Ice1,一种植物冷诱导转录组和耐寒调节剂的制作方法

专利名称：Ice1,一种植物冷诱导转录组和耐寒调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及有关植物冷诱导转录组和耐冻调节的蛋白质和核酸。
背景技术：
寒冷是一个限制许多植物物种地理分布和生长季节的环境因素，经常不利于作物的质量和产量(Thomashow 1999)。例如，大多数温带植物能够获得对冷冻温度的耐受力，其通过众所周知的这样一个冷适应过程，就是事先将植物暴露于低的非冷冻温度下(Guy 1990；Hughes and Dunn 1996；Browseand Xin 2001)。但是，热带和亚热带起源的植物就无法适应寒冷气候，并且对骤冷温度(0-10℃)很敏感。许多研究表明植物中冷调节基因表达对忍受骤冷(Gong et al.2002)和冷适应(Thomashow 1999；Knight et al.1999；Tahtiharju and Palva 2001)是一个关键。冷反应基因编码一批不同的蛋白质，比如参与碳水化合物的呼吸和代谢的酶、脂类、苯丙素(phenylpropanoids)和抗氧化物；分子陪伴蛋白质、抗冻蛋白；以及其它可能具有由冷冻引起的脱水耐受性功能的物质(Thomashow 1999；Guy 1990；Mohapatra et al.1989)。
许多冷冻和脱水反应基因在它们的启动子里具有一个或几个DRE/CRTcis-成分的拷贝，具有核心序列CCGAC(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki1994；Stockinger et al.1997)。转录因子族如众所周知的CBFs或DREB1s结合到这个成分上，激活冷冻和脱水反应基因的下游转录(Stockinger et al.1997；Liu et al.1998)。有趣的是，CBF/DREB1基因本身受低温诱导。这个诱导作用是瞬时的并且是先于带有DRF/CRT cis-成分下游基因的诱导作用(Thomashow1999)。所以，有一个转录级联引导DRE/CRT组的基因在寒冷压力下进行表达。植物中CBFs/DREB1s的异位表达甚至在温暖的温度下开启下游寒冷-反应基因，并给与改进了的耐寒力(Jagglo-Ottosen et al.1998；Liu et al.1998)。
因为CBF转录产物在植物暴露于寒冷中15分钟内开始积累，Gilmour etal(1998)认为有一个转录因子在正常生长温度下早已存在于细胞中，在暴露于寒冷压力时识别CBF启动子诱导CBF的表达。Gilmour et al(1998)将未知激活剂命名为“ICE”(Inducer of CBF Expression，CBF表达诱导剂)蛋白质并假设将植物暴露于寒冷条件下，无论是ICE或与其相关的蛋白质的改变，都使ICE结合到CBF启动子上并激活CBF的转录。
在含有CRT/DRE成分的RD29A启动子(Ishitani et al.1997)驱动下表达萤火虫荧光素酶报道基因的拟南芥植物的基因学分析，已经识别了几种解除寒冷-反应基因表达的突变体。hos1(high expression of osmoticallyresponsive genes，渗透反应基因的高表达)突变体显示了CBFs基因及它们下游寒冷反应基因的增进了的寒冷诱导作用(Ishitani et al.1998)。在正常的生长温度时HOS1编码一个存在于细胞质中的RING手指蛋白，但经寒冷处理时蛋白累积在细胞核里。因为许多RING-手指蛋白作为泛蛋白E3酯酶，所以认为HOS1是通过标靶用于泛蛋白化作用和降解作用的CBFs一定的正调节剂，来行使功能的(Lee et al.2001)。CBF基因的转录也是在它本身的基因产物或它的下游靶基因产物的反馈抑制下进行。这是由对los1突变体研究揭示出来的，其在转录延长因子2基因上有缺陷(Guo et al.2002)。los1突变阻隔了带有CRT/DRE成分基因的寒冷诱导作用，但是引起CBF基因的超诱导。有研究表明在los1突变体植物中的蛋白质的合成尤其是在寒冷时受到破坏。因而寒冷-诱导CBF转录物不能被翻译来激活下游基因，反馈抑制不会发生，导致CBF转录物的超诱导(Guo et al.2002)。
另一个拟南芥突变体los2，同样削弱含CRT/DRE成分基因的寒冷诱导作用(Lee et al.，2002)。LOS2能编码一个双功能烯醇酶，其结合到ZAT10的启动子上，即锌指转录阻遏物。在野生型植物中，ZAT10在寒冷诱导下被迅速和瞬时地表达出来，并且这个诱导作用在los2突变体里更强更稳定。所以，LOS2能够通过ZAT10转录阻遏物控制延迟寒冷反应基因的表达(Lee etal.，2002)。拟南芥基因座LOS4经过冷处理参与CBF转录物的累积(Gong etal.，2002)。los4-1突变体植物对寒冷压力是敏感的，并且冷敏感可被CBF3异位表达而拯救(Gong et al.，2002)。LOS4编码一个DEAD框RNA解螺旋酶，此提示RNA代谢可能参与寒冷反应。
因为环境因素如寒冷，限制了许多植物种类的地理分布和生长季节，并经常有害于作物的质量和产量，因而仍旧需要增强植物的冷适应力，尤其是那些极为有用的农作物。

发明内容
本发明的一个目的是为增强植物的冷适应力提供方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供具备增强了的冷适应力的植物和植物细胞。
本发明的这些目的和其它的目的，是通过增强植物冷适应力的方法得以实现，包括ICE1在植物中的过表达。
本发明的目的可以通过增强植物细胞冷适应的方法得以实现，包括ICE1在植物细胞中的过表达。
本发明的目的可以通过含有编码ICE1的核酸转化的植物或植物细胞得以实现。
因而，本发明还通过编码ICE1的核酸转化一种植物或植物细胞，提供产生这种植物或植物细胞的方法。
本发明还提供具有氨基酸序列SEQ ID NO2的分离的和纯化了的ICE1。
本发明还提供生产如上所述的ICE1的方法，包括在ICE1表达的情况下，培养经由编码ICE1核酸转化的受体细胞以及分离ICE1。
在另一项实施例中，本发明提供一种具有ICE1转录激活剂功能的分离和纯化了的酶，其中，酶的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO2具有从70％到小于100％的同源性。
本发明还提供一种生产如上所述的酶的方法，包括在该酶表达的情况下，培养经由编码该酶核酸转化的受体细胞以及分离该酶。
本发明还提供增强植物寒冷适应力的方法，包括ICE1转录激活剂在植物中的过表达。
本发明还通过增加一或多个额外的转录因子的表达，其可从CBF转录因子和DREB1转录因子一组因子中选择，和/或通过增加一或多个冷反应基因，提供增强植物冷适应力的方法。
本发明已经完成利用基因筛选识别CBF蛋白质冷信号元件上游。冷反应生物发光体拟南芥植物通过在CBF3启动子的控制下表达萤火虫荧光素酶(LUC)编码序列而改造。纯合CBF3-LUC植物是经过化学诱变处理和发光成像分离的、带有改变的冷诱导CBF3-LUC表达的突变体。在本发明中，发明人报道了ice1(inducer of CBF expression 1，CBF表达1诱导剂)突变体，其在CBF3-LUC冷诱导下被削弱且在寒冷气候下不表达。ICE1编码似MYC碱性螺旋-环-螺旋激活剂，其结合到CBF3启动子上。所以，ICE1在调节拟南芥冷反应基因表达和寒冷耐受性方面起着关键的作用。
以上目的说明了本发明的某些方面。本发明的其它目的、内容和实施例将在以下说明书中作详细的描述。


对本发明更全面的评价和优势将通过以下的附图和详细的

得以阐述。
图1.icel突变阻隔了CBF3的冷诱导并影响了其它寒冷反应基因的表达。(A)形态学(左)和野生型和ice1籽苗的CBF3-LUC发光成像(右)。植物的发光成像在冷处理(0℃)12小时后获得。(B)野生型(实心圆)和icel(空心圆)籽苗在不同冷处理时间发光强度的定量分析。(C)植物的野生型和ice1对冷处理的CBFs及它们下游靶基因的转录物水平。籽苗在零时(0h)表示未处理以及经寒冷处理(0℃)用时段(h)表示。微管蛋白基因用来作为装填标准。WT表示野生型。
图2.形态学，ice1突变体植物冷冻和寒冷的敏感性。(A)在琼脂营养培养基上正常生长条件下的野生型和ice1籽苗。(B)在土壤正常生长条件下的野生型和ice1籽苗。(C)ice1植物在冷适应时呈缺陷形状。在22℃条件下生长十天的籽苗在-12℃冷冻处理之前在光照和4℃条件下生长4天。照片显示在冷冻处理三天之后的情况。(D)在不同温度处理下存活率的比较。空心圆和空心三角分别代表野生型和ice1植物。(E)ice1植物对延长的冷冻处理是敏感的。植物在22℃发芽后，在4℃下生长6个星期。(F)冷冻处理六个星期之后存活率的比较。
图3.通过在野生型植物中ice1显性突变表达的ICE1基因克隆的确证。(A)含有ice1突变基因组片段在野生型的表达，重现ice1突变表型。七天大的野生型、ice1和带有生长在MS琼脂培养基上的突变基因ice1转化的野生型在寒冷(0℃)条件下处理12小时。(B)CBF3-LUC在野生型(WT)、ice1和带有突变基因ice1转化的野生型在寒冷(0℃)条件下处理12小时的生物发光水平的定量分析。
