病毒定量方法

专利名称：病毒定量方法
技术领域：
本发明涉及对从体液采集的人疱疹病毒(HHV)数进行定量的方法、以及用于进行 该方法的试剂盒。
背景技术：
“疲劳”的蓄积会引起过劳死、自杀、生活习惯病等许多严重问题。但是，针对”疲 劳”的科学或医学研究与其它领域相比明显迟滞，对于“疲劳”带给个人健康、社会生活的问 题尚未找到解决的突破口。作为针对“疲劳”的研究或预防方法/治疗方法的开发迟滞的主要原因，可以列举 出没有客观地测定“疲劳”的方法。特别是，关于对生活、健康影响最大的“疲劳的蓄积”、 “中长期持续疲劳”，其测定方法尚未确立，而对于这样的测定方法的需求非常迫切。本申请的发明人之一曾经开发出通过测定唾液中再活化的人疱疹病毒的量来测 定疲劳的蓄积的方法(W02006/006634)。根据目前为止的研究可以判定通过利用该方法， 能够定量地测定因1周以上时间的各种紧张状态而蓄积的疲劳。而且，在该方法中，优选 使用唾液作为试样，而关于唾液，已知唾液腺中的内源生物素含量高(Green，Μ.，et al.， J. Clin. Pathol. , (1992)45(9) :788_790)。传统上，作为对病毒进行定量的方法，已知有通过PCR对病毒DNA量进行定 量的方法(Kido, S.，et al.，J. Med. Virol.，(1990)32 139-142)、通过双嵌套 PCR 法 (Double-Nested PCR)进行测定的方法(Kondo, K.，et al.，J. Infect. Dis.，(1993) 167 1197-1200)等。此外，在逆转录病毒的定量方面，还公开了在通过定量PCR测定病毒DNA量 时，使用包含含标记序列的病毒核酸的逆转录病毒作为内部标准的方法(W095/034684)。此外，作为测定病毒蛋白质的量的方法，有例如使用抗病毒蛋白质的抗体的免疫 测定方法(immunoassay法)。作为代表性的免疫测定方法，可以列举出例如夹心ELISA法 等(Gerna, G.，et al.，J. Clin. Microbiol.，(1983) 17 :942_944)。另一方面，作为提高溶液中病毒的浓度、浓缩病毒的方法，可以列举出例如超离心 法，但是，该方法需要昂贵的仪器和漫长的分离时间，且作业中需要大量的劳力。此外，还有 用硫酸铵、聚乙二醇等沉淀病毒来进行浓缩的方法，但由于这些方法中使用的试剂会阻碍 其后的用于病毒检测的PCR，因而存在的问题是病毒沉淀后必须进行试样的纯化。作为其 它的病毒浓缩方法，公开了例如使用结合有甘露糖结合型凝集素的磁性粒子的方法(特开 2002-165591)。此外，作为提高逆转录病毒的效价或者从待检物样品中分离逆转录病毒的 方法，还公开了利用链霉抗生物素蛋白和生物素化凝集素的方法(W02001/079456)。现有技术文献专利文献1国际公开第W02006/006634号小册子专利文献2国际公开第W095/034684号小册子专利文献3特开2002-165591号公报专利文献4国际公开第W02001/079456号小册子
非专利文献lGreen，M.，et al. , J. Clin. Pathol.，(1992)45(9) :788_790非专利文献2Kido，S.，et al. , J. Med. Virol. , (1990)32:139-142非专利文献3Kondo, K.，et al.，J. Infect. Dis.，(1993) 167 1197-1200非专利文献4Gerna, G.，et al.，J. Clin. Microbiol.，(1983) 17 942~94
发明内容
发明所要解决的问题发明人等判明在定量评价针对日常生活中的疲劳的疲劳度时，如果采用传统方 法来测定体液中的人疱疹病毒(以下记作HHV)的量，则视情况而异，试样中的HHV数会非 常少，例如人疱疹病毒6(HHV-6)会小于100拷贝/ml、人疱疹病毒7(HHV-7)也会小于100 拷贝/ml，在相当多的情况下，测定途中会损失病毒DNA，因而准确且有效率的定量需要技 术熟练。而且，在这种情况下，将HHV定量方法试剂盒化从而简便地对大量试样进行定量是 困难的。本发明的目的是解决传统病毒定量方法中的上述问题。解决问题的方法本发明人等进行了深入研究，结果发现通过将结合有可与HHV结合的物质的载 体混合在体液中并使之与对象病毒结合，并且利用磁铁、离心处理等回收该载体，可以将其 制备成能够采用PCR、LAMP、ELISA等方法容易地进行定量的浓度。而且，本发明人等通过在定量过程中，在试样中加入一定量的作为基准的病毒并 进行一系列步骤，能够成功地进行准确的定量。在该方法中，通过利用突变型HHV作为基准 病毒，能够简单容易地进行更准确的定量。基于以上认识，本发明提供能够更简便且准确地对体液中的HHV进行计量的新定 量方法，以及用于进行本发明的方法的试剂盒。即，本发明如下。实施方式1 一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与病毒结合物质接触，其中，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过 该分子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒通结合 于载体；(3)将该载体从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。实施方式2 一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与凝集素接触，其中，(i)该凝集素上连接有能够与载体结合的分子，并且该凝集素通过该分子结合于载体，从而与凝集素结合的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该凝集素直接结合于载体，从而使与凝集素结合的病毒结合于载体；(3)将该载体从⑴的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。实施方式3:一种对从唾液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)在(1)的液体中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，再添加 结合有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子；(3)将该珠子从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的珠子处回收的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从唾液中采集的人疱疹病毒数。实施方式4 根据实施方式1 3中任一项所述的方法，其中，所述人疱疹病毒是人疱疹病毒 6 (HHV-6)或人疱疹病毒7 (HHV-7)。实施方式5 根据实施方式1 3中任一项所述的方法，其中，所述基准病毒是HHV-6或HHV-7 来源的重组病毒。实施方式6 根据实施方式2或3所述的方法，其中，所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6键的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少一种的糖链结 合的凝集素。实施方式7 根据实施方式6所述的方法，其中，所述凝集素选自SBA (大豆来源)、SSA (无梗接 骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)。实施方式8 根据实施方式1 3中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)包括采用选自PCR、 LAMP和ELISA中的方法对病毒数进行定量。实施方式9 一种对从唾液采集的人疱疹病毒6 (HHV-6)或人疱疹病毒7 (HHV-7)的数量进行定 量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中添加预先确定了浓度的基准病毒，并使得基准病毒浓度是 10 100，000基因组拷贝/ml，其中，该基准病毒是HHV-6或HHV-7来源的重组病毒；(2)在(1)的液体中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，并且再 添加结合有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子，其中， 该凝集素选自SBA(大豆来源)、SSA(无梗接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)；(3)将该珠子从(1)的液体中分离；(4)采用选自PCR、LAMP和ELISA中的方法对从分离出的珠子处回收的病毒数进 行定量；以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从唾液中采集的人疱疹病毒数。