生EWC较高的更可溶胀的SA层。然而，通过提高交联单体的百分比或增加其官能度会降低SA层的溶胀能力并降低EWC从而减弱该作用。在各种实施方式中，选择用于形成SA层的具体单体和它们各自的重量或体积百分比使得到的SA层的EWC在约5% -约70%范围。部分由于本文所述各种实施方式的SA 中使用含羧基的单体，EWC可以是pH依赖性的。例如，在磷酸缓冲液(pH 7.4)中，特定SA 的EWC可能高于在蒸馏的去离子水(pH约5)中的。在各种实施方式中，某SA层在蒸馏去离子水中的EWC是本发明SA的在水中的EWC(水中)，在5% -70%,5% -60%,5% -50%, 5-40%,5% -35%、10% -70%、10% -50% ,10-40%,5% -35%、10% -35%或 15% -35%范围。在进一步的实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯与肽偶联后(SAP)，各实施方式的本发明SAP在水中的EWC可以是，例如10-40% (数据未显示)。在细胞培养中，制备的表面长期接触水性环境。显著吸水的表面、高度水凝胶样的表面在接触水性环境时可能易于从基材脱层。当这些材料长期接触水性环境，例如细胞培养5天或更多天时，可能尤其如此。因此，SA和SAP层的EWC检测值最好较低，因而不会吸收太多的水以降低脱层可能性。例如，EWC低于40%的SA表面可能尤其适合支持包括人胚胎干细胞在内的细胞培养。应该知道，多肽70与SA层20的偶联可影响SA层的可溶胀性和平衡水含量(EWC)， 通常是增加EWC。偶联于SA层的多肽量可以不同，可根据SA层的厚度改变。因此按照标准方法制备的SA-多肽层的EWC可以不同。出于重现性的目的，优选先检测SA层的EWC再偶联于多肽。注意到这一现象，在一些实施方式中，SA与多肽偶联后(SA-多肽)，各种实施方式的SA-多肽层在水中的EWC可以是约10-40%。在各种实施方式中，SA层20包括从包含甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯的混合物形成的聚合(甲基)丙烯酸酯单体。在许多实施方式中，用于形成SA层20的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯的比例(以体积计)分别是约80/20/3 (ν/ν/ν)。在一些实施方式中，分别利用以下单体的液体试样(以体积计)配制SA 甲基丙烯酸羟乙酯(约60-90)、丙烯酸2-羧乙酯 (约10-40)和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯(约1-10)。在许多实施方式中，SA层20基本上由聚合的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯单体构成。 在各种实施方式中，SA层20基本上不含多肽交联剂。 在许多实施方式中，利用以下单体(以液体单体的体积或固体单体的重量计)配制SA:单体X(SO)、丙烯酸2-羧乙酯(20)和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯(3)。单体X是 甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵。任何合适的多肽70可偶联于SA层20。多肽70优选包含能偶联于SA层20的氨基酸；例如，通过含羧基(甲基)丙烯酸酯单体形成的游离羧基。例如，为偶联于SA层20， 多肽70中可包含具有能进行亲核加成的官能团的任何天然或仿生氨基酸，例如通过形成酰胺键。赖氨酸、高赖氨酸(homolysine)、鸟氨酸和二氨基丁酸是具有合适特性以供偶联于 SA层20的羧基的氨基酸的例子。此外，可利用多肽的N-末端α胺偶联于羧基，如果N-末端胺未加帽的话。在各种实施方式中，偶联于SA层20的多肽70的氨基酸位于多肽70的羧基末端位置或氨基末端位置。在许多实施方式中，多肽70或其一部分具有细胞粘附活性，即，当多肽70偶联于 SA层时，该肽使得细胞粘附于含有SA-P层的表面。例如，多肽70可包含胶原、角蛋白、明胶、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白等的氨基序列或其细胞粘附部分。在各种实施方式中，多肽 70 包括 Yaa1XaanArgGlyAspXaamYaa1K示氨基酸序列(SEQ ID NO 1) (RGD)，其中 Xaa和Yaa代表合成或天然的任何氨基酸，η和m可以是包括0的任何整数。本文所述的 SA层提供可与任何合适的粘附多肽或多肽组合偶联的合成表面，从而提供组分未知的生物学基材或血清的备选方案。在目前的细胞培养实践中，已知一些细胞类型需要在培养表面上存在生物学多肽或肽的组合以便细胞粘附于该表面并持续培养。例如，有血清存在下， !fepG2/C3A肝细胞粘附于塑料培养器皿。还知道血清可提供能粘附于塑料培养器皿的多肽， 从而提供可粘附某些细胞的表面。然而，生物学来源的基材和血清含有未知的组分。对于导致细胞粘附的血清或生物来源基材的特定组分或组分(肽)组合已知的细胞，可合成那些已知的肽并施加于本文所述SA层以使细胞在不具有或几乎不具有来源或组成未知组分的合成表面上培养。在一些实施方式中，肽70包括Yaa1XaanArgGlyAspXaamYaa1所示氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，其中η是0-4的整数，m是0_5的整数，1是0或1，条件是肽70包含至少一个 Yaa,各Xaa独立为任何天然或仿生氨基酸，Yaa是任何天然或仿生氨基酸，其中Xaa或Yaa 具有能与SA表面的游离羧基进行亲核加成的官能团；例如通过形成酰胺键。在各种实施方式中，Xaa或Yaa可以是赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸。在一些实施方式中，多肽70包含ZaaXaanArgGlyAspXaamBaa所示氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，其中η是0-4的整数，m是0_5的整数，各Xaa独立为任何天然或仿生氨基酸，Zaa 和Baa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，在它们各自侧链的原子之间形成共价键，从而形成环状多肽或其一部分。在各种实施方式中，Zaa和Baa通过二硫键相连。例如，Zaa或Baa可以是半胱氨酸、高半胱氨酸或青霉胺。在一些实施方式中，Zaa和Baa通过酰胺键相连。例如，Zaa和Baa之一是侧链具有游离氨基的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸，Zaa和Baa中另一个是侧链具有游离羧基的氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸或高谷氨酸(homoglutamic acid)。在一些实施方式中，SEQ ID NO :2所示多肽70可以进一步限定为包含 ^￡^a￡imZaa)(aanArgGlyAsp)(a￡imBaa XaamYagi1 所示氨基酸序列(SEQ IDNO 3)，其中η是0-4的整数，m是0_5的整数，1是0或1，条件是该多肽包含至少一个Yaa或 Xaa, Yaa和Xaa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，Zaa和Baa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，在它们各自侧链的原子之间形成共价键，从而形成多肽的环状部分，Yaa或Xaa是任何天然或仿生氨基酸，其具有能与SA表面的游离羧基进行亲核加成的官能团；例如通过形成酰胺键。虽然不想受理论的束缚，但据信与相应的线形多肽相比，含R⑶序列的多肽的环化可有助于在水性环境中维持构象结构以保留生物学功能，特别是当该多肽由较少的， 例如少于10个氨基酸构成时。在一些实施方式中，多肽70 包含 LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAl aTry (SEQ ID NO :4)所示氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽70基本上由AsnGlyGluft· OArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO :5)所示氨基酸序列构成。在一些实施方式中，多肽 70 基本上由 LysGlyGlyLys4AsnGlyGluproArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17 (SEQ ID NO 6)所示氨基酸序列构成，其中Lys4和Asp17—起形成酰胺键以使多肽的一部分环化。在一些实施方式中，多肽 70 基本上由 LysGlyGlyLys4GluProArgGlyAsp ThrTryArgAsp13(SEQ ID NO 7)所示氨基酸序列构成，其中Lys4和Asp13 —起形成酰胺键以使多肽的一部分环化。 在一些实施方式中，多肽 70 基本上由 LysGlyGlyCys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgA IaTyrCys17 (SEQ IDNO :8)所示氨基酸序列构成，其中Cys4和Cys17 —起形成二硫键以使多肽的一部分环化。在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyCystluftOArgGlyAspT hrTryArgCys13(SEQ ID NO 9)所示氨基酸序列构成，其中Cys4和Cys13 —起形成二硫键以使多肽的一部分环化。在各种实施方式中，多肽70基本上由fciaGlyGlyAsnGlyGluftOArgG IyAspThrTyrArgAlaTyr (SEQ IDNO :10)所示氨基酸序列构成，其中Xaa是任何氨基酸。在许多实施方式中，SEQ ID NO: 10的Xaa是赖氨酸。在一些实施方式中，多肽70基本上由 GlyArgGlyAspSerProLys (SEQ ID NO 11)所示氨基酸序列构成。在一些实施方式中，多肽70 基本上由 LysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspkrProA IaSerSer (SEQ ID NO :12)所示氨基酸序列构成。对于本文讨论的任何多肽序列，应该知道保守性氨基酸可取代特别鉴定的氨基酸。本文所用的“保守性氨基酸”指功能上类似于第二种氨基酸的氨基酸。此类氨基酸可按照熟知的技术在多肽中彼此取代而对该多肽的结构或功能干扰很小。以下5组各自含有彼此是保守性取代的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸⑴；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；含硫的甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)； 碱性精氨酸00、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性天冬氨酸(I)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、 谷氨酰胺(Q)。可利用连接基团或间隔基团80，例如重复的聚(乙二醇)连接基团或任何其它合适的连接基团增大多肽70与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20的表面25的距离。连接基团 80可以是任何合适的长度。例如，如果连接基团是重复的聚(乙二醇)连接基团，该连接基团可含有2-10个重复的乙二醇单元。在一些实施方式中，所述连接基团是具有约4个重复乙二醇单元的重复聚(乙二醇)连接基团。多肽70的全部、一些通过连接基团80偶联于SA层20，或者都没有通过连接基团80偶联于合成聚合物层20。