图4.ICE1编码一个bHLH蛋白。(A)ICE1蛋白质的整个域结构。一个公认的酸性域(acidic)、富丝氨酸区(S-rich)、bHLH域结构以及可能的拉链区(ZIP)被显示出来。箭头所指在ice1突变体氨基酸残基发生变化。(B)ICE1的bHLH结构域与ZIP区与其它植物和动物的bHLH蛋白的序列对比。相同和相似的残基分别以黑色和灰色表示。粗线表示碱基区域，空心线与一个环相连，显示螺旋-环-螺旋结构域。拉链区以点状线表示。DDJB/EMBL/GenBank编号和氨基酸编号(在括弧内)为ICE1(SEQ ID NO2)，AY195621(300-398)；Atlg12860(SEQ ID NO3)；NM_101157(638-731)；At5g65640(SEQ ID NO4)；NM_125962.1(171-269)；At5g10570(SEQ ID NO5)；NM_121095.2(144-242)；rd22BP(SEQ ID NO6)；AB000875(446-544)；ATR2(SEQ ID NO7)；NM_124046.1(409-507)；maize R gene(SEQ ID NO8)；M26227(410-508)；TT8(SEQ ID NO9)；AJ277509(357-455)；PIF3(SEQ IDNO10)；AF100166(254-352)；PIF4(SEQ ID NO11)；AJ440755(255-353)；MAX(SEQ ID NO12)；P52161(21-107)；c-myc(SEQ ID NO13)；1001205A(354-435)。星号表示众所周知与核苷酸相互作用的MAX氨基酸残基(Grandori et al.2000)。
图5.ICE1基因的表达和ICE1蛋白质在亚细胞的定位。(A)ICE1启动子驱动GUS在一个野生型籽苗的表达。(B)ICE1启动子-GUS在不同植物组织的表达，以及用RT-PCR分析的相应的ICE1转录物水平。微管蛋白基因在RT-PCR内用来作为内标准。(C)在各种非生物条件下在野生型籽苗的ICE1表达的RNA印迹分析。植物所接受的处理为对照，仅给与MS盐；NaCl，300mM NaCl 5个小时；ABA，100μM脱落酸3个小时；冷处理，0℃2个小时；脱水，空气干燥30分钟。(D)GFP-ICE1融合蛋白在细胞核的定位。平板(a)-(c)为GFP-ICE1转基因植物的根细胞的共焦成像，平板(d)为丙啶(propidium)染色显示的核定位。
图6.ICE1蛋白在CBF3启动子里结合到MYC-识别成份上。(A)在用于EMSA的CBF3启动子寡核苷酸的序列和位置。黑体字母表明MYC-识别基序在MYC-1(SEQ ID NO38)，在MYC-2(SEQ ID NO37)，在MYC-3(SEQID NO36)，MYC-4(SEQ ID NO35)和MYC-5(SEQ ID NO34)的序列。在P1(SEQ ID NO39)寡核苷酸的黑体字母是公认的MYB-识别基序。标有P2，MYC-2(wt)和MYC-2(M)的序列分别相应于(SEQ ID NO40)，(SEQID NO41)和(SEQ ID NO42)。(B)ICE1蛋白和32P标记的MYC-1之间通过MYC-4 DNA片段的相互作用。(C)ICE1结合到MYC-2 DNA片段上更强于结合到其它DNA片段上。(D)在MYC-识别基序的共有的核苷酸残基对于ICE1和MYC-2 DNA片段之间的互相作用很重要。(E)ice1突变体蛋白质也结合到MYC-2DNA片段上。用于每一个实验的标记了的寡核苷酸显示于每一个平板的上端。三角形代表用于(B)、(C)和(D)竞争未标记的寡核苷酸的增加量，其相当于每一个探针的50、100和250倍的超额量。
图7.ICE1是一个转录激活剂并且它的过表达提高CBF调节子在寒冷条件下的功能并且改进冷冻耐受性。(A)图解用于瞬时表达列的报道基因和效应基因质粒。一个GAL4反应报道基因用于这个实验中。Nos表示胭脂碱合成酶基因的终止信号。Ω表示烟草花叶病毒的转录增效剂。GAL4 DB是酵母转录因子GAL4的DNA结合域。(B)GAL4-LUC和35S-GAL4-ICE1或35S-GAL4-ice1转染后相对荧光素酶活性。为将每一次转染所得的数值标准化，从Renilla而来的荧光素酶基因用作内对照。荧光素酶活性用相对于Renilla荧光素酶(如Ohta et al.，2001的文章所述)活性的任意单位来表示。数值为三个基因枪法的平均值，误差线为标准偏差。(C)在野生型和ICE1过表达基因转化(超-ICE1)植物中的ICE1 RNA印迹分析和冷反应基因的表达。籽苗在零时不经处理，在低温(0℃)时进行3到6个小时的处理。菲啶溴红染色的rRNA带为装填对照。(D)CBF3-LUC在野生型和ICE1过表达转化基因(超-ICE1)植物中的表达(由发光强度表示)。(E)经过冷冻处理之后，ICE1过表达转化基因(超-ICE1)植物改进了的存活力。
本发明的详细说明除非特别限定，此处所使用的所有的科技名词与那些在生物化学、细胞生物学和分子生物学领域内的熟练的技术人员所理解的术语都一样。
所有与此处描述的相似或相当的方法和材料，可以利用此处描述的方法和材料，用于实践中或对本发明进行测试。所有在这里提到的出版物、专利申请、专利和提到的其它参考资料，都作为参考。在有冲突的情况下，由本说明书包括解释支配。更一步说，材料、方法和实施例仅是用来说明而不是限制，除非作特别说明。
本发明所用参考书涉及含有定义和方法以及用于进行基本技术的手段的分子生物学标准教科书。比如，Maniatis et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1982)，和Sambrood et al.，Molecular CloningA laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)；Methods in Plant Molecular Biology，Maligaet al.，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)；拟南芥，Meyerowitz et al.，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1994)以及各种引用的参考资料。
术语“植物”包括整个的植物、植物器官(比如，叶，茎、根，等等)、种子和植物细胞及其后代。可用于本发明方法的植物种类，包括能进行转化作用技术的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。优选植物包括大米、玉米、小麦、棉花、花生和大豆。
所以，在本发明的一项实施例中，冷适应力可通过增加植物可利用蛋白质的量得以增加或增强，优选是通过增加植物体内的ice1基因。
因而，本发明的一项实施例是植物细胞携带有多聚核苷酸，优选的是带有分离的多聚核苷酸的转基因植物。
如本处所使用的，术语“增强”意指增加一个或多个植物细胞和/或植物内酶的胞内活性，酶被相应的DNA编码。“增强”可借助细菌细胞的各种处理而获得。为获得“增强”，尤其是过表达，要增加相应的基因拷贝数量，一个很强的启动子，或者是位于结构基因上游的启动子-和调节区或核糖体结合点可发生变异。连接于结构基因上游的表达盒可以起同样的作用。另外，通过使用可诱导的启动子来增加表达是可能的。一个编码相应的具有高活性酶的基因也可以被使用。表达亦可通过调节延长mRNA的寿命得以促进。更进一步地说，阻止酶的退化来增加酶整体的活性。更进一步地说，这些方法可选择性地结合到任意一种所需的方式中。改变植物基因活性的这些和其它的方法如书里所述，如，在Methods in Plant Molecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)。
所述的“表达盒”包括一个在植物细胞里有功能的启动子，连接于一个编码ICE1蛋白质序列SEQ ID NO2的分离的核酸，其中，植物细胞中蛋白质的增进表达增强了植物细胞的冷适应力。在本发明的一项优选实施例中，启动子可从下列一组启动子中选择，病毒外套蛋白质启动子、特定组织启动子、泛蛋白启动子、压力诱导启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合成启动子、微管蛋白启动子、napinR基因复合体启动子、西红柿E8启动子、patatin启动子、甘露氨酸合成酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养贮存蛋白质启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根-细胞启动子、ABA-诱导启动子以及细胞膨胀-诱导启动子。
编码具有高活性的相应的或变异的酶的基因也可使用。优选相应酶的活性应高于原有酶的活性，最好是至少高于5、10、25％或50％以上的活性，更好是原有酶活性的两倍。