实施方式10 一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与直接结合在直径IOnm IOOnm的纳米珠上的病毒结合物质相 接触，从而使病毒结合于纳米珠；(3)将该纳米珠从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。实施方式11:—种用于对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的试剂盒，该试剂盒包括生物素化凝集素；结合有生物素结合蛋白质的珠子。实施方式12 一种用于对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的试剂盒，该试剂盒包括；生物素化凝集素；结合有生物素结合蛋白质的珠子；预先确定了浓度的基准病毒。实施方式13:根据实施方式11或12所述的试剂盒，其中，所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖 胺(GalNAc)、α 2-6键的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙酰葡糖胺(GlcNAc)中至少一种的糖链结 合的凝集素。实施方式14 根据实施方式13所述的试剂盒，其中，所述凝集素选自SBA (大豆来源)、SSA (无 梗接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)；且所述基准病毒是HHV-6 或HHV7-来源的重组病毒。实施方式15 一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)使采集的体液与病毒结合物质接触，其中，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过 该分子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒结合于 载体；
(2)将该载体从(1)的液体中分离；(3)对从分离出的载体处回收得到的病毒量进行定量。实施方式16 一种对从唾液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，再添加 结合有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子；(2)将该珠子从(1)的液体中分离；(3)对从分离出的珠子处回收的病毒数进行定量。发明的效果根据本发明，对于体液中的浓度非常低、直接定量困难、需要熟练度的HHV的定 量，能够简单容易地进行更准确的定量。


图1为荧光显微镜照片，显示了针对HHV-6对tamavidin珠的非特异性吸附进行 试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞(indicator cell)的 MT-4细胞，1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的 差异引起的)。左侧照片表示使HHV-6病毒液(原液)作用于MT-4细胞的情况。右侧照片 表示在不存在凝集素的条件下使HHV-6病毒液(原液)与tamavidin珠接触、并使吸附于 tamavidin珠的病毒作用于MT_4细胞的情况。图2为荧光显微镜照片，显示了针对ABA、DSA、Lotus、MAM和PHA-E4各凝集素的 HHV-6浓缩效果进行试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞的 MT-4细胞，1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的 差异引起的)。图3为荧光显微镜照片，显示了针对PHA-L4、UEA-I、SBA、和SSA各凝集素的HHV-6 浓缩效果进行试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞的MT-4 细胞，1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的差异引 起的)。发明的
具体实施例方式以下，对本发明进行更具体的说明。1.体液中的HHV的定量方法本发明提供一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下 步骤(1)使采集的体液与病毒结合物质接触，其中，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过 该分子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒与载体 结合；(2)将该载体从(1)的液体中分离；(3)对从分离出的载体处回收得到的病毒量进行定量。
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此外，本发明提供一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包 括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使⑴的液体与病毒结合物质接触，其中，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过 该分子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒与载体 结合；(3)将该载体从⑴的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收 率，由(4)中定量的体液中的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒 数。以下，对本发明的方法的各要素进行具体说明。MS在本发明的方法中，作为定量的对象的病毒是能够对人的疲劳进行定量的病毒， 具体可以是感染人的属于疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒，即人疱疹病毒(以下也记 作HHV)。优选可以是选自人疱疹病毒6 (人疱疹病毒6的变体A和B 以下也合称HHV-6)、 人疱疹病毒7(以下也记作HHV-7)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(别名人疱疹病毒5)以 及爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)(以下也记作EBV)中的1种以上的病毒。更 优选为HHV-6和HHV-7，更优选为HHV-6。人疱疹病毒是感染人双链DNA的病毒。HHV-6是直径200nm左右的病毒。作为本发明的方法的分析对象的体液可以是血液、唾液、血清、精液、母乳、咽喉擦 出液(pharyngeal swab)、脑脊髓液、腹水、汗、泪、尿等采集自人体的体液，其中唾液是优选 的。在本说明书中，作为本发明的方法的分析对象的体液有时也简称为“试样”。作为唾液的采集方法，可以列举出用棉棒拭取出咽部的粘液的方法、将唾液直接 吐至采集管中的方法、使用唾液采集器具例如唾液收集管(Salivette) (Sarstedt公司)等 的方法等，优选使用唾液收集管的方法。这种情况下，可以通过将棉含于口中，使唾液浸入 棉中来采集唾液，然后通过将含浸有唾液的棉转移至离心管，并进行离心，可以回收唾液。此外，作为采集唾液前的口腔处理，可以列举出例如长时间不进食而安静化的方 法、在将要采集唾液前用水漱口的方法，优选在将要采集唾液前用水漱口的方法。此外，对于唾液以外的体液，可以采用本领域技术人员公知的方法进行采集。而且，对于采集的体液，在不影响病毒粒子、病毒DNA的定量的前提下，也可以视 需要在测定前进行稀释、过滤、离心等适当处理。或者，在不立即进行病毒定量的情况下，视 需要，可以采用本领域技术人员公知的方法冷藏保存或冷冻保存，直至进行测定。病毒结合物质在本发明中，病毒结合物质是指可与HHV结合的物质。可与HHV结合的物质包括 凝集素、抗HHV的抗体等。