提供偶联基团的SA层链还可用作偶联肽的间隔基团。其它可能的连接基团是多肽接头，例如聚(甘氨酸)或聚 (β-丙氨酸)。多肽70可以任何密度，优选以适合于负载未分化干细胞或其它细胞类型培养的密度，偶联于SA层20。多肽70偶联于SA层20的密度可以是约lpmol/mm2-约50pmol/mm2 的SA涂层20的表面25，可通过SAP层20均勻涂布表面15的实施方式中涂布的基底材料基材10的表面15的面积估算。例如，多肽的密度可以大于5pmol/mm2、大于6pmol/mm2、 大于 7pmol/mm2、大于 8pmol/mm2、大于 9pmol/mm2、大于 10pmol/mm2、大于 12pmol/mm2、大于 15pmol/mm2或大于20pmol/mm2的SA涂层20的表面25。应该知道，多肽70的存在量可根 据SA层20的组成、SA层20的厚度和多肽70本身的性质而变化。如以下实施例所述，多肽70的密度较高可更好地支持化学成分确定的培养基中未分化干细胞的粘附和增殖。(甲基)丙烯酸酯单体可如本领域已知的合成得到或从商业零售商获得，例如聚合科学公司(Polysciences，Inc.)、西格玛阿尔得里奇公司(Sigma Aldrich，Inc.)和斯托默公司(Sartomenlnc.)。连接基团80可如本领域已知的合成得到或从商业零售商获得， 例如从量子生物设计公司(Quanta BioDesign, Ltd)购得的独立聚乙二醇(dPEG)连接基团。如图IB所示，可将中间层30设置在基底材料10的表面15和SA涂层20之间。中间层30可设置为改善涂层20与基材10的结合，促进单体铺展，使得表面10的未涂布的诸部分排斥细胞(cytophobic)从而促进细胞在涂布区域生长，提供与单体或溶剂相容的基材(其中所述单体或溶剂与基底材料10不相容)，从而提供结构特征(如果需要的话，例如通过图案印刷等)。例如，如果基材10是玻璃基材，优选用环氧涂层或硅烷涂层处理玻璃基材的表面。对于各种聚合物基底材料10，优选提供聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯或聚 (甲基)丙烯酸酯的中间层30。尽管未示出，但要理解，可将SA涂层20置于中间层30的一部分上。还要理解，可将中间层30置于基底材料10的一部分上。在各种实施方式中，通过物理或化学方法处理基底材料10的表面15以赋予表面 15所需特性或特征。例如，如下所述，可电晕处理或等离子体处理表面15。真空或大气压等离子体的例子包括射频RF和微波等离子体(原发的和次生的)、介电势垒放电和分子或混合气体中产生的电晕放电，所述气体包括空气、氧气、氮气、氩气、二氧化碳、一氧化二氮或水蒸气。SA涂层20，无论处于中间层30或基底材料10上，优选均勻涂布其下的基材。“均勻涂布”表示在给定区域，如培养皿的孔的表面中，层20以约5nm或更大的厚度完全涂布该区域。虽然表面上均勻涂布表面的厚度可以不同，但均勻涂布的表面中没有区域暴露出其下层(中间层30或基底材料10)。与均勻表面的细胞反应相比，非均勻表面的细胞反应更易变。SA涂层20可具有任何所需厚度。在各种实施方式中，涂层20的平均厚度小于约 10微米。例如，平均厚度可以小于约5微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约0. 5微米、约50nm-约300nm或小于约0. 1微米。
形成SA层20的聚合物材料可有任何合适的交联度。低交联度可导致SA层部分或完全溶解和聚合反应效率较低。在各种实施方式中，SA层20的交联密度为约0. 9% -约9%。在许多实施方式中，制品100是具有适于细胞培养表面的细胞培养器皿，例如6、 12、96、384和1536孔板、罐、培养皿、烧瓶、多层烧瓶、烧杯、平板、滚瓶、载玻片(如有室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋、膜、中空纤维、珠和微载体、杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器、CellStack 和发酵罐。在许多实施方式中，这些细胞培养表面包含在细胞培养孔中。 现在参看图2，由基材或基底材料10形成的制品100可包括一个或多个孔50。孔50包括侧壁55和表面15。参看图2B-2C，可将SA涂层20设置在表面15或侧壁55 (或者，如以上看图1所述，一个或多个中间层30可置于表面15或侧壁55或与SA涂层20之间)或其一部分上。如图2C所示，可用SA层20涂布侧壁55。在 各种实施方式中，制品100包括均勻涂布的层20，其具有面积大于约5mm2的表面25。表面25当然可以具有任何合适的尺寸。当表面15的面积太小时，不易观察到可靠的细胞反应，因为一些细胞如人胚胎干细胞作为细胞集落或簇(例如，具有约0. 5mm的直径) 接种，并且需要足够的表面以确保足量的集落粘附以产生定量的细胞反应。在许多实施方式中，制品100具有孔50，该孔具有均勻涂布的表面15，其中表面15的面积大于约0. Icm2, 大于约0. 3cm2，大于约0. 9cm2，或者大于约1cm2。2.合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的涂布可通过任何已知的或将来开发的方法将合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯(SA)层设置在细胞培养制品表面。合成SA层优选提供在典型的细胞培养条件下不会发生脱层的均勻层。即，SA层结合于基材或基底材料。合成SA表面可通过共价或非共价相互作用连接于基底材料基材。可将合成SA表面与基材缔合的非共价相互作用的例子包括化学吸附、氢键、表面互相渗透、离子键、范德华力、疏水性相互作用、偶极子-偶极子相互作用、机械联锁和它们的组合。在各种实施方式中，按照共同待批申请序列号_的揭示内容涂布