在本申请的上下文中，按照本发明，一条多聚核苷酸序列在碱基组成和碱基序列上相应于本发明序列具有至少70％，优选是至少80％，最好至少是90％的“同源性”。按照本发明，“同源蛋白质”应该理解为所包括的蛋白质的氨基酸序列与序列SEQ ID NO2或被ice1基因编码的序列SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少70％，优选的是至少80％，最好的是至少90％的相应性，此处的相应性是指相应的氨基酸具有相同的或共有的氨基酸。“同源氨基酸”是指具有相应的特性，尤其是带电性、疏水性、原子的空间排列特性等的氨基酸。因而，相应于序列SEQ ID NO2，蛋白质具有从70％到小于100％的同源性。
同源性，即核苷酸或氨基酸序列相似或序列相同，传统上使用众所周知的软件或计算机程序来确定，如BestFit或Gap两两比较的程序(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。BestFit使用Simth and Waterman，Advances in AppliedMathematics 2482-489(1981)一书中的局部同源性公式，来寻找两条序列间一致性或相似性最好的节片。Gap是进行总体序列对比，采用Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)一书中的方法，即一整条序列与另一整条相似序列间的对比。当使用程序序列对比如BestFit来确定序列同源性、相似性或一致性时，要进行预设值设定，或要选择一个合适的计分矩阵来优化一致性、相似性或同源性计分。相似地，当运用一个程序如BestFit来确定两条不同氨基酸序列之间的一致性、相似性或同源性时，同样需要用预设值设定，或者一个适合的计分矩阵如blosum45或blosum80需要选择来优化一致性、相似性或同源性计分。
本发明还涉及含有带有相应于序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列的完整基因或其片段的多聚核苷酸，其可以通过使用探针进行相应基因库杂交的方法来进行筛选而获得，探针含有所述相应于序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸或其一个片断，以及进行DNA序列分离而或得。
本发明的多聚核苷酸序列适于用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，用以分离那些表现出对ice1基因比较高的相似度，尤其是序列SEQ ID NO1的ice1基因的cDNA或基因。
本发明的多聚核苷酸序列也适用于作PCR(聚合酶链反应)的引物，用于生产编码带有ICE1转录激活剂活性的酶的DNA。
作为探针或引物的寡聚核苷酸，可以含有超过30，优选是到30，比较好是到20，最好是至少15个连续的核苷酸。至少40或50个核苷酸长度的寡聚核苷酸也是适合的。
术语“分离”是指从原来的环境中分开。
术语“多聚核苷酸”一般是指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，可用于表示未修饰的RNA或DNA或修饰了的RNA或DNA。
术语“多聚肽”是指肽或蛋白质，其含有两个或更多个由肽键相连的氨基酸。
本发明的多聚肽包括相应于序列SEQ ID NO2的多聚肽，尤其是那些具有ICE1转录激活剂生物活性的多聚肽，也包括那些与序列SEQ ID NO2具有至少70％，优选至少是80％同源性的多聚肽，最好是那些与序列SEQ IDNO1具有至少90％到95％同源性并具有所述活性的多聚肽。所以，这些多聚肽与序列SEQ ID NO2具有从70％到100％的同源性。
本发明还涉及编码DNA序列，其通过遗传密码简并由序列SEQ ID NO1产生。本发明进一步涉及与序列SEQ ID NO1或与其部分杂交的DNA序列。更进一步地，本领域熟练的技术人员会注意到保守氨基酸的替换，如蛋白质中甘氨酸被丙氨酸替换或天冬氨酸被谷氨酸替换的“有意突变”，其不会导致任何蛋白质活性的根本的改变，也就是说，这些突变是中性的。人们也知道，蛋白质N-端和/或C-端的变化更本上不会削弱它们的功能，甚至会稳定所述的功能。
同样的，本发明还涉及与序列SEQ ID NO1或其部分进行杂交的DNA序列。最后，本发明涉及利用由序列SEQ ID NO1产生的寡聚核苷酸引物经过PCR产生的DNA序列。典型的这个类型的寡聚核苷酸至少有15个核苷酸的长度。
述语“严格的条件”或“严格的杂交条件”是指在这样的条件下，多聚核苷酸与它的靶序列进行杂交，以达到一个比其它序列较高的测试度(比如，至少2倍于自然背景)。严格的条件是序列依赖且随条件不同而不同的。通过控制杂交严格度和/或清洗条件，具有与探针100％互补的靶序列可被测试出来(同源探查)。或者，严格的条件可被调节允许序列中某些错配，以便较低相似度可被测出来(异源探查)。
典型的严格条件是那些盐浓度是小于大约1.5M的钠离子，典型的是大约0.01到1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0到8.3，对短的探针(比如，10到50个核苷酸)，其温度至少大约为30℃，对长的探针(比如，长于50个核苷酸)，温度至少约为60℃。严格的条件也可以通过另加入失稳剂甲酰胺来获得。示范性的低严格条件包括在30到35％甲酰胺缓冲液，1MNaCl，1％SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸钠)，37℃下条件下的杂交作用，以及在50到55℃，1X到2X SSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠盐)条件下的清洗。示范性的适度的严格条件包括40到45％甲酰胺，1M NaCl，37℃下1％SDS的杂交作用，以及在55℃到60℃，0.5X到1X SSC条件下的清洗。示范性的高严格条件包括50％甲酰胺，1M NaCl，37℃下1％SDS的杂交作用，以及在60℃到65℃，0.1X到1X SSC条件下的清洗。
特征性在于典型的后杂交作用清洗功能，关键因素是离子强度和终清洗液的温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可以从Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284(1984)一书中得知Tm＝81.5oC.+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷的百分比，％form为杂交溶液的甲酰胺百分比，L为杂交碱基的长度。Tm为在其温度下(在特定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全相配的探针杂交。Tm降低1℃有1％的错配；因而，Tm，杂交和/或清洗条件可以被调节到与序列杂交到所需的一致性。例如，如果需要序列达到90％的一致性，Tm应降低10℃。一般说来，严格的条件选择低于熔点(Tm)5℃，用于特定的序列以及其在一个限定的离子强度和pH下进行互补。但是，特别严格的条件可进行杂交和/或清洗，在1、2、3或4℃，低于Tm；适度的严格条件进行杂交和/或清洗，在6、7、8、9或10℃，低于Tm；低严格条件进行杂交和/或清洗，在11、12、13、14、15或20℃，低于Tm。使用公式，杂交作用和清洗组合物，以及所需的Tm，本领域的普通技术人员都可以理解杂交和/或清洗溶液严格性的变化已被描述。如果所需的错配程度导致Tm小于45℃(水合溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则最好是增加SSC浓度，以便得以使用一个较高的温度。有关核酸杂交详尽的指南可在书中找到，如，Current Protocols in MolecularBiology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(2000)。
所以，利用已掌握的信息，熟练的技术人员可以测试和分离与本发明的核苷酸极为相似的核苷酸。在分离这样的核苷酸时，核苷酸可被视为比如增加植物冷适应力的本发明的核苷酸。
本发明的一项实施例是有关筛选具有同本发明的多聚核苷酸有本质同源性的多聚核苷酸的方法，最好是那些编码具有ICE1转录激活剂活性的蛋白质的多聚核苷酸。
如本领域用于植物或其类似物所熟知，本发明的多聚核苷酸序列可被一或多个适当的质粒载体所携带。
在一项实施例中，将多聚核苷酸用带有适当的适于细胞类型的细菌或真菌品系携带进行传播有优越之处。在这些类型的细胞内传播多聚核苷酸和产生蛋白质的通用方法，已为本领域所熟知并已被描述，如，Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1982)和Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)。
在另一项优选实施例中，多聚核苷酸序列包括序列SEQ ID NO1，与其互补的多聚核苷酸，与序列SEQ ID NO1一致性达到至少70％，80％和90％的多聚核苷酸；或者是那些在严格条件下与序列SEQ ID NO1杂交的多聚核苷酸，严格的条件包括在5X SSC，温度为从50℃到68℃时清洗。因而，多聚核苷酸与序列SEQ ID NO1的一致性可以从70％到小于100％。