在本说明书中，“凝集素”是指识别糖链并与之结合的糖结合性蛋白质。就与凝集 素结合的糖链而言，各种凝集素具有特异性。在本发明的方法中所用的凝集素只要是能够结合HHV即可，没有特殊限制，优选 与作为定量对象的病毒的亲和性高、该病毒的回收率高的凝集素。更优选与包含N-乙酰 半乳糖胺(GalNAc)、α2_6键的唾液酸(Sia α 2-6)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少 一种的糖链结合的凝集素，更优选选自SBA(大豆来源凝集素。结合糖链含N-乙酰半乳 糖胺(GalNAc)的糖链)、SSA(无梗接骨木来源凝集素。结合糖链含α 2_6键的唾液酸 (Sia α 2-6)的糖链)、DSA (白曼陀罗来源凝集素。结合糖链含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc) 的糖链)，和WGA (小麦胚芽来源凝集素。结合糖链含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸 的糖链)中的凝集素。特别是，当作为定量对象的病毒是HHV-6时，更优选SBA和WGA。对于本发明中所使用的抗HHV的抗体没有特殊限制，只要可与HHV结合即可，可以 是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。在本发明的一类实施方式中，病毒结合物质可以与载体直接结合并使用。在其它实施方式中，病毒结合物质可以间接与载体结合并使用。作为间接结合的 例子，可以是生物素-生物素结合性蛋白质的结合介导的病毒结合物质与载体的结合。更 具体地，通过将病毒结合物质生物素化，并在载体表面结合生物素结合性蛋白质，使生物素 与生物素结合性蛋白质结合，从而可以实现病毒结合物质与载体的间接结合。鍵在本发明中，载体只要是作为固体或不溶性材料(例如，能够通过过滤、沉淀、磁 性分离等从反应混合物分离的材料)的载体即可，没有特殊限制。构成固体载体的材料包括纤维素、特氟隆(teflon)(注册商标)、硝酸纤维素 (nitrocellulose)、琼脂糖、高交联球形琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚 酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯(polydivinylidene difluoride)、胶 乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片(silicon wafer)、 聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳以及它们的组合，但不 限于此。固体载体的形状包括但不限于珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微板、碳纳米 管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹 坑、沟槽、滤膜底部等。在本发明的一类实施方式中，磁珠可以具有约IOnm 约Imm范围的球体直径。在 优选的实施方式中，磁珠具有约25nm 约1mm、约50nm 约IOOym范围的直径。磁珠的尺 寸可以根据特定的用途来进行选择。在本发明的一类实施方式中，由S^harose等高交联球形琼脂糖制成的珠子可以 具有约24μπι 约165μπι范围的直径。在优选的实施方式中，高交联球形琼脂糖珠具有约 24 μ m 约44 μ m范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选 择。具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences公司或Spherotech公 司购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。二氧化硅(SiO2)处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences公司购买的超常磁性二氧化硅珠等。或者，还可以使用可从Dynal Biotech 公司购买的M-280等。 作为具有亲水性表面的磁珠的例子，可以列举出Polysciences公司销售的名称 为Biomag (注册商标)羧基的珠子、或者Bangs Laboratory公司的珠子(MC02N/2928)等。 或者，可以使用Dynal Biotech公司销售的M-270等。在本发明的一类实施方式中，病毒结合物质与载体可以直接结合来使用。这种情 况下，从提高病毒与结合有凝集素的载体的结合可能性的观点出发，载体可以是能够做布 朗运动程度大小的纳米珠。纳米珠的优选球体直径的范围是IOnm IOOnm的球体直径、更 优选30nm 70nm的球体直径。此外，这种情况下，优选包含能够用磁铁简便回收的磁体， 例如可以列举出但不限于Miltenyi Biotech公司的MACS MicroBeads (直径50nm)等磁性 纳米珠。病毒结合物质多为蛋白质，因而，该病毒结合蛋白质与载体的连接可以采用本领 域技术人员公知的蛋白质与载体的偶联方法来进行。例如，对载体表面进行修饰，使得羧基 露出来，然后使该羧基与蛋白质的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化 二亚胺(EDC)的存在下进行偶联反应，从而将蛋白质与载体连接起来。或者，例如，通过在 不含伯氨基的PH6. 5 9的缓冲液中混合载体表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活 性酯化后的载体与蛋白质，可以将载体表面的羧基与蛋白质的氨基连接起来。或者，可以使用交联试剂BS3(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)或DSS(双 琥珀酰亚胺基辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate))，将载体表面的氨基与蛋白质的氨 基连接起来，或者使用交联试剂SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2_吡啶基二硫]丙酸酯)或 GMBS (N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酰亚胺)将载体表面的氨基与蛋白质的硫醇基(千 才一>基)连接起来。病毒结合物质与载体的间接结合在本发明的其它实施方式中，病毒结合物质可以间接与载体结合来使用。例如，通过将病毒结合物质生物素化，并在载体表面结合生物素结合性蛋白质，使 生物素与生物素结合性蛋白质结合，可以实现病毒结合物质与载体的间接结合。这种情况下，作为载体，可以优选使用珠子，珠子的优选球体直径的范围是 0. 1 μ m 100 μ m的球体直径，更优选0. 5 μ m 10 μ m的球体直径，更优选1 μ m 5 μ m的 球体直径。在本说明书中，“生物素”是指D-[(+)-cis-六氢-2-氧代-IH-噻吩并_(3，4)_咪 唑-4-戊酸]的通用名。生物素是属于B族维生素的一种水溶性维生素，也称作维生素B7、 维生素H或辅酶R。生物素是卵清中包含的一种糖蛋白质，其非常强烈地结合抗生物素蛋 白。在本说明书中，“生物素”除了上述的生物素以外，还包括亚氨基生物素 (iminobiotin) (Hofmann, et al.，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4666_4668)、脱硫 生物素(desthiobiotin) (Hirsch,et al.，(2002) Anal. Biochem.，308 :343_357)、生物胞素 (biocytin)或生物素亚砜(biotin sulfoxide)等生物素类似物。在对凝集素等病毒结合物质进行生物素化时，可以列举出使用生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如=PIERCE公司制造的EZ-Link (注 册商标)SUlf0-NHS-Bi0tin(13.5A、伯胺)(括号内依次为接头长度、反应基团)、 EZ-Link (注册商标)Sulfo-NHS-LC-Biotin (22. 4 A、伯胺)、EZ-Link (注册商标) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin(30. 5 A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-Biotin(9. 6 A、胺)、 EZ-Link(注册商标)Maleimide-PEO2-Biotin(29. 1 A、硫醇基)、EZ-Link(注册商标) Biotin-PEO2 Amine (20. 4 A、羧基)、EZ_Link (注册商标)Biotin-PEO3-LC Amine (22. 9 A、 羧基)、EZ-Link (注册商标)Biotin-Hydrazide (15. 7 A 、醛基)、EZ-Link (注册商标) Biotin-LC-Hydrazide (24. 7 A 、醛基)、EZ_Link (注册商标)NHS-Iminobiotin (13. 5 A、 伯胺)等，但不限于此。使用这样的生物素化试剂，可以通过公知方法使生物素结合于凝集素等病毒结合 物质。例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，通过用DMSO ( 二甲基亚砜)这样 的有机溶剂或PH7-9的磷酸缓冲液进行溶解、并添加凝集素等病毒结合物质，可以结合生 物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，通过使用EDC (1-乙基-3- (3- 二 甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)这样的碳化二亚胺，在将凝集素等病毒结合物质的羧 基转换为活化酯后，添加用PH5附近的缓冲液溶解的生物素化试剂，可以结合生物素。此外，结合有生物素的凝集素等病毒结合物质例如可以从J-Oil Mills公司 以生物素标记凝集素的形式购入。