基底材料基材表面，该申请在本文同一日期提交，Zhou等为发明人，名为“CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENING(细胞培养制品和筛选)”，该申请出于所有目的通过引用全文纳入本文，其纳入程度以不与本发明冲突为限。在许多实施方式中，单体沉积在细胞培养制品的表面上并原位聚合。在此类实施方式中，本文将基底材料称为“基材”，在其上沉积合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯材料。虽然可在液相或本体相中进行聚合，但在本发明的一些实施方式中，在本体相中聚合、原位聚合产生的细胞培养表面是网络化聚合表面。该网络化聚合表面不是相互渗透的聚合网络。 在各实施方式中，在细胞培养相关时期，在细胞培养的水性环境中，原位聚合提供的网络化聚合表面结合于基材，不脱层并能存留。在各实施方式中，单体低于1000道尔顿。由于单体是粘性的，优选先用合适的溶剂稀释单体以降低粘度，然后再分散到表面上。降低粘度能使得要形成的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯材料层更薄且更均勻。本领域技术人员不难选择合适的溶剂。溶剂优选与形成细胞培养制品的材料和单体相容。优选对待培养的细胞无毒性且不干扰聚合反应的溶剂。此外，优选可以基本上完全除去或除去至无毒或不再干扰聚合程度的溶剂。在此类情况中，希望溶剂无需在严苛条件，例如中空或极端加热下即可方便除去。挥发性溶剂是此类不难除去的溶剂的例子。在各种条件可适合于本文所述涂布制品的一些溶剂包括乙醇、异丙醇、乙酰乙酸酯(acetyl acetate)、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。如在本文同一日期提交的，名为“CELL CULTURE ARTICLE ANDSCREENING(细胞培养制品和筛选)”的共
同待批申请序列号__所述，当需要先除去溶剂再聚合时，挥发性溶剂，例如丙
酮、甲醇、乙酸乙酯、丁酮、乙腈、异丙醇和2-丁醇及乙醇可能是特别适合的溶剂。单体可用任何合适量的溶剂稀释单体以达到所需的粘度和单体浓度。根据本文的指导，所用的单体组合物通常含有约0. 1 % -约99 %的单体。例如，可用乙醇或其它溶剂稀释单体以提供具有约0. -约50%单体、约.01体积％ -约10体积％单体、约0. 1体积％ -约5体积％单体、或约0. 1体积％ -约1体积％单体的组合物。可用溶剂稀释单体， 使可溶胀(甲基)丙烯酸酯层达到所需厚度。如上所述，如果沉积的单体太厚，可产生不均勻的表面，涂层可能在接触水性介质后发生脱层。在各种实施方式中，将合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层设置在中间层的表面上， 该中间层通过共价或非共价相互作用，直接或者通过一个或多个附加的中间层(未示出) 与基底材料缔合。在此类实施方式中，本文将中间层称为“基材”，其上设置有合成的可溶胀 (甲基)丙烯酸酯层。在各种实施方式中，处理基底材料的表面。可对表面进行处理以改善合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层与基底材料表面的结合，以促进单体在基底材料表面上的铺展等。当然可因为与中间层类似的目的处理基底材料。在各种实施方式中，等离子体处理表面。此类处理获得的高表面能可促进单体铺展和均勻涂布。除了形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的单体，形成所述层的组合物可包含一种或多种其它化合物，如表面活性剂、湿润剂、光引发剂、热引发剂、催化剂、活化剂和交联剂。可使用任何合适的聚合引发剂。本领域技术人员能够容易地选择适用于单体的合适引发剂，例如自由基引发剂或阳离子引发剂。在各种实施方式中，使用UV光以产生自由基单体来引发链聚合。可使用任何合适的聚合引发剂。聚合引发剂的例子包括有机过氧化物、偶氮化合物、醌、亚硝基化合物、酰基卤、腙、巯基化合物、吡喃鐺(pyrylium)化合物、咪唑、氯三嗪、 苯偶姻、苯偶姻烷基醚、二酮、苯基酮或其混合物。合适的市售紫外活化和可见光活化的光引发剂的例子例如 IRGACURE 651、IRGACURE 184、IRGACURE 369、IRGACURE 819、DAR0CUR 4265和DAR0CUR 1173，可商品化购自纽约州塔利顿希巴特殊化学品公司(CibaSpecialty Chemicals)，以及LUCIRIN TPO和LUCIRIN TP0-L，商品化购自巴斯夫公司(BASF，北卡罗来纳州夏洛特)。在合适的弓I发剂体系中也可包含光敏剂。代表性的光敏剂具有羰基或叔氨基或其混合物。具有羰基的光敏剂包括二苯甲酮、苯乙酮、苯偶酰、苯甲醛、邻氯苯甲醛、咕吨酮、噻吨酮、9，10-蒽醌和其它芳族酮。具有叔胺的光敏剂包括甲基二乙醇胺、乙基二乙醇胺、三乙醇胺、苯基甲基乙醇胺和二甲基氨基乙基苯甲酸酯。可商品化购得的光敏剂包括购自比德尔索尔公司(Biddle SawyerCorp.)的 QUANTICURE ITX、QUANT I CURE QTX、QUANT I CURE PTX, QUANTICURE EPD。光敏剂或光引发剂体系的用量通常可在约0. 01-10重量％范围不等。
阳离子引发剂的例子包括鐺阳离子的盐，如芳基锍盐，以及有机金属盐如离子芳烃体系。 在先用溶剂稀释单体然后再沉积在基材表面上的各种实施方式中，先除去溶剂然后再进行聚合。可通过任何合适的机制或方法除去溶剂。通常可在聚合之前除去约90% 或更多、约95%或更多或约99%或更多的溶剂。如在本文同一日期提交的，Zhou等为发明人，名为“CELL CULTURE ART ICLEAND SCREENING(细胞培养制品和筛选)”的共同待批申请
序列号_所述，发现在固化之前除去基本上所有溶剂应能更好地控制固化动力