在另一项优选实施例中，本发明的多聚核苷酸在一个载体和/或一个宿主细胞内。优选是在一个植物细胞或一个转基因植物内。优选是拟南芥(Arabidopsis thaliania)或是从一组植物中选择，包括小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆植物。在一项优选实施例中，多聚核苷酸可以被操作连接到一个启动子上，优选是一个诱导启动子。
在另一项优选实施例中，本发明提供筛选编码具有ICE1转录激活剂活性的蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将本发明的多聚核苷酸与所要筛选的多聚核苷酸进行杂交，表达多聚核苷酸以产生蛋白质和测试蛋白质中ICE1转录激活剂活性存在与否。
在另一项优选实施例中，本发明提供一种方法，用于测试核酸具有与序列SEQ ID NO1至少70％同源性，其序列与序列SEQ ID NO1互补和/或编码带有序列SEQ ID NO2的氨基酸序列，包括用探针或引物接触核酸样品，探针或引物包括至少15个核苷酸序列SEQ ID NO1的连续的核苷酸，或至少15个连续的互补核苷酸。
在另一项优选实施例中，本发明提供一种方法，用于产生具有与本发明的多聚核苷酸至少70％同源性的核酸，包括用引物接触核酸样品，引物包括至少15个核苷酸序列SEQ ID NO1的连续的核苷酸，或至少15个连续的互补核苷酸。
在另一项优选实施例中，本发明提供一种制造ICE1蛋白质的方法，包括在一定时间内和适于ICE1表达的条件下，培养携带本发明多聚核苷酸的宿主细胞，以及收集ICE1。
在另一项优选实施例中，本发明提供一种制造转基因植物的方法，包括将本发明的多聚核苷酸引入到植物中。
在另一项优选实施例中，本发明提供一种增加所需植物冷适应力的方法，包括将将本发明的多聚核苷酸引入到所述植物中。
本发明的方法、载体和转化植物用的组合物以及植物细胞，对于本领域熟练的技术人员来说都是公知常识，并没有特殊限定。要更详尽了解，请参阅Karimiet al.，Trends in Plant Science，Vol.7，No5，May 2002，pp.193-195。
在另一项优选实施例中，本发明提供一个分离的多肽，包括序列SEQ IDNO2的氨基酸序列或那些至少70％，优选80％，优选90％和优选95％与序列SEQ ID NO2相同的蛋白质，其中，多肽具有ICE1转录激活剂活性。所以，酶具有与序列SEQ ID NO2从70％到小于100％的同源性。
在另一项优选实施例中，本发明还提供一个增加植物冷适应力的方法，包括在植物中过表达ICE1转录激活剂。
在另一项优选实施例中，本发明还提供通过增加一个或多个额外的从CBF转录因子和DREB1转录因子中选择的转录因子，和/或增加一个或多个冷-反应基因，来增强植物的冷适应力的方法。
在本发明的上下文中，术语“冷反应基因”包括编码从以下一组酶中选择出的蛋白质的基因，参与碳水化合物呼吸的酶、参与脂代谢的酶、参与苯丙素呼吸的酶、参与苯丙素代谢的酶、参与抗氧化物呼吸的酶、参与抗氧化物代谢的酶、陪伴分子、抗冻蛋白，以及参与由于冷冻导致脱水的耐脱水蛋白质。
本发明已经完成利用基因筛选识别CBF蛋白质冷信号元件上游。冷反应生物发光体拟南芥植物通过在CBF3启动子的控制下表达萤火虫荧光素酶(LUC)编码序列而改造。纯合CBF3-LUC植物是经过化学诱变处理和发光成像分离的、带有改变的冷诱导CBF3-LUC表达的突变体。在本发明中，发明人报道了ice1(inducer of CBF expression 1，CBF表达诱导剂)突变体，其在CBF3-LUC冷诱导下被削弱且在寒冷气候下不表达。ICE1编码似MYC碱性螺旋-环-螺旋激活剂，其结合到CBF3启动子上。所以，ICE1在调节拟南芥冷反应基因表达和寒冷耐受性方面起着关键的作用。
讨论寒冷的温度条件激发转录因子CBF家系的转录作用，其反过来激活含有DRE/DRT启动子元件基因的转录(Thomashow1999)。
CBF靶基因大概包括一些转录因子(Fowler和Thomashow 2002)。所以，用于抗冻的冷基因需要一个转录调节级联。在本研究当中，我们确定了ICE1，这个级联的一个非常上游的转录因子。我们的结果显示ICE1是CBF3的一个正调节剂在冷适应作用中起关键的作用。ICE1编码一个似MYC bHLH的转录因子。五个推定的MYC识别序列存在于CBF3启动子，而CBF1和CBF2启动子每一个含有这样的元件(Shinwari et al.1998)。这与CBF3要比CBF2或CBF1更强烈地被ice1突变所影响的事实是一致的。DNA结合试验表明ICE1在CBF3启动子上可以特意地结合到MYC识别序列，但不能结合到一个推定的MYB识别序列(图6)。ice1突变废除了CBF3的表达，并且减少了寒冷条件下CBF-靶基因的表达。与它在冷-反应基因调节作用的作用一致，ICE1对拟南芥植物的抗寒和耐冻是非常重要的。
ice1突变也影响CBF1和CBF2的冷诱导；它们的表达在最初的寒冷条件下被轻微地减小，但之后表达不被减小。相反的，CBF2的表达在冷处理6到12小时后在ice1突变体里事实上增强了。众所周知，CBF基因的表达被它们的基因产物或它们的下游靶基因所抑制(Guo et al.，2002)。减少了的CBF3的表达和增强了的CBF2的诱导之间的相关关系表明CBF3可以抑制CBF2的表达。当CBF2基因受到破坏，CBF1和CBF3在寒冷条件下显示了更稳定的诱导作用(Julio和Salinas，私人通信)，这表明CBF2会抑制CBF1和CBF3的表达。CBF转录因子基因之间潜在的相互的负调节为确保它们的表达是瞬时的和受到严格控制的是重要的。
三个CBF基因一般认为在功能上是重复的。它们各自的作用还没有用功能缺失分析来验证。即使ice1突变仅阻止CBF3的表达，那么下游基因如RD29A，COR15A和COR47也会受到根本的影响。这表明CBF3在这些基因的寒冷调节作用中起着关键的作用。相比较而言，KIN1的寒冷调节作用受ice1突变的影响较小。所以，三个CBF基因有它们各自一套优选靶基因是可能的。
ICE1在所有组织里是固有表达的(图5A和5B)，而且是被寒冷条件高调节的(图5C)。与对“ICE”蛋白质所推测的一致(Gilmour et al.，1998)，ICE1蛋白质或一个转录辅助因子的冷诱导的改变，对于ICE1激活CBFs的表达似乎是必要的。我们的证据支持这个观点。因为ICE1是固有表达的，并且位于细胞核中，但是CBF表达需要冷处理；并且固有过表达ICE1的转基因品系在温暖的条件下不显示CBF3的表达，但在寒冷条件下显示CBF3的较高的表达水平。转录因子激活基因转录的能力可以在细胞质或细胞核中经磷酸化或去磷酸化作用得以调节(参考Liu et al.，1999)。ice1突变离潜在的丝氨酸磷酸化作用残基(Ser243和Ser245)很近，可能影响ICE1的磷酸化作用和去磷酸化作用。
众所周知，与MYC-相关的bHLH转录因子需要MYB辅转录因子和或/含WD-重复因子用于靶基因的转录激活作用(Spelt et al.，2000；Walker et al.，1999)。CBFs启动子含有MYC以及潜在的MYB识别序列(Shinwari et al.，1998)，说明MYB相关的转录因子也参与CBFs的冷诱导。ice1突变，即组氨酸替代236位点的精氨酸，会干扰ICE1和似ICE1蛋白质或MYB相关的辅因子之间异源-寡聚物的形成。另外，推定的ice1的重要负作用是ice1干扰潜在的ICE1同源-寡聚物形成、蛋白质稳定性、细胞核定位，或ICE1冷诱导后翻译修饰的结果。
在大概地描述了本发明后，对其进一步的了解可以通过特定的实施例。这里所提供的实施例，是用来对本发明作解释而不是限定，除非特别指出。
实施例材料和方法植物材料和突变体分离作用CBF3启动子，即从起始密码子上游1126到100bp的一段区域，通过聚合酶链反应(PCR)获得，利用以下的引物对5′-TCATGGATCCACCATTTGTTAATGCATGATGG-3′(14号序列)和5′-GCTCAAGCTTTCTGTTCTAGTTCAGC-3′(15号序列)。这个启动子在植物转化载体中置于萤火虫荧光素酶(LUC)编码序列的前面(Ishitani et al.，1997)。用floral dipping方法，将带有CBF3-LUC构件的根瘤土壤杆菌来转化拟南芥Columbia生态型(带有平滑1型突变作用)。纯合CBF3-LUC转基因植物从转化作用之后的第二代选择。这样的带有一套CBF-3LUC转基因的植物被选出用来作以后的试验(之后这种植物称为野生型)。这个野生型植物在正常生长条件下不发出生物光，但施以冷处理后发光。CBF3-LUC植物种子用乙烯甲烷磺酸(EMS)进行诱变。突变2代(M2)的籽苗用荧光成像筛选冷调控CBF3-LUC表达中未表达出来的突变体。使用低光成像系统(Princeton Instruments)，用生长在含有3％蔗糖和1x Murashige和Skoog(MS)盐(JRH Biosciences)的0.6％的琼脂培养基上的7天龄籽苗，对0℃低温处理12小时的去调控荧光素酶表达进行筛选。每一个籽苗的发光强度，用摄像机生产商(Princeton Instruments)提供的WINVIEW软件进行定量分析(Chinnusamy et al.，2002)。