此外，还可以通过使用生物素标记试剂盒(例如但 不限于 Pierce 公司制造的 EZ-Link (注册商标)NHS-Lc-Biotin, Dojindo Molecular Technologies公司制造的Biotin Labeling Kit_NH2等)使生物素结合于期望的病毒结合 物质来制作。此外，通过将凝集素等病毒结合物质的基因与编码含生物素化序列的肽的DNA相 融合，构建表达该融合基因的载体，并在任意宿主中以与生物素化序列的融合蛋白质的形 式进行表达(Schwarz et al.，(1988). J. Biol. Chem. 263 :9640_9645)，也可以制作例如生 物素化凝集素。这样的载体可以列举出但不限于例如Irwitrogen公司的含BioEase (商 标)标签的载体。这其中，哺乳类细胞表达用的有PcDNA (商标)6载体，大肠杆菌表达用的 有PET104载体，或者果蝇(Drosophila)表达用的有pMT/BioEase载体。在本发明中，作为生物素结合性蛋白质，只要是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋 白、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、AVR 蛋白质(Biochem. J.，(2002)，363 :609_617)、 BradavidinQ. Biol. Chem.，(2005)，280 13250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.，(2007)， 405 :397-405)、tamavidin或它们的突变体等，与生物素和生物素/抗生物素蛋白结 合的蛋白质，均可以适宜使用。特别是，可以优选使用tamavidin及其突变体。而且， tamavidin是在食用蘑菇白黄侧耳(pleurotus conucopiae)中发现的生物素结合性蛋白 质(W002/072817 ；Takakura et al.，(2009) FEBS J.，276 1383-1397)。作为 tamavidin 的 突变体，可以列举出例如高结合能力低非特异性结合tamavidin(日本特愿2008-208766， 未公开)等。本发明中的“tamavidin”是指tamavidin 1(氨基酸序列SEQ ID N0:11、编码其 的核酸序列SEQ ID NO 10)、tamavidin 2(氨基酸序列SEQ ID NO 13、编码其的核酸序 列SEQ ID NO 12)或它们的突变体。具体地，本发明的tamavidin典型地可以是包含SEQ
13ID N0:11或SEQ ID NO 13的氨基酸序列的蛋白质，或者可以是由包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO :12的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，本发明的tamavidin可以是包含SEQID N0:11或SEQ ID NO :13的氨基酸序列的蛋白质，或由包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 12 的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、且具有与tamavidin 1或2相同的生物素结合 活性的蛋白质，或具有高结合能力低非特异性结合的活性的蛋白质。在本说明书中，有些情 况下也简单地将tamavidin 1、tamavidin 2以及它们的突变体统称为tamavidin。tamavidin 1或2的突变体可以是包含在SEQ ID NO 11或13的氨基酸序列中包 含1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列而形成的蛋白质、并且具 有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性的蛋白质。取代可以是保守取代，即将特定 的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪 族基团的氨基酸残基之间的取代(例如lie、Val, Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之 间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而产生的突变体可以通过对编码野生型蛋白 质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见NucleicAcid Research, Vol. 10， No. 20,p. 6487-6500，1982，通过引用将其全文弓丨入到本说明书中)来制作。在本说明书中， “一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基 酸。此外，在本说明书中，“一个或多个氨基酸”根据情况也可以指1个或数个氨基酸。tamavidin 1或2的突变体还可以是包含与SEQ ID NO :11或13的氨基酸序列 具有至少60%以上、优选65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更优选99. 3%以上的氨基酸同一性 的氨基酸序列的蛋白质，并且该蛋白具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性或者 具有高结合能力/低非特异性结合的活性。两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者，两个蛋白质序 列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol. ,48 443-453,1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP 计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括=(I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10915-10919,1992)所记载的得分 / 矩 阵、bloSUm62; (2) 12分的空位罚分；(3) 4分的空位长度罚分；以及(4)末端空位不罚分。也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比， 例如=Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中记载的可用 BLAST 程序 对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在National Center for Biotechnology Information(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用 BLAST 程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但 检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件 GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使 用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组 (GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10. 0版“GAP”程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。在本发明中，优选的tamavidin包含以下的tamavidin修饰体(日本特愿 2008-208766，未公开)。在包含SEQ ID NO :13所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1 数个氨基酸突 变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活 性的蛋白质中，选自下组中的1或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而 得到的修饰型生物素结合蛋白质DSEQ ID NO 13的104位的精氨酸残基；2) SEQ ID NO 13的141位的赖氨酸残基；3) SEQ ID NO 13的26位的赖氨酸残基；以及4) SEQ ID NO 13的73位的赖氨酸残基。