学和单体的转化量。当单体的转化率提高时，降低废物产生和细胞毒性。将单体聚合以形成合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面。无论在本体相(基本上不含溶剂)还是在溶剂相中聚合，通过合适的引发机制聚合单体。许多此类机制是本领域熟知的。例如，可升高温度以活化热引发剂，可通过接触合适波长的光来活化光引发剂，等等。按照许多实施方式，利用紫外光固化单体或单体混合物。优选在惰性气体保护下进行固化，例如氮气保护以防氧抑制。联用合适的紫外光与气体保护可提高聚合物转化率，确保涂层完整性并降低细胞毒性。可用溶剂洗涤固化的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层一次或多次以除去杂质，例如未反应的单体或低分子量聚合物。在各种实施方式中，用乙醇或乙醇-水溶液洗涤该层， 例如70 %乙醇、高于90 %乙醇、高于95 %乙醇或高于99 %乙醇。用70 %乙醇溶剂洗涤不仅用于除去可能具有细胞毒性的杂质，还可用于在培育细胞之前对表面灭菌。根据本文揭示的内容制备的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层形成单一的聚合基质层。 虽然此类层可包括结构和特性的局部变异，但这些变异可能是随机的，这与他人所述相互渗透网络相反。如上所述，在许多实施方式中，本文所述的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层是在接触细胞培养制品的基材之时自单体原位聚合。可通过任何合适的技术将多肽偶联于聚合的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。可通过氨基端基的氨基酸、羧基端基的氨基酸或内部氨基酸将多肽偶联于聚合的可溶胀(甲基) 丙烯酸酯层20。一种合适技术包括本领域通常知晓的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基] 碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学方法。EDC和NHS或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)可与可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层的羧基反应，从而产生胺反应活性NHS酯。EDC与可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层的羧基反应从而产生易水解的胺-反应活性邻-酰基异脲(Ο-acylisourea)中间体。胺-反应活性邻-酰基异脲中间体因加入NHS 或磺基-NHS将其转化为胺反应活性NHS或磺基-NHS酯而得到稳定，从而能进行两步过程。 可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层活化后，然后可加入多肽，多肽的氨基末端胺可与胺反应活性酯反应以形成稳定的酰胺键，因而将多肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。当采用 EDC/NHS化学方法将多肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层时，N-末端氨基酸优选含胺的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。当然，可利用任何可接受的亲核试剂，例如羟胺、胼、羟基等。EDC/NHS化学方法导致多肽70与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20零长度交联。可将含末端胺的连接基团或间隔基团，例如聚(乙二醇)连接基团(例如，量子生物设计公司) 加入肽70的N-末端氨基酸。当将连接基团加入N-末端氨基酸，该连接基团优选N-PG-酰氨基-PEGx-酸，其中PG是保护基团，例如Fmoc基团、BOC基团、CBZ基团或适合肽合成的任何其它基团，X是2、4、6、8、12、24或可用的任何其它不连续PEG。在各种实施方式中，将1微米-2500微米多肽液体组合物，例如溶液、悬液等与活化的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层接触以偶联该多肽。例如，多肽浓度可以是约100 μ M-约 2000 μ Μ、约500 μ M-约1500 μ Μ、或约1000 μ Μ。应该知道可改变多肽组合物的体积和浓度以实现偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的多肽的所需密度。多肽可以环化或包括环状部分。可采用形成环状多肽的任何合适方法。例如参考以下实施例4，通过环化合适氨基酸侧链上的游离氨基官能团与合适氨基酸侧链的游离羧基可产生酰胺键。仍参考以下实施例4，可在肽序列中侧链合适氨基酸的游离巯基之间产生二硫键。可采用任何合适的技术形成环状多肽(或其诸部分)。例如，可采用例如W01989005150所述方法形成环状多肽。可利用在多肽的羧基端基和氨基端基之间具有酰胺键的头-对尾环状多肽。二硫键的一种替代方式是利用两个硒代半胱氨酸的二硒键(diselenide bond)或混合的硒化物/硫化物键，例如Koide等，1993，Chem. Pharm. Bull. 41 (3) :502-6 ；Koide 等，1993，Chem. Pharm. Bull. 41 (9) :1596-1600 ；或 Besse 和 Moroder, 1997, Journal of Peptide Science，H 3 ·，442—4533.在含有偶联多肽的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上温育细胞如上所述具有偶联多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的细胞培养制品可用细胞接种。细胞可以是任何细胞类型。例如，细胞可以是结缔组织细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、骨骼或肌肉细胞、心肌细胞、肠细胞、肾细胞或其它器官的细胞、干细胞、胰岛细胞、血管细胞、淋巴细胞、癌细胞、原代细胞、细胞系等。