耐冷和耐冻试验当籽苗刚一露出根就将其进行冷处理，用来测试ice1和野生植物的寒冷敏感性。在4℃条件下经过2天成层，突变体和野生型种子在3％蔗糖和1.2％琼脂的MS营养介质和22℃条件下发芽。把籽苗置于4±1℃，在30±2μmol量子.m-2.s-1光下，进行冷处理培养。耐冻性试验如所述(Xin和Browse，1998)。简而言之，野生型和ice1种子置于Bamborg基盐和1.5％蔗糖的琼脂(0.9％)上培养。在4℃条件下经过2天成层，培养皿置于22℃，50±2μmol量子.m-2.s-1持续光照下。十天龄的籽苗经过4±1℃和30±2μmol量子.m-2.s-1进行4天的冷处理。培养皿上的这些植物被置于冷冻盒的冰上(Percival Scientific)，温度设置为-1±0.1℃，16个小时。在将冷冻盒以1℃h-1冷却之前，把冰屑撒在这些植物上。盛有植物的培养皿在设定的温度冷冻两个小时之后移走，除非特别指定，然后置于4℃下的黑暗中解冻12小时，然后转移到22℃，进行50±2μmol量子.m-2.s-1的持续光照。两天后计算籽苗的存活数。
基因表达分析用RNA进行分析，取一半10天龄生长在同样的MS琼脂培养基上的野生和ice1植物。从对照和处理的植物中提取的所有RNA用Liu和Zhu(1997)描述的方法进行RNA印迹法分析。RD29A特定基因探针从3′非编码区而来(Liu和Zhu，1997)。COR15A和COR47cDNAs(Gilmouret al.，1992；Lin和Thomashow 1992)由M.F. Thomashow(Michigan StateUniversity)提供。CBF2和CBF3特定基因探针由PCR产生，用以下引物对CBF2-正向引物，5′-TTCGATTTTTATTTCCATTTTTGG-3′(序列SEQ ID NO16)；CBF2-逆向引物，5′-CCAAACGTCCTTGAGTCTTGAT-3′(17号序列)；CBF3-正向引物，5′-TAAAACTCAGATTATTATTTCCATTT-3′(序列SEQ IDNO18)；CBF3-逆向引物，5′-GAGGAGCCACGTAGAGGGCC-3′(序列SEQ IDNO19)。KIN1的探针(Kurkela和Franck，1990)是拟南芥EST克隆YAP368T7的0.4-kb的EcoRI片段。β-微管蛋白基因作为填装对照并被PCR放大，用以下的引物对正向引物(5′-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3′(序列SEQ ID NO20))逆向引物(5′-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3′(序列SEQ ID NO21))。
为用于Affymetrix GeneChip排列分析，从经过或不经过冷处理(光照6个小时)的野生和ice1籽苗中，用Rneasy植物迷你试剂盒(Rneasy Plant MiniKit)(Qiagen)提取总共20μgRNA，所得RNA被用来制作生物素-标记的cRNA靶。含有超过22,500套探针，代表大约24,000个基因的Affymetrix拟南芥ATH1基因组排列GeneChips被使用，并且杂交、清洗和染色按照厂商使用手册进行。微阵列数据从扫描基因芯片(GeneChip)成象获得，并用微阵组5.0.1版(Affymetrix)进行分析。
ICE1基因作图和克隆ice1的F1和F2代与野生型杂交的遗传分析表明，ice1是一个显性突变。因而克隆ICE1，纯合ice1植物与拟南芥的Landsbergerecta(Ler)生态型杂交，以及F1自体授粉产生的F2代用来选择带有野生型显性性状的作图样品。从这些籽苗提取的基因组DNA用于以简单序列多态现象标记或者分裂的扩增的多态现象序列标记的基于PCR的作图。新的对F16J4，MTC11，MLJ15，MDJ14，K17E12和T32N15 BAC克隆的SSLP作图标记，基于从Cereon拟南芥多态现象和Ler序列收集(httpwww.arabidopsis.org)而来的插入/缺失而得以发展。相应于ice1突变体和野生型植物候选基因的基因组DNA通过PCR而扩增并测序来识别ice1突变。
对于ice1突变体互补，包括起始密码子2,583bp上游和终止密码子615bp下游的MLJ15.14基因，利用ice1突变体基因组DNA作为模板通过LA Taq聚合酶进行PCR扩增。所用的PCR引物如下正向引物5′-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGTAG-3′(序列SEQ IDNO22)；逆向引物5′-CGAATTCTAACCGCCATTAACTATGTCTCCTCTCTATCTC-3′(序列SEQ ID NO23)。所得5,035-bp片段末端加A克隆到T载体-Invitrogen TOPO载体，然后亚克隆到BamHI和EcoRI位点之间的载体pCAMBIA1200上。所描述的这个和其它的构件被完全测序以保证不含PCR或克隆错误。然后双元构件被引入到土壤杆菌品系GV3101并被转移到CBF3-LUC Columbia野生型植物。选择抗-潮霉素转基因植物并且它们的T2代用于测试CBF3-LUC对冷反应的表达。
ICE1表达分析ICE1基因的启动子区域(从起始密码子2,589bp上游)以以下的引物对进行PCR扩增正向引物5′-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGT-3′(序列SEQ ID NO24)；逆向引物5′-CGAATTCGCCAAAGTTGACACCTTTACCCCAAAG-3′(序列SEQID NO25)。所得片段被BamHI和EcoRI所分解并插pCAMBIA139双元载体。这个ICE1启动子-GUS构件被引入到土壤杆菌品系GV3101并被转移到野生型拟南芥。T2代抗潮霉素转基因品系被分析用于ICE1-启动子驱动GUS表达。对于GUS染色，生长与MS琼脂培养基上的T2代籽苗在37℃下用X-Gluc培养12小时，然后在70℃时用70％(v/v)乙醇清洗5次以清除叶绿素II。ICE1的表达也用从野生型的根、叶、茎和花制备的RNA的量化RT-PCR分析来测试。ICE1的cDNA通过RT-PCR利用以下引物正向引物5′-GCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列 SEQ ID NO26)；逆向引物5′-TCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQ ID NO27)。微管蛋白基因在RT-PCR分析中作为内对照。微管蛋白cDNA用下列的引物进行扩增正向引物5′-GTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3′(序列SEQ ID NO28)和逆向引物5′-TCACCTTCTTGATCCGCAGTT-3′(序列SEQ ID NO29)。
ICE1的过表达ICE1的cDNA用下列引物经过RT-PCR从拟南芥(Columbia生态型)的RNA被扩增正向引物5′-GCTCTAGAGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列SEQ IDNO30)和一个逆向引物5′-GGGGTACCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQID NO31)。PCR产物在超启动子的控制下被XbaI和KpnI所分解并克隆到pBIB载体。超启动子由三个位于甘露氨酸合成酶启动子(Li et al.，2001)前面的章鱼氨酸拷贝合成酶上游激活序列构成。包含这个双元构件的根瘤土壤杆菌品系GV3101用来转化拟南芥植物。转化体被选出在含有潮霉素(30mg/l_的MS培养基上生长。
GFP-ICE1融合蛋白质的表达和定位野生型的整个长度的ICE1 cDNA经RT-PCR使用以下的引物获得正向引物5′-AGGAATTCGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列SEQID NO32)；逆向引物5′-CTGGATCCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQ ID NO33)。所得PCR片段用EcoRI和BamHI分解并被克隆到从CaMV35S启动子而来的双元构件载体pEGAD下游。这个GFP-ICE1构件被引入到土壤杆菌品系GV3101并被转化到拟南芥植物。选择和分析抗Basta(glufosinate，草丙磷胺)的T2代转基因品系，用于GFP表达。为了看见细胞核，根细胞用碘化丙啶(1μg/mL)染色。转基因植物的绿色荧光(GFP表达)和红色荧光(碘化丙啶染色)分析，用共焦激光-扫描显微镜来进行。