更优选选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质在SEQ ID NO 13中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨 酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E)；在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精 氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E)；在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖 氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精 氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰 型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。生物素结合性蛋白质与载体的连接可以采用本领域技术人员公知的蛋白质与载 体的偶联方法来进行。例如，对载体表面进行修饰，使得羧基露出来，然后使该羧基与蛋白 质的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下进行偶 联反应，从而可以将蛋白质与载体连接起来。或者，例如，通过在不含伯氨基的PH6. 5 9 的缓冲液中混合载体表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的载体与蛋白质， 可以将载体表面的羧基与蛋白质的氨基连接起来。或者，可以使用交联试剂BS3(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)或DSS(双琥 珀酰亚胺基辛二酸酯)将载体表面的氨基与蛋白质的氨基连接起来，或者使用交联试剂 SPDP (N-琥珀酰亚胺基3- [2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS (N- (4-马来酰亚胺丁酰基氧) 琥珀酰亚胺)将载体表面的氨基与蛋白质的硫醇基连接起来。在利用诸如上述的结合将生物素结合性蛋白质固定于载体时，表面配置有各种 官能团的各种载体是商品化的，因此可以优选使用这些载体。可以列举出但不限于例如 在表面配置有官能团的微板方面，作为马来酸酐板有例如Reacti-Bind(商标)Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-WellPlates (PIERCE 公司)，作为活性型氨基板有 例如Immobilizer -AminoModules/Plates (Nunc公司)，作为羧基板有例如ELISA用平板 MS-8796F(96孔、C型、平底、羧基)(Sumitomo Bakelite公司)。此外，在表面配置有官能团 的微珠方面，作为高交联琼脂糖珠有例如S印harose (商标)(GE HealthcareBio-Science 公司)，作为磁珠有例如Dynabeads (商标)(Dynal公司)等，但不限于此。生物素结合性蛋
15白质与固体载体的连接可以按照载体附带的说明书来进行。此外，作为固定有生物素结合性蛋白质的载体，还可以列举出例如Reacti-Bind Streptavidin Coated Plates (PIERCE 公司)、Nunc StreptavidinCoated 96Micro Well Plates (Nalge Nunc 公司)等微板类，或者 DynabeadsM-280 Streptavidin (Dynal 公司)、 MagnaBind Streptavidin Beads (PIERCE公司)等磁珠类等市售品，但不限于此。在不使用生物素与生物素结合性蛋白质的情况下，例如，可以在病毒结合物质上 结合组氨酸标签、FLAG 标签或谷胱甘肽硫转移酶(GST)，并在载体上分别结合Ni-NTA (氮 川三乙酸)、抗FLAG抗体或谷胱甘肽，通过它们之间的结合，也可以使病毒结合物质与载体 间接结合。基准病毒(基準々彳^ 7 )在本发明的方法中，作为定量的对象的病毒的回收率并非一定是100%，还会因试 样、条件而发生微妙的变化，因此回收率并不是严格一定的。如果目的是一次性地获得病毒 的概数，则这样倒也无妨。但是，为了进行能够评价中长期疲劳的病毒定量，必须要对在一 定期间内采集的体液中的病毒量进行计量，并持续地对该量进行比较，而如果回收率发生 变化，则存在的问题是对持续采集/定量的病毒量的比较变得困难。与此相对，发明人等进行了研究，结果通过将下述病毒(以下称为“基准病毒”)导 入系统成功地解决了该问题所述病毒与作为定量对象的病毒具有同等程度的回收率、且 即使在混有定量对象病毒的情况下，也能够分别判别并计量各自的病毒数。具体地，将经过 定量的基准病毒添加一定量到初始试样(例如唾液)中，进行本发明的方法后，基于初始试 样中加入的基准病毒的量与回收的基准病毒的量来评价回收率。然后，将该回收率乘以定 量对象病毒的测定值，来对病毒量的测定值进行修正，从而能够稳定且准确地对定量对象 病毒进行定量。此外，当在试样中加入基准病毒进行测定、评价回收率、对定量对象病毒的测定值 进行修正时，优选其在一个测定系统中进行，但也可以这样进行例如，将试样分成2份，仅 其中的一份加入基准病毒并评价回收率，而另1份进行定量对象病毒的测定，从两者的结 果来对定量对象病毒的测定值进行修正。而且，在本发明的方法中，当进行大量的待检物的病毒定量时，优选在所有待检物 中导入基准病毒来进行定量，但如果病毒回收率稳定，也并非必须要针对所有的待检物均 导入基准病毒，可以适当地省略基准病毒导入。即，通过在一部分待检物中导入基准病毒， 来确认系统的回收率是稳定的，而对于其它待检物可以不进行基准病毒的导入而进行病毒 定量，这样的实施方式也包含在本发明的方法中。基准病毒应与进行定量的病毒具有相同的特征，且必须能够容易地与进行定量的 病毒相区别。即，在本发明的定量方法中，其必须能够与作为定量对象的病毒一样与病毒结 合物质结合、一样能够用珠子回收，且必须能够采用PCR、LAMP、ELISA等容易地且与对象病 毒相区别地进行定量。发明人等发现作为满足该条件的基准病毒，在定量对象病毒是HHV-6时，突变型 HH-6是合适的；而当定量对象病毒是HHV-7时，突变型HHV-7是合适的。 作为突变型HHV-6，优选HHV-6来源的重组病毒，且该重组病毒的与HHV-6的U2 U8区域相当的部位、或者与U24和U25区域相当的部位中具有野生型HHV-6基因组中不存在的外源性核苷酸序列。此外，作为突变型HHV-7，优选HHV-7来源的重组病毒，且该重组病 毒的与HHV-7的U2 U8区域或U24 25区域相当的部位中具有野生型HHV-7基因组中 不存在的外源性核苷酸序列。在利用PCR、LAMP等高灵敏度地检测核苷酸本身的系统对病毒进行定量时，对于 外源性核苷酸序列没有特殊限制，只要是作为定量对象的野生型HHV的基因组或人基因组 中不存在的序列即可，可以不必是结构基因。这种情况下，对外源性核苷酸序列的长度没有 特殊限制，优选是100碱基以上且20，000碱基以下，更优选200碱基以上且10，000碱基以 下。此外，在这样的系统中，当插入结构基因作为外源性核苷酸序列时，优选编码下述蛋白 质的核苷酸序列对作为定量对象的HHV的回收率没有影响(例如，对HHV-6糖链-凝集素 结合没有影响)的蛋白质，例如荧光蛋白质(可以列举出例如绿色荧光蛋白(GFP)或增强 绿色荧光蛋白(EGFP)等，但不限于此)或者抗生素抗性蛋白质(可以列举出例如四环素、 氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素或壮观霉素等的抗性蛋白质，但不限于此)等。此外，当使用抗病毒的抗体对病毒进行定量时，在例如通过ELISA法等免疫测定 进行的定量中，突变型HHV必须表达野生型HHV中不存在的外源性蛋白质，这样的蛋白质由 外源性核苷酸序列编码，对于该核苷酸序列没有特殊限制，只要是作为定量对象的野生型 HHV基因组中不存在的序列即可，优选人基因组中不存在的序列。此外，作为外源性蛋白质， 优选对作为定量对象的HHV的回收率没有影响的、例如上述那样的荧光蛋白质或抗生素抗 性蛋白质等。或者，也可以优选使用测定容易的酶等。作为这样的突变型HHV-6的例子，优选可以利用重组了下述基因的重组病毒(参 照例如专利第3923505号)，所述基因编码用于与野生型HHV-6相区别地进行计量的蛋白 质。此外，作为这样的突变型HHV-7的例子，优选可以利用重组了下述基因的重组病毒(参 照例如特开2007-159586)，所述基因编码用于与野生型HHV-7相区别地进行计量的蛋白质。对于这样的基准病毒在试样中的添加量没有特殊限制，只要是能够进行基准病毒 的定量的量即可，例如，对于突变型HHV-6，可以以每ImllO拷贝 1，000, 000拷贝左右、优 选每ImllO拷贝 100，000拷贝左右、更优选每lml50拷贝 50，000拷贝左右、更优选每 ImllOO拷贝 10，000拷贝左右来进行定量。在使用基准病毒进行的定量中，基准病毒具有诸如上述的特性，因而，其不仅能够 在利用载体进行的对象病毒回收或浓缩中作为基准，还能够优选在其后的利用PCR、LAMP 进行的定量中作为内部标准，或者在利用ELISA法进行的定量中作为基准，直接使用。