所述细胞可以是哺乳动物细胞，优选人细胞， 但也可以是非哺乳动物细胞，例如细菌、酵母菌或植物细胞。在许多实施方式中，细胞是干细胞，本领域通常理解的干细胞指具有连续分裂能力(自我更新)并能分化成各种专门细胞的细胞。在一些实施方式中，干细胞是可自对象的器官或组织分离的多能、全能或多潜能干细胞。此类细胞能产生完全分化或成熟的细胞类型。干细胞可以是骨髓衍生的干细胞(自体或其它的)、神经元干细胞或胚胎干细胞。干细胞可以是干蛋白阳性的。干细胞可以是造血干细胞。干细胞可以是衍生自上皮和脂肪组织、脐带血、肝脏、脑或其它器官的多谱系细胞。在各种实施方式中，干细胞的多能干细胞， 例如分离自哺乳动物的多能胚胎干细胞。合适的哺乳动物可包括啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，灵长类动物，包括人和非人灵长类动物。在各种实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯-多肽层支持胚胎干细胞未分化培养5代或更多代、7代或更多代或10代或更多代。干细胞达到约75%汇合后，通常将它们传代至新平面。细胞达到75%汇合的时间取决于培养基、接种密度和本领域已知的其它因素。现已发现如以下实施例所述培养的干细胞达到约 75%汇合在约3天-约7天，通常是约5天。由于人胚胎干细胞(hESC)能以未分化状态连续培养生长，可从已建立的细胞系获得本发明所用的hESC。已建立的人胚胎干细胞系的例子包括但不限于H1、H7、H9、 H13 或 H14(得自威斯康星大学建立的 WiCell) (Thompson(1998)kience 282 1145)； hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03 (BG 公司(BresaGen，Inc.)，雅典，佐治亚州)；HES-1、 HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6 (EC 国际公司(ES Cell International, Inc.)，新加坡)；HSF-1、HSF-6(加利福尼亚大学旧金山分校)；I 3、I 3. 2、I 3.3、I 4、I 6、I 6.2、 J 3、J 3.2(以色列工学院 CTechnion-Israel Institute of Technology)衍生的，海法，以色列)；UCSF-I 和 UCSF-2 (Genbacev 等·，Fertil. Meril. 83(5) 1517-29，2005)；细胞系 HUES 1-17 (Cowan 等.，NEJM 350(13) 1353-56，2004)；和细胞系 ACT-14 (Klimanskaya 等.，Lancet, 365 (9471) 1636-41，2005)。还可从原代胚胎组织直接获得本发明所用的胚胎干细胞。通常使用其它情况下要弃去的胚泡阶段的体外冷冻受精卵来进行。其它合适的多能干细胞包括诱发的灵长类多能干(iPS)细胞。iPS细胞指得自青少年或成年哺乳动物如人的细胞，其是遗传修饰的，例如通过用一种或多种合适的载体转染，从而它们经重新编程获得多能干细胞如hES细胞的表型。由这些重新编程细胞获得的表型特点包括分离自胚泡的形态类似干细胞，以及表面抗原表达、基因表达和端粒酶活性类似的胚泡衍生的胚胎干细胞。iPS细胞通常具有从各原生胚层外胚层、内胚层和中胚层分化成至少一种细胞类型的能力，因此适于分化成各种细胞类型。iPS细胞如hESC在注入免疫缺陷小鼠如SCID小鼠中时也形成畸胎瘤(Takahashi等，(2007)Cell 131(5) :861 ；Yu 等，(2007) Science 318:5858)。接种细胞之前，可收集细胞并悬浮在合适的介质，例如生长培养基中，细胞一旦接种在表面上即在其中培养。例如，可将细胞在含血清培养基、条件化培养基或化学成分确定的培养基中悬浮并培养。本文所用的“化学成分确定的培养基”表示不含组成未知的组分的细胞培养基。在各实施方式中，化学成分确定的细胞培养基可不含组成未知的蛋白质、 水解物或肽。在一些实施方式中，条件化培养基含有组成已知的多肽或蛋白质，例如重组生长激素。由于化学成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构，培养条件和由此的细胞反应的可变性降低，从而增加了再现性。另外，减少了污染的可能性。此外，至少部分因为上述原因而更易于放大。化学成分确定的细胞培养基可购自英杰公司anvitrogen Corporation，1600 法拉第大街，PO Box 6482，卡尔斯巴德，加州 92008) &MemPro，其一种完全确定的，不含血清的培养基(SFM)，特别为胚胎干细胞的生长和扩增而配制；隆萨公司 (Lonza)的XVivo-10和干细胞技术公司(StemCell Technologies, Inc.)的用于人胚胎干细胞的mTeSRTMl维持培养基。可将一种或多种生长或其它因子加入培育细胞与偶联于多肽的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层(SAP)的培养基中。这些因子可有助于细胞增殖、粘着、自我更新、分化等等。可加入或包含在培养基中的因子的例子包括肌肉形态发生因子(MMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、 表皮生长因子(EGF)、重组人活化素(aCtiVin)A(ACT)，例如重组人活化素A，造血生长因子、视黄酸(RA)、干扰素、成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、肽生长因子、肝素聚合生长因子(HBGF)、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素-样生长因子(IGF) I和II、转化生长因子，例如转化生长因子-β I(TGFiil) 和集落刺激因子。可采用任何合适的浓度接种细胞。通常，以约10，000-500，000个细胞/平方厘米基材接种细胞。