DNA结合测试野生型和突变体ICE1 cDNA通过RT-PCR扩增并被插入到载体pET14b(Novagen)表达的NdeI和BamHI位点。按照His-Bind Buffer试剂盒(Novagen)说明书的指导，野生型和突变体His-ICE1融合蛋白从大肠杆菌(E.coli)细胞(BL21DE3)制备。电泳迁移率变动分析(EMSA)按照说明进行(Hao et al.，1998)。以下列于图6(MYC-1，MYC-2，MYC-3，MYC-4和MYC-5)的双股寡核苷酸在EMSA中作为探针和竞争剂。核苷酸序列P1(-949到-930)和P2(-909到-890)也作为竞争剂。P1含有推定的MYB-识别位点。P2不含有任何典型的顺式-元件。DNA探针末端用Klenow片段标记上[γ-32P]的dCTP并通过Sephadex G-50柱纯化。标记的探针(大约0.02pmol)在添加有20pmol聚乙烯(dI-dC)的2.3μg纯化的1X结合缓冲液中与His-ICE1融合蛋白一起在室温下培养20分钟。所得DNA-蛋白质复合体在0.5X缓冲液中的6％聚丙烯酰胺胶经电泳解离，并且经射线自显迹法显现。对于竞争试验，未标记的竞争剂在加入标记的探针之前与His-ECE1融合蛋白一同在冰上培养30分钟。
瞬时表达试验野生型(ICE1)和突变体(ice1)的cDNA经RT-PCR扩增和SalI分解，并且插入植物表达载体35S-GAL4DB的SmaI和SalI位点(Ohta et al.，2000)。所得效应剂质粒DNA，GAL4-ICE1和一个GAL4反应报道基因及GAL4-LUC(Ohta et al.，2000)用粒子辐射运送到拟南芥叶子里(Ohta et al.，2001)。
试验例ICE1位点识别用以上所述的基因筛选方法，含有CBF3-LUC转移基因的拟南芥植物在对寒冷作出反应时发出生物光(图1A和1B)。纯和CBF3-LUC植物(此处指野生型)用乙烯甲烷磺酸进行诱变，使用低光成像系统，用所得M2代在低温下的异常生物发光反应来筛选突变体(Chinnusamy et al.，2002)。几个表现出CBF3-LUC表达的非正常冷调控的突变体被发现。其中一个称为ice1的突变体在寒冷条件下的CBF3-LUC表达中被完全阻遏(图1A和1B)。在0℃处理的反应中，野生型发出强光，而ice1突变体在整个冷处理过程当中表现出非常弱的发光诱导(图1A和1B)。在冷处理12小时后，ice1植物要比野生型发光少将近10倍，并且在CBF3-LUC表达的冷调控中明显地不表达(图1B)。
ice1突变体植物与CBF3-LUC野生型杂交，所得F1代植物在12小时的0℃冷处理后，用来测试CBF3-LUC表达。经发光成像确定，所有的F1代植物都显现出减少了的冷诱导的CBF3-LUC表达，与ice1相似。由F1代自交产生的F2代在突变体和野生型之间出现了大约3比1的隔离。这些结果表明ice1在单核基因里是显性突变。
ice1突变体植物在冷调控基因表达是缺陷型运用RNA印迹分析来分析内生CBFs以及它们冷压力反应的靶基因在转录水平上的ice1突变的效果。与成像结果一致，内生CBF3基因的冷诱导在ice1突变体植物被极大地削弱(几乎彻底破坏)(图1C)。野生型植物在冷处理1小时后表现出了CBF3的诱导作用，6小时后达到高峰。相反，CBF3诱导在ice1突变体植物几乎完全被破坏(图1C)。当CBF1在1和3小时的冷处理后，在ice1突变体的诱导水平低于在野生型的水平，在经过6到12小时处理后，它的诱导水平相当于野生型的诱导水平。CBF2在1小时的冷处理后，在ice1突变体的诱导水平比较低，在经过6到12小时处理后，它的诱导水平在突变体里比较高(图1C)。我们也测试了CBFs下游靶基因的冷诱导作用。RD29A，COR15A和COR47A在寒冷压力下在ice1的表达水平低于在野生型的表达水平，而KINI在ice1的诱导作用只是在经过48小时的冷处理之后才表现比较低(图1C)。
与这些RNA印迹结果一致，微阵列分析使用Affymetrix几乎整个基因组的基因嵌片表明，在经过6小时的冷处理之后，在野生型有3倍或更多倍诱导的306个基因当中，217个在ice1突变体不被诱导或者比在野生型有少于50％或更少的诱导(表1A)。它们当中的32个基因编码推定的转录因子，表明ICE1可以控制许多冷反应调节子。306个冷诱导的基因当中的87个基因在野生型和ice1中的诱导水平的差别小于2倍(表1B)。有趣的是，有2个基因在ice1突变体中表现出了较高的冷诱导水平(表1C)。
表1.在野生型和ice1中冷反应的基因表达。
在冷处理时，野生型和ice1的籽苗在光下被置于0±1℃6个小时。Affymetrix基因芯片(Affymetrix GeneChip)分析按照材料与方法部分的说明进行。基因表达的变化通过对每一个基因型冷处理的样品与对照样品的比较数值进行分析。+1或-1的“倍数变化”值说明基因表达没有变化。正-调控或负-调控分别通过“倍数变化”数值的+或-来表达。在野生型的冷反应基因由以下标准来确定1)冷处理样品的信号强度要比本底大很多(即，在冷处理样品中由Affymetrix Microarray Suite Program确定的带有“存在”显示的基因)；2)由Affymetrix Microarray Suite Program产生的“变化”显示，在对对比较中是“I”(代表“增加”)；3)“倍数变化”在对对比较中是3倍或更高。所获得的306基因作进一步分析并与ice1突变体里的基因作对比。野生型和ice1之间的变化的两倍差别作为基因分类的极限值。转录因子用灰色方块表示。用于RNA杂交分析的基因以黑体表示。22个在冷处理ice1的倍数变化值没有确定(ND)，因为它们的信号强度与本底值相似(也就是说，在冷处理的ice1带有“缺席”calls的基因)。这22个基因都是在野生型被冷诱出来的。所以，它们属于在ice1比在野生型比较低的诱导作用的冷反应基因类。
表1A在ice1低诱导的冷反映基因探针 AGI序号 基因名称倍数变化野生型 ice1254074At4g25490CBF/DREB1B 445.7 64.0254066At4g25480CBF3/DREB1A 78.8 29.9258325At3g22830推定的热激转录因子 42.2 5.7246432At5g17490似RGA蛋白质 34.3 ND261648At1g27730耐盐锌指蛋白 24.3 6.5247655At5g59820锌指蛋白Zat1219.7 7.0248160At5g54470CONSTANS B-框锌指家系蛋白19.7 9.8250781At5g05410DRE结合蛋白(DREB2A) 14.9 4.925I745At3g55980锌指转录因子(PE11) 13.9 3.0258139At3g24520热激转录因子HSF1，推定的 13.9 3.7245711At5g04340推定的c2h2锌指转录因子 1.35.3245250At4g17490乙烯-反应元素结合因子6(AtERF6) 8.64.3252214At3g50260EREBP-3同系物8.62.1261613At1g49720脱落酸应答元件-结合因子 7.03.5245078At2g23340推定的AP2结构域转录因子 5.71.4263379At2g40140推定的CCCH-型锌指蛋白5.72.6253405At4g32800转录因子TINY，推定的 5.3ND245807At1g46768AP2结构域蛋白RAP2.1 4.91.9259432At1g01520myb家系转录因子 4.92.3252278At3g49530似NAC2蛋白 4.62.0
253485At4g31800WRKY家系转录因子4.6 -1.2251272At3g61890同源框-亮氨酸拉链蛋白ATHB-124.3 1.3261470At1g28370乙烯-反应元素结合因子11(AtERF11)4.3 1.7261892At1g80840WRKY家系转录因子4.3 1.2263783At2g46400WRKY家系转录因子4.3 1.4257022At3g19580锌指蛋白，推定的3.7 1.4267252At2g23100富CHP锌指蛋白，推定的 3.7 ND249746At5g24590似NAC2蛋白 3.5 1.6256093At1g20823推定的RING锌指蛋白 3.5 1.4252009At3g52800似锌指蛋白 3.2 1.3256185At1g51700Dof锌指蛋白 3.2 1.6260763At1g49220RING-H2指蛋白RHA3a，推定的 3.2 ND245749At1g51090富脯氨酸蛋白，推定的73.57.5264217At1g60190假设蛋白质 68.626.0246467At5g17040UDP葡萄糖似类黄酮3-氧-葡萄糖基转移酶蛋白质29.9ND251793At3g55580似染色体浓缩蛋白质调节剂27.96.1262452At1g11210表达的蛋白质27.97.0264661At1g09950假设的蛋白质27.9ND258947At3g01830表达的蛋白质26.02.5246178s At5g28430推定的蛋白质9.7 7.0253104At4g36010似奇异果甜蛋白 19.72.5257391At2g32050假设的蛋白质19.7ND245627At1g56600水压力诱导蛋白，推定的 18.4ND247208At5g64870似结瘤素18.41.2256114At1g16850表达的蛋白质18.42.6256356s At1g66500假设的蛋白质18.43.0250098At5g17350推定的蛋白质17.13.2264758At1g61340胚胎发生后期丰富蛋白质，推定的 17.15.3246099At5g20230蓝色结合铜蛋白 16.01.3257280At3g14440新黄质卵裂酶(NC1)(NCED1)，推定的16.01.0251336At3g61190推定的蛋白质13.93.0