体液与病毒结合物质的接触本发明的方法包括使体液与病毒结合物质相接触的步骤。对于使体液与病毒结合 物质相接触的条件没有特殊限制，只要是使试样中的病毒与病毒结合物质的结合达到可以 对病毒进行定量的程度的条件即可。作为接触条件的要素，包括温育温度和温育时间。此外，体液可以直接与病毒结合物质接触，或者可以在该体液中加入期望的缓冲 液等，然后再与病毒结合物质接触。而且，在加入所望的缓冲液等时，加入的缓冲液的量有 必要在计算病毒量时予以考虑。温育温度的下限可以是4°C或10°C，上限可以选自50°C、45°C、4(TC、37°C、3(rC、 25°C和20°C。作为优选的温育温度，可以列举出10°C 37°C、10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。温育时间的下限可以选自1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分 钟，上限可以选自一夜、10小时、8小时、5小时、3小时、2小时、1. 5小时和1小时。作为优 选的温育时间，可以列举出5分钟 2小时、10分钟 1. 5小时、30分钟 1小时。在本发明的方法中的病毒结合物质与载体间接结合的实施方式中，在使病毒结合 物质与体液接触前、或接触的同时、或接触后，通过能够与载体结合的分子使病毒结合物质 与载体相接触并结合。对于使病毒结合物质与载体相接触的条件没有特殊限制，只要是病 毒结合物质通过能够与载体结合的分子可以充分地结合于载体的条件即可。作为接触条件 的要素，包括温育温度和温育时间。可以适宜地选择与上述的使病毒与病毒结合物质相接 触的条件相同的条件，作为特别优选的温育时间，可以列举出1分钟 2小时、3分钟 1小 时、5分钟 30分钟。载体的分离通过病毒结合物质而捕捉到作为定量对象的病毒的载体，可以根据该载体的性 质，采用本领域技术人员公知的方法，从作为试样的体液中分离。例如，对于珠子等粒状载体，通过离心分离并进而除去上清，可以实现将载体从试 样分离。在载体为磁珠的情况下，通过使用磁铁收集载体并除去上清，可以将载体从试样分 离。在载体为薄膜、滤膜等形状的情况下，通过将载体从试样中捞起来、或者使试样通过载 体后，可以将载体从试样分离。当载体被设计由病毒来填充起孔结构的内部(例如微板等) 时，简单通过将试样从孔中除去，即可将载体从试样分离。此外，视需要为了除去非特异性结合在从试样分离的载体上的物质，可以增加对 分离出的载体进行洗涤的步骤。对于洗涤步骤中采用的洗涤液、温度的条件没有特殊限制， 只要维持病毒与病毒结合物质间的结合和/或病毒结合物质与载体间的结合的条件得以 保持即可。优选地，洗涤液具有缓冲能力，可以是以pH7 8的缓冲液、例如Tris/EDTA(TE)、 PBS、HEPES、TBS等为基础的缓冲液。此外，洗涤液的pH可以为6 9、优选7 8。对于洗涤温度没有特殊限制，洗涤温度的下限可以是4°C或10°C，上限可以选自 50 V、45°C、40 V、37°C、30°C、25°C和20 V。作为优选的洗涤温度，可以列举出10°C 37°C、 10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。浓缩病毒溶液的定量将捕捉了作为定量对象的病毒的载体从作为试样的体液分离和/或洗涤后，向该 载体中加入少于该体液的初期体积的量的缓冲液。由此，与体液的HHV浓度相比，使回收的 试样中的HHV浓度提高。对于少于体液的初期体积的量没有特殊限制，可以是初期体积的 1/2、1/10、1/20、1/40、1/60、1/80、1/100。加入到捕捉了作为定量对象的病毒的载体中的缓冲液，可以根据其后采用的病毒 的定量方法适宜选择。与体液中的HHV浓度相比，提高了如上述回收的试样中的HHV浓度之后，进行病毒 数的定量。在本说明书中，“对病毒数进行定量”是指对试样中存在的病毒的量进行定量。 因此，“对病毒数进行定量”包括例如，以绝对病毒数、病毒浓度或病毒效价的形式，直接或 间接地进行定量。作为病毒数的计量方法，有对病毒DNA量进行定量的方法、对病毒粒子来源的抗原的数量进行定量的方法，可以适宜采用公知的定量方法。作为前者，可以列举出 基于实时 PCR 法等 PCR(Science，(1985) ,230 1350-1354)的方法、利用 LAMP 法(Nucleic Acids Res. , (2000)，28 :Ε63)等的DNA定量方法。作为后者，可以列举出利用夹心ELISA 法等的抗原蛋白质的定量方法。此外，还有使病毒感染期望的感染用细胞，以病毒效价的形 式进行定量的方法。而且，在测定病毒DNA量时，必须破环病毒外膜蛋白质。为此，并非限定，可以优选 在适当的缓冲液中进行热处理、添加表面活性剂、蛋白酶K( ^nr f-^K)处理或它们的 组合等。对于缓冲液没有特殊限制，进行反应的pH可以是5. 0 9. 0、优选6. 0 8. 0、更 优选7. 0 8. 0。pH7 8的缓冲液可以是以例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES、TBS等为基 础的缓冲液。对于热处理的温度没有特殊限制，优选的热处理温度可以是60°C 100°C、更 优选70°C 95°C、更优选80°C 95°C，处理时间可以是5分钟 1小时、优选10分钟 30 分钟。对于表面活性剂的种类没有特殊限制，只要不影响后续的病毒定量测定即可，可以列 举出例如NonidetP-40、Tween20、Triton X-IOO等，其浓度分别可以是0. 01%~ 1%、优选 0. 05 % 0. 5 %、更优选0. 05 % 0. 25 %。在组合热处理和表面活性剂时，可以在上述条件 的范围内适宜组合。2.试剂盒此外，本发明还提供用于基于本发明的方法对从体液采集的人疱疹病毒数进行定 量的试剂盒。在一类实施方式中，本发明的试剂盒至少包含生物素化病毒结合物质和结合了 生物素结合蛋白质的载体。优选地，本发明的试剂盒至少包含生物素化病毒结合物质、结合 了生物素结合蛋白质的载体、和预先确定了浓度的基准病毒。关于病毒结合物质、生物素结 合蛋白质、载体和基准病毒，如上述定义。在其它实施方式中，本发明的试剂盒至少包含结合有病毒结合物质的纳米珠。优 选地，本发明的试剂盒至少包含结合有病毒结合物质的纳米珠和预先确定了浓度的基准病 毒。关于病毒结合物质、纳米珠和基准病毒，如上述定义。本发明的试剂盒中还可以包含本发明的方法中的、用于使病毒与病毒结合物质结 合的缓冲液、用于洗涤分离出的病毒结合载体的缓冲液、和/或用于其后加入到该载体中 的缓冲液。此外，本发明的试剂盒中还可以包含用于进行病毒的定量的试剂和/或缓冲液。 例如，当病毒的定量方法是基于DNA量的定量的方法时，可以列举出DNA聚合酶、引物、视需 要而定的合适的探针、合适的缓冲液等。当病毒的定量方法是基于抗原的数量的定量的方 法时，可以列举出识别抗原的抗体、用于检测的合适的二次抗体、合适的缓冲液等。 本发明的试剂盒中，各种试剂可以封装在合适的容器中。此外，本发明的试剂盒还 可以包含用于对其中所含的试剂等进行适当捆包的包装。 此外，本发明的试剂盒还可以包含合适的使用说明资料。使用说明资料包括但 不限于包装上记载的使用方法或印刷品、电子记录媒体(例如磁盘、磁带、盒式存储器 (cartridge)、芯片)和光学媒体(例如CD ROM)等可向使用者传达本发明的试剂盒的使用 方法的媒体。此外，连接至提供使用说明资料的互联网站点的地址的记载也包含在使用说
19明资料中。 实施例以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些并不是对本发明的技术范围的 限定。本领域技术人员可以基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更，这些也包 含在本发明的技术范围内。实施例1能够检测HHV的凝集素的探索