例如，可以约50，000-150，000个细胞/平方厘米基材接种细胞。然而，不难采用更高和更低的浓度。培育时间和条件，如温度、CO2和A水平、生长培养基等将取决于所培养细胞的性质并且不难改进。可根据所需的细胞反应来改变细胞在表面上培育的时间量。可为任何合适的目的使用培养的细胞，包括(i)在化学成分确定的培养基中获得在合成表面上培养的足够量的未分化干细胞用于研究或开发治疗应用； (ii)研究培养的细胞；(iii)开发治疗应用；(iv)治疗目的；(ν)研究基因表达，例如通过产生cDNA文库； 和(vi)研究药物和毒性筛选。如以下实施例中详述的，现已发现干细胞，例如胚胎干细胞的未分化阶段可在具有SA-P基材的制品上维持5、7或10代或更多代。在各种实施方式中，每次传代后，50%或更多、60%或更多、70%或更多或80%或更多的细胞维持未分化。测定细胞是否分化的一种合适方法是测定0CT4标记是否存在，例如以下实施例中详述的。在各种实施方式中，在 SA-P表面培养5、7或10代或更多代的未分化干细胞保留分化能力。下文提供了描述上述制品和方法的各种实施方式的非限制性例子。实施例实施例1 涂布制品由紫外可聚合的单体制备可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层表面，该涂层表面包含亲水性单体、含羧基单体和交联单体。表1显示所用的可溶胀(甲基)丙烯酸酯单体的组合。 如表1所示，制剂SAlA和SAl具有相同的单体组成。它们彼此不同之处在于用乙醇将SAlA 稀释成0. 1 %浓度v/v，而用乙醇将SAl稀释成0. 25% ν/ν浓度或更高一些。用乙醇稀释的单体的稀释度示于表3。表2显示了所用单体的化学结构。表1.所用的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂
权利要求
1.一种培养分离的未分化干细胞群体的方法，包括提供细胞培养制品，该制品具有基材、设置在该基材上的合成聚合物层和偶联于该合成聚合物层的肽，其中该肽包含RGD的氨基酸序列；在偶联于该细胞培养制品的合成聚合物层的多肽上用化学成分确定的细胞培养基培养未分化的干细胞；维持培养该细胞至少5代。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成聚合物层是设置在基材表面上的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层，其中所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层由包含含羧基的(甲基) 丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与该含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体及交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成。
3.如权利要求2所述的细胞培养制品，其特征在于，所述含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体是丙烯酸2-羧基乙酯。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述交联(甲基)丙烯酸酯单体是二甲基丙烯酸四(甘醇)酯或二丙烯酸四(甘醇)酯。
5.如权利要求2所述的细胞培养制品，其特征在于，所述亲水性单体选自下组甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、二(乙二醇) 乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵。
6.如权利要求2所述的细胞培养制品，其特征在于，所述交联(甲基)丙烯酸酯单体与所述含羧基甲基(丙烯酸酯)单体与所述亲水性单体的体积比是约3 20 80。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞传代10次或更多次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学成分确定的培养基包含碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子- β 1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞是未分化的人干细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述干细胞是人胚胎干细胞。
11.一种细胞培养制品，其包括具有表面的基材；设置在该基材表面上的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层，其中所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层可由包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体及交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成； 禾口偶联于该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的含羧基单体的羧基的肽。
12.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层在水中的平衡水含量为约5% -约50%。
13.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层在水中的平衡水含量为约10% -约40%。
14.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体是丙烯酸2-羧基乙酯。
15.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述交联(甲基)丙烯酸酯单体是二甲基丙烯酸四(甘醇)酯或二丙烯酸四(甘醇)酯。