260264At1g68500假设的蛋白质13.93.0263497At2g42540COR15a 13.93.5248337At5g52310RD29A/COR78/LT178 13.04.6248959At5g45630推定的蛋白质13.02.0259977At1g76590表达的蛋白质13.02.5260399At1g72520推定的脂肪氧化酶13.01.5259879At1g76650推定的钙调蛋白 12.12.8265290At2g22590推定的花色素-3-葡糖苷rhamnosyltransferase 12.1ND267411At2g34930抗病性蛋白质家系12.11.1250648At5g06760胚胎发生后期丰富似蛋白质LEA 11.31.9257876At3g17130假设蛋白质 11.32.3260727At1g48100多聚半乳糖醛酸酶，推定的11.32.3246125At5g19875表达的蛋白质10.62.0251603At3g57760推定的蛋白质10.61.1256017At1g19180表达的蛋白质10.61.5264617At2g17660未知蛋白质 10.6ND264787At2g17840推定的相关衰老蛋白质12 10.63.5245757At1g35140磷诱导(phi-1)蛋白，推定的 9.8 1.6252346At3g48650假设蛋白质 9.8 2.0253643At4g29780表达蛋白质 9.8 3.2254667At4g18280似富甘氨酸细胞壁蛋白质 9.8 1.2264389At1g11960未知蛋白9.8 1.7266545At2g35290假设蛋白质 9.8 1.4266720S At2g46790表达蛋白质 9.8 4.9245251At4g17615钙调磷酸酶似B蛋白1 9.2 3.0247431At5g62520推定的蛋白质9.2 1.5248964At5g45340细胞色素p450家系9.2 3.0252368At3g48520细胞色素p450，推定的9.2 1.3262164At1g78070表达蛋白质 9.2 4.3252102At3g50970dehydrin Xero2 8.6 4.0262359At1g73070富亮氨酸重复蛋白家系8.6 ND
262731At1g16420假定蛋白质总家系 8.62.8245677At1g56660假设蛋白质 8.02.8245734At1g73480溶血磷脂酶同系物，推定的 8.02.6247177At5g65300表达的蛋白质 8.03.7250053At5g17850似依赖钾钠-钙交换体蛋白质8.02.0254120At4g24570线粒体携带蛋白质家系 8.03.0254926At4g11280ACC合成酶(AtACS-6) 8.02.3263789At2g24560推定的GDSL基序脂酶/水解酶8.0ND245346At4g17090糖基水解酶家系14(β-淀粉酶) 7.52.6253425At4g32190推定的蛋白质 7.53.2254085At4g24960似脱落酸诱导蛋白质 7.52.3259076At3g02140表达的蛋白质 7.51.1260227At1g74450表达的蛋白质 7.52.0260915At1g02660表达的蛋白质 7.51.7262677At1g75860未知蛋白质 7.52.6266532At2g16890葡萄糖基转移酶 7.53.0247925At5g57560木葡聚糖内转糖基酶 7.02.1252563At3g45970推定的蛋白质 7.01.2254850At4g12000推定的蛋白质 7.02.3260744At1g15010表达的蛋白质 7.01.7263931At2g36220表达的蛋白质 7.03.0245306At4g14690表达的蛋白质 6.52.6246495At5g16200推定的蛋白质 6.51.7248870At5g46710推定的蛋白质 6.52.6253292At4g33985表达的蛋白质 6.52.0253872At4g27410推定的蛋白质 6.51.5258792At3g04640表达的蛋白质 6.53.0259516At1g20450表达的蛋白质 6.53.2262050At1g80130表达的蛋白质 6.51.2245427At4g17550推定的蛋白质 6.11.2253859At4g27657表达的蛋白质 6.1ND
261187At1g32860糖基水解酶家系17 6.11.4262448At1g49450似En/Spm转座子蛋白质，推定的 6.1ND266757At2g46940未知蛋白质6.11.3252131At3g50930似BCS1蛋白质的蛋白质 5.71.6255795At2g33380RD20蛋白质5.7-1.3258321At3g22840初期光诱导蛋白质 5.72.3262496At1g21790表达的蛋白质 5.72.0265119At1g62570含黄素的单氧酶，推定的5.72.0246018At5g10695表达的蛋白质 5.31.7248820At5g47060推定的蛋白质 5.31.7249918At5g19240推定的蛋白质 5.31.9253830At4g27652表达的蛋白质 5.31.7246490At5g15950S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 4.92.1253284At4g34150推定的蛋白质 4.91.9253323At4g33920推定的蛋白质 4.92.5253614At4g30350推定的蛋白质 4.91.5264655At1g09070表达的蛋白质 4.91.9245533At4g15130推定的胆碱磷酸胞嘧啶转移酶4.62.1246831At5g26340似己醣转运蛋白4.62.0247137At5g66210钙依赖蛋白激酶4.61.4247226At5g65100推定的蛋白质 4.6ND250467At5g10100似海藻糖-6-磷酸磷酸酶蛋白质 4.6ND252414At3g47420推定的蛋白质 4.61.9252997At4g38400推定的花粉过敏原 4.61.1253595At4g30830推定的蛋白质 4.6ND253832At4g27654表达的蛋白质 4.61.3258188At3g17800表达的蛋白质 4.61.4259479At1g19020表达的蛋白质 4.61.7261405At1g18740表达的蛋白质 4.62.0262881At1g64890表达的蛋白质 4.62.1264000At2g22500线粒体载体蛋白质家系 4.62.0
265668At2g32020推定的丙氨酸乙酰基转移酶4.62.3265797At2g35715表达的蛋白质4.6ND248686At5g48540似33kDa分泌蛋白质 4.31.6250676At5g06320似牵条诱导蛋白质4.31.6251259At3g62260蛋白质磷酸酶2C(PP2C)4.32.1254300At4g22780翻译因子EF-1似α蛋白质 4.31.1261356At1g79660未知蛋白质 4.31.6264636At1g65490表达的蛋白质4.31.4246468At5g17050UDP葡萄糖类黄酮3-氧-葡糖基转移酶 4.02.0248607At5g49480似NaCl诱导Ca2+结合蛋白质；似钙调蛋白 4.01.5250279At5g13200似ABA-反应蛋白质4.01.2252053At3g52400图触融合蛋白SYP122 4.01.9256633At3g28340未知蛋白质 4.02.0258207At3g14050推定的GTP焦磷酸激酶 4.01.7258805At3g04010糖基水解酶家系174.01.3261912s At1g66000假设蛋白质 4.0ND264989At1g27200表达的蛋白质4.01.6265276At2g28400假设蛋白质 4.0-1.1267261At2g23120表达的蛋白质4.01.7247693At5g59739推定的蛋白质3.71.9253113At4g35985推定的蛋白质3.71.4253165At4g35320推定的蛋白质3.71.9253879s At4g27570似UDP鼠李糖-花色素-3-糖苷鼠李糖苷转移酶蛋白质 3.71.2253915At4g27280推定的蛋白质3.71.9259426At1g01470假设蛋白3.71.6259445At1g02400加双氧酶3.71.9260410At1g69870推定的肽转移蛋白3.71.1261581At1g01140丝氨酸苏氨酸激酶，推定的3.71.5262113At1g02820后胚胎发育丰富蛋白质3.71.1262382At1g72920抗疾病蛋白(TIR-NBS类)，推定的 3.71.9265665At2g27420半胱氨酸蛋白酶 3.71.0