使生物素化的凝集素与培养的HHV-6溶液反应，研究了是否能够通过与结合有 tamavidin的磁珠相结合来浓缩HHV-6。1.从培养T细胞制作HHV-6溶液使表达EGFP的重组HHV-6 (专利第3923505号)感染人脐带血来源培养T细胞， 制作了 EGFP型HHV-6溶液。2. tamavidin 磁珠的制作将表面用羧基包覆的磁珠(DynabeadsM-270 Carboxylic Acid, Dynal 公 司)300 μ 1用0. OlN氢氧化钠300 μ 1洗涤10分钟后，再用超纯水300 μ 1洗涤3次，每次 10分钟。对于洗涤完毕的磁珠，添加用冷超纯水溶解的盐酸1-乙基-3_(3- 二甲基氨基丙 基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC) (PIERCE公司)使得最终浓度为0. 2M,室温振荡30分钟。然 后，用冷超纯水300 μ 1、再用50mM MES缓冲液(pH5. 0) 300 μ 1洗涤磁珠，混合0. 6mg/ml的 tamavidin 300 μ 1 (180 μ g)来替代50mM MES缓冲液(pH5. 0)。通过室温振荡30分钟，使 tamavidin与磁珠通过共价键结合。用磁铁回收磁珠，除去上清。接下来，用50mM TRIS缓 冲液(pH7. 0)300 μ 1除去珠子的未反应羧基，然后用含0. 5% BSA、0. 1% Tween20的PBS缓 冲液300 μ 1封闭磁珠，从而完成了磁珠的制作。tamavidin磁珠的生物素结合活性为每Iml 珠悬浮液15nmol。3.重组HHV-6溶液的浓缩利用上述项目1中制作的EGFP型HHV-6溶液，以重组HHV-6的感染效价为指标， 尝试进行了病毒浓缩。生物素化凝集素使用了 J-OIL MILLS公司制造的15种凝集素(Con A, DBA, LCA, ΡΗΑ-Ε4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ΑΒΑ, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA)。首先，在进行凝集素的探索之前，进行了作为背景的tamavidin的非特异性吸附 的确认。首先，混合EGFP 重组 HHV-6 液 100 μ 1 (浓度 IO4 个 /ml TE)与 PBS 500 μ 1，15°C温 育1小时(颠倒混合)。接着，将上述项目2中制作的tamavidin磁珠添加到反应液中，再次 15°C温育1小时(颠倒混合)。然后，将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台 后，用PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 μ 1洗涤2次。接着，将其悬浮于培养液(RPMI1640+10% 胎牛血清)500 μ 1后，将全部与0.5ml的指示细胞(MT4细胞)一起悬浮。而且，可以认为 如果存在EGFP型HHV-6，则EGFP型HHV-6感染指示细胞，HHV-6的DNA进入细胞中，其中重 组到病毒中的EGFP基因得以表达，从而发出GFP荧光。上述实验的结果如图1所示，可以确认基本上没有HHV-6针对tamavidin珠子的 非特异性吸附。接下来，考察了使用各种凝集素进行病毒浓缩是否可行。
首先，混合EGFP 重组 HHV-6 液 100 μ 1 (浓度 IO4 个 /ml TE)与 PBS 500 μ 1,生物 素化凝集素 ο μ g，15°C温育1小时(颠倒混合)。接着，将上述项目2中制作的tamavidin 磁珠添加到10μ 1反应液中，再次15°C温育1小时(颠倒混合)。然后，将装有反应液的试 管立于Dynabeads用磁铁台后，用PBS 2mMEDTA 0.5% BSA 200 μ 1洗涤2次。接着，将其悬 浮于培养液(RPMI1640+10%胎牛血清)500 μ 1后，将全部与0. 5ml的指示细胞(MT4细胞) 一起悬浮，观察了 EGFP的表达。可以认为如果能够浓缩EGFP型HHV-6，则通过凝集素-生 物素-tamavidin与磁珠结合在一起的EGFP型HHV-6感染指示细胞，HHV-6的DNA进入细 胞中，其中重组到病毒中的EGFP基因得以表达，从而发出GFP荧光。作为实验结果，例如图2、图3所示，在使用SBA、SSA、DSA或WGA时，观察到了比病 毒原液更多的EGFP的表达。该事实表明，使用这些凝集素能够有效率地浓缩HHV-6。t施例2某准病毒的唾液中HHV-6的定量在不使用基准病毒的情况下，利用生物素化凝集素和tamavidin磁珠对唾液中的 HHV-6浓度进行了定量。1.睡液的采集使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司制造)采集来自受试者的唾 液。在即将进行唾液采集之前，受试者用蒸馏水漱口 2次，然后将唾液收集管的棉芯含于口 腔内2分钟，采集了唾液。2.采用传统方法讲行HHV-6的定量首先，采用传统方法对唾液中的HHV-6浓度进行了定量。对于上述项目1中采集的唾液400 μ 1，使用BioRobot EZl (QIAGEN公司)与EZl Virus Mini Kit v2. 0 (QIAGEN 公司)，按照 EZl Virus MiniHandbook (QIAGEN 公司)的规 程，对唾液中的HHV-6DNA进行了纯化。将所得DNA用于定量PCR。在定量PCR中，采用实时PCR法对HHV-6的TO5/66区 域进行了定量。PCR中使用的序列是引物5' -GACAATCACATGCCTGGATAATG-3‘ (SEQ ID NO :1)；和引物5' -TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA-3 ‘ (SEQ ID NO 2)；以及TaciMan 探针FAM5' -AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3 ‘ TAMRA (SEQ ID NO 3)；使用 FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 公司)进行了 反应温度 950C 10分钟1次，95°C 5秒+60°C 31秒的循环45个的实时PCR。而且，本试验中病毒实验由极熟练的实验者来进行。作为以上结果，唾液Iml中的HHV-6DNA是14616拷贝/ml。3.利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠进行的HHV-6的定量在上述项目1中采集的唾液400 μ 1中混合44 μ 1的10倍浓度PBS、生物素化SBA lnmol, 15°C温育1小时(颠倒混合)。接着，将实施例1的项目2中制作的tamavidin磁 珠100 μ 1添加到反应液中，再次于15°C温育1小时(颠倒混合)。然后，将装有反应液的 埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台上后，用PBS 500 μ 1洗涤3次。向其中加入10μ1的 TE，98°C处理10分钟后，在磁铁台上回收上清，将其中的5μ 1用于定量PCR。定量PCR中， 像上述项目2那样对HHV-6TO5/66区域采用实时PCR法进行了定量。作为其结果，经测定，洗脱液5μ1中的HHV-6量是2934拷贝。因此，可以计算出
21TElO μ 1中存在的HHV-6是5868拷贝。这是最初存在于唾液400 μ 1中的HHV-6量，因而换 算成每Iml的量，经计算为14670拷贝/ml。该值与上述2中采用传统方法测定的值(14616 拷贝/ml)十分一致。这种情况下，可以认为病毒的回收率基本上为100%。以上事实显示，可以利用生物素化SBA进行HHV-6的定量。t施例3 #用某准病毒讲行的唾液中HHV-6的定量对于唾液中的HHV-6浓度，利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠和基准病毒进行
了定量。1.睡液采集方法使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司制造)采集来自受试者的唾 液。在即将进行唾液采集之前，受试者用蒸馏水漱口 2次，然后将唾液收集管的棉芯含于口 腔内2分钟，采集了唾液。2.利用传统方法讲行的HHV-6的定量采用与实施例2的项目2相同的方法，进行了唾液中的HHV-6的定量。而且，本试 验中病毒实验由极熟练的实验者来进行。其结果示于表1。3.利用牛物素化凝集素、tamavidin磁珠、某准病毒讲行的HHV-6的定量(1)使用生物素化WGA进行的HHV-6的定量在上述项目1中采集的唾液400 μ 1中添加含1000拷贝的EGFP型HHV-6的EGFP 型HHV-6溶液。接着，混合44 μ 1的10倍浓度PBS、生物素化WGAlnmol，15°C温育30分钟 (颠倒混合)。然后，在反应液中添加实施例1中制作的tamavidin磁珠100 μ 1，再次于 15°C温育30分钟(颠倒混合)。然后，将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁 台上后，用PBS 500 μ 1洗涤3次。接着，加入蛋白酶K缓冲液(加入TE中lmg/ml的蛋白 酶K、0. 45% ΝΡ-40、0. 45% Tween20而得到)40 μ 1，56°C温育1小时，破坏病毒粒子，使基 因组DNA游离出来。然后，在磁铁台上回收上清。对于上清，98°C处理10分钟使蛋白酶K 失活后，使用其中的5 μ 1进行了定量PCR。在定量PCR中，采用实时PCR法对仅EGFP重组 病毒具有的EGFP基因、和野生型HHV-6中存在而重组病毒中缺损的HHV-6TO基因进行了定 量。作为用于对EGFP基因进行定量的引物和Taqman探针，使用了 引物5' -CTGCTGCCCGACAACCA-3‘ (SEQ ID NO 4)；和引物5' -TGTGATCGCGCTTCTCGTT-3‘ (SEQ ID NO 5)；以及TaqMan 探针 FAM5 ‘ -CTGAGCACCCAGTCCGCCCTG-3 ‘ TAMRA (SEQID NO :6)。作为用于对HHV-6TO基因进行定量的引物，使用了 引物5' -CGAAGAAAAGTAGCACAGGTCTCC-3‘ (SEQ ID NO 7)；和引物5' -ACCGTGTCATAAATGCTGAGTTGG-3 ‘ (SEQ ID NO :8)；以及，TaciMan 探针FAM5 ‘ -AGGCACCCGTTCCGCCCCAGC-3 ‘ TAMRA (SEQID NO :9)。实时 PCR 法使用 FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 公司)如下进行反应温度 950C 10分钟1次，95°C 5秒+60°C 31秒的循环45个。根据从EGFP基因的上述实时PCR法的结果定量得到的EGFP型HHV-6数与初始添 加的EGFP型HHV-61000拷贝之比，计算出了各实验中EGFP型HHV-6的回收率。在该回收 率的基础上乘以从上述HHV-6TO基因的上述实时PCR法的结果测定得到的野生型HHV-6数来进行修正，即为通过本方法的方法定量得出的值。使用不同的3种唾液待检物进行了以上实验。其结果示于表1。表权利要求