16.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述亲水性单体选自下组甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、二(乙二醇) 乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵。
17.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述交联(甲基)丙烯酸酯单体与所述含羧基甲基(丙烯酸酯)单体与所述亲水性单体的体积比是约1-10 约10-40 约 60-90。
18.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述交联(甲基)丙烯酸酯单体与所述含羧基甲基(丙烯酸酯)单体与所述亲水性单体的体积比是约3 20 80。
19.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层不含多肽交联剂。
20.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述肽包含 Yaa1XaanArgGlyAspXaamYaa1 (SEQ ID NO 1)所示氨基酸序列，其中η是0-4的整数， m是0-5的整数， 1是0或1，各Xaa独立地为任何天然或仿生氨基酸，和 Yaa独立地为任何天然或仿生氨基酸，前提是该肽包含至少一个具有能与所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的游离羧基进行亲核加成的官能团的氨基酸，其中所述含羧基(甲基)丙烯酸酯单体产生所述游离羧基。
21.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，Yaa包含赖氨酸。
22.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述肽包含 Yaa1XaamZaaXaanArgGlyAspXaamBaa XaamYaa1 (SEQ ID NO 3)所示氨基酸序列，其中η是0-4的整数， m是0-5的整数， 1是0或1，各Xaa独立地为任何天然或仿生氨基酸，和Zaa和Baa各自独立地为任何天然或仿生氨基酸，在它们各自侧链的原子之间形成共价键，从而形成多肽的环状部分，和Yaa独立地为任何天然或仿生氨基酸；前提是该多肽包含至少一个具有能与所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的游离羧基进行亲核加成的官能团的天然或仿生氨基酸，其中所述含羧基(甲基)丙烯酸酯单体产生所述游离羧基。
23.如权利要求22所述的细胞培养制品，其特征在于，Yaa包含赖氨酸。
24.如权利要求11所述的细胞培养制品，其特征在于，所述肽包含选自下组的氨基酸序列LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO 4)；AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO 5)；LysGlyGlyLys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17 (SEQ IDNO :6)，其中 Lys4和Asp17 —起形成酰胺键使多肽的一部分环化；LysGlyGlyLys4GluProArgGlyAspThrTryArgAsp13(SEQ ID NO :7)，其中 Lys4 和 Asp13 — 起形成酰胺键使多肽的一部分环化；LysGlyGlycys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys17 (SEQID NO 8),其中 Cys4和Cys17 —起形成二硫键使多肽的一部分环化；LysGlyGlyCys4GluProArgGlyAspThrTryArgCys13(SEQ ID N0:9)，其中 Cys4 和 Cys13 — 起形成二硫键使多肽的一部分环化；GlyArgGlyAspSerPro Lys(SEQ ID NO 11)；禾口LysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSerSer(SEQ ID NO: 12)。
25.如权利要求11所述的制品，其特征在于，所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层具有均勻的厚度，并且所述可溶胀(甲基丙烯酸酯)层厚度低于约2微米。
全文摘要
能支持在化学成分确定的培养基中培养包括干细胞和未分化人胚胎干细胞在内的真核细胞的合成表面包含可溶胀(甲基)丙烯酸酯层和偶联于该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的多肽。可通过聚合包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(二-或更高-官能)(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体和交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物中的单体形成该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层在水中的平衡水含量为约5％-约70％。偶联的肽可包括RGD氨基酸序列。
文档编号C12N5/071GK102159704SQ200980112465
公开日2011年8月17日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者A·法捷耶夫, D·M·韦伯, J·格曼, R·勃兰登伯格尔, Z·梅尔寇米扬, 周悦 申请人:杰龙公司