一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与病毒结合物质接触，并且，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过该分子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒结合于载体；(3)将该载体从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收率，由(4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。
2.一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与凝集素接触，并且，(i)该凝集素上连接有能够与载体结合的分子，并且该凝集素通过该分子结合于载体， 从而与凝集素结合的病毒间接地结合于载体，或者( )该凝集素直接结合于载体，从而使与凝集素结合的病毒结合于载体；(3)将该载体从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的载体回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收率，由 (4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。
3.—种对从唾液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)在(1)的液体中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，再添加结合 有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子；(3)将该珠子从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的珠子处回收的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收率，由 (4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从唾液中采集的人疱疹病毒数。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述人疱疹病毒是人疱疹病毒 6 (HHV-6)或人疱疹病毒7 (HHV-7)。
5.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述基准病毒是HHV-6或HHV-7来 源的重组病毒。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6键的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少一种的糖链结 合的凝集素。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述凝集素选自SBA(大豆来源)、SSA(无梗接 骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)。
8.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述步骤⑷包括采用选自PCR、LAMP和ELISA中的方法对病毒数进行定量。
9.一种对从唾液采集的人疱疹病毒6 (HHV-6)或人疱疹病毒7 (HHV-7)的数量进行定量 的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中添加预先确定了浓度的基准病毒，并使得基准病毒浓度是10 100, 000基因组拷贝/ml，其中，该基准病毒是HHV-6或HHV-7来源的重组病毒；(2)在(1)的液体中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，再添加结合 有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子，其中，该凝集素 选自SBA (大豆来源)、SSA (无梗接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA (小麦胚芽来 源)；(3)将该珠子从(1)的液体中分离；(4)采用选自PCR、LAMP和ELISA中的方法对从分离出的珠子处回收的病毒数进行定 量；以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收率，由 (4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从唾液中采集的人疱疹病毒数。
10.一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集到的体液中添加预先确定了浓度的基准病毒；(2)使(1)的液体与直接结合在直径IOnm IOOnm的纳米珠上的病毒结合物质相接 触，从而使病毒结合于纳米珠；(3)将该纳米珠从(1)的液体中分离；(4)对从分离出的载体处回收得到的病毒数进行定量以及(5)对回收得到的基准病毒数与(1)中添加的基准病毒数进行比较来评价回收率，由 (4)中定量的人疱疹病毒数与该回收率确定从体液中采集的人疱疹病毒数。
11.一种用于对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的试剂盒，该试剂盒包括生物素化凝集素；结合有生物素结合蛋白质的珠子。
12.一种用于对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的试剂盒，该试剂盒包括生物素化凝集素；结合有生物素结合蛋白质的珠子；预先确定了浓度的基准病毒。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中，所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6键的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙酰葡糖胺(GlcNAc)中至少一种的糖链结合 的凝集素。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述凝集素选自SBA(大豆来源)、SSA(无梗 接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)；且所述基准病毒是HHV-6或 HHV7-来源的重组病毒。
15.一种对从体液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)使采集的体液与病毒结合物质接触，并且，(i)该病毒结合物质上连接有能够与载体结合的分子，并且该病毒结合物质通过该分 子结合于载体，从而结合有病毒结合物质的病毒间接地结合于载体，或者(ii)该病毒结合物质直接结合于载体，从而使结合有病毒结合物质的病毒结合于载体；(2)将该载体从(1)的液体中分离；(3)对从分离出的载体处回收得到的病毒量进行定量。
16. 一种对从唾液采集的人疱疹病毒数进行定量的方法，该方法包括以下步骤(1)在采集的唾液中混合生物素化凝集素，使病毒与生物素化凝集素接触，再添加结合 有生物素结合蛋白质的珠子，使与生物素化凝集素结合的病毒结合于珠子；(2)将该珠子从(1)的液体中分离；(3)对从分离出的珠子处回收的病毒数进行定量。
全文摘要
本发明涉及对从体液采集的人疱疹病毒(HHV)数进行定量的方法、以及用于进行该方法的试剂盒。传统上，对来自体液的HHV数准确进行定量需要熟练的技术。本发明的方法提供能够对体液中的HHV数更简便、准确且有效率地进行计量的新定量方法。本发明的方法是能够胜任对体液中的HHV数进行持续评价的方法，因而，也可以适用于针对疲劳蓄积的定量评价。
文档编号C12Q1/06GK101983244SQ200980112159
公开日2011年3月2日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者市川雅子, 清水昭宏, 近藤一博, 高仓由光 申请人:日本烟草产业株式会社