267069At2g41010未知蛋白质 3.71.2245450At4g16880似抗疾病RPP5蛋白质(片段)3.5ND246289At3g56880推定的蛋白质3.51.3249204At5g42570表达的蛋白质3.51.5249622At5g37550推定的蛋白质3.51.4250335At5g11650溶血磷脂酶 3.51.7251372At3g60520推定的蛋白质3.51.5254707At4g18010推定的蛋白质3.51.1257154At3g27210表达的蛋白质3.51.5259705At1g77450似GRAB1蛋白质 3.51.3261037At1g17420脂氧化酶3.51.2261937At1g22570肽转移蛋白，推定的 3.51.6264024At2g21180表达的蛋白质3.51.1264458At1g10410未知蛋白质 3.51.2266799At2g22860未知蛋白质 3.51.4247280At5g64260似phi-1蛋白质 3.21.6251356At3g61060推定的蛋白质3.21.5252316At3g48700推定的蛋白质3.21.3253824At4g27940推定的蛋白质3.21.1256526At1g66090抗疾病蛋白质(TIR-NBS类) 3.21.4256595x At3g28530假设蛋白质 3.21.1265648At2g27500糖基水解酶家系173.21.1266097At2g37970表达的蛋白质3.21.6267335s At2g19440糖基水解酶家系173.21.6245699At5g04250推定的蛋白质3.01.2247467aI At5g62130推定的蛋白质3.01.5249583At5g37770钙调蛋白相关蛋白质2，触诱导(TCH2) 3.01.1249626At5g37540推定的蛋白质3.01.2252474At3g46620推定的蛋白质3.01.3253628At4g30280木葡聚糖内转糖基酶 3.01.4253835At4g27820葡基水解酶家系 3.01.2
254158At4g24380推定的蛋白质 3.01.4254188At4g23920似UDP葡萄糖表异构酶蛋白 3.01.2254634At4g18650推定的蛋白质 3.0ND254973At4g10460推定的反转录转座子3.0ND256763At3g16860未知蛋白质3.01.0257519At3g01210含RRM的蛋白质 3.0-1.1258894At3g05650抗疾病蛋白质家系 3.01.4265841At2g35710推定的糖原生成起始蛋白3.01.5266271At2g29440推定的谷胱甘肽转移酶 3.01.2266316At2g27080表达的蛋白质 3.01.1267631At2g42150假设蛋白质3.01.1
表1B在野生型和ice1具相似诱导性的冷反应基因探针 AGI序号基因名称倍数变化野生型ice1254075At4g25470 CBF2/DREB1C 104.0 137.2261263At1g26790 Dof锌指蛋白 68.6 55.7257262At3g21890 CONSTANS B框锌指家系蛋白-7.5 5.3259834At1g69570 Dof锌指蛋白 7.05.7256430At3g11020 DREB2B 6.14.9248389At5g51990 DRE结合蛋白 5.34.0257053At3g25210 AtERF4 5.32.8248744At5g48250 CONSTANS B框锌指家系蛋白4.93.0249606At5g37260 CCA1.，推定的 4.99.2267028At2g38470 WRKY家系转录因子4.93.0246523At5g15850 CONSTANS-LIKE 14.0 3.2248799At5g47230 AtERF5 4.03.5247452At5g62430 Dof锌指蛋白 3.73.7251190At3g62690 RlNG-H2锌指蛋白ATL5 3.72.1253722At4g29190 锌指蛋白，推定的3.74.6259992At1g67970 推定的热击转录因子 3.72.3263252At2g31380 似CONSTANS B框锌指蛋白 3.73.7263739At2g21320 CONSTANS B框锌指家系蛋白3.72.3252429At3g47500 Dof锌指蛋白 3.54.3253140At4g35480 RING-H2指蛋白RHA3b 3.52.0258742At3g05800 bHLH蛋白质 3.56.5265939At2g19650 富CHP锌指蛋白 3.52.8249415At5g39660 Dof锌指蛋白 3.23.7259364At1g13260 DNA结合蛋白(RAV1) 3.22.1262590At1g15100 推定的RING-H2锌指蛋白 3.22.0263823s At2g40350 AP2域转录因子 3.05.7264511At1g09350 推定的肌醇半乳糖苷合成酶17.1 12.1264314At1g70420 表达的蛋白质13.0 9.8247478At5g62360 似DC1.2同源性蛋白质 11.3 11.3
253322At4g33980 推定的蛋白质 11.3 8.0249741At5g24470 推定的蛋白质 8.06.5247047At5g66650 推定的蛋白质 7.04.3263495At2g42530 COR15b 6.59.8265536At2g15880 未知蛋白质 6.55.3249174At5g42900 推定的蛋白质 6.13.5249191At5g42760 推定的蛋白质 6.14.3264153At1g65390 抗疾病蛋白(TIR类)，推定的 6.14.9250099At5g17300 表达的蛋白质 5.77.5265725At2g32030 推定的丙氨酸乙酰基转移酶 5.73.0246922At5g25110 似丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶蛋白质 4.94.9251494At3g59350 似蛋白激酶蛋白质 4.92.8246821At5g26920 结合钙调蛋白蛋白质 4.62.6255733At1g25400 表达的蛋白质 4.63.0257650At3g16800 蛋白质磷酸酶2C(PP2C) 4.62.5266832At2g30040 推定的蛋白激酶 4.62.8267357A2tg40000 推定的抗线虫蛋白质 4.63.7249411At5g40390 糖基水解酶家系36 4.33.5256266At3g12320 表达的蛋白质 4.34.0252956At4g38580 相关的铜分子伴侣(CCH) 4.02.3253455At4g32020 推定的蛋白质 4.02.6259570At1g20440 假设蛋白质 4.02.3262383At1g72940 抗病蛋白质(TIR-NBS类) 4.02.1247393At5g63130 未知蛋白质 3.73.2252661At3g44450 推定的蛋白质 3.72.5259990s At1g68050 F-框蛋白质FKF1/ADO3.AtFBX2a3.72.3264213At1g15400 假设蛋白质 3.72.0245777At1g73540 未知蛋白质 3.52.5248745At5g48260 未知蛋白质 3.52.5248846At5g46500 推定的蛋白质 3.52.6249063At5g44110 ABC转移蛋白家系蛋白质 3.52.1257654At3g13310 DonJ蛋白质，推定的 3.52.1
257925At3g23170 表达的蛋白质3.51.9261048At1g01420 黄酮醇3-氧-葡萄糖基转移酶 3.52.0263216s At1g30720 FAD-连接的氧化还原酶家系 3.52.3265184At1g23710 表达的蛋白质3.52.3245558At4g15430 假设蛋白质 3.23.5248164At5g54490 推定的蛋白质3.22.5248502At5g50450 推定的蛋白质3.24.3252010At3g52740 表达的蛋白质3.22.5253679At4g29610 胞苷脱氨酶6(CDA6) 3.22.0256548At3g14770 表达的蛋白质3.21.9256577At3g28220 未知蛋白质 3.22.3257083s At3g20590 非特定性抗疾病蛋白，推定的 3.22.3260046At1g73800 表达的蛋白质3.22.0261958At1g64500 肽转移蛋白 3.22.6263352At2g22080 似En/Spm转位子蛋白质3.21.9263452At2g22190 海藻糖-6-磷酸盐磷酸酶 3.22.3265093At1g03905 ABC转移蛋白家系蛋白质 3.21.7267293At2g23810 假设蛋白质 3.21.7245119At2g41640 表达的蛋白质3.02.6246270At4g36500 推定的蛋白质3.03.0247793At5g58650 推定的蛋白质3.01.7256442At3g10930 表达的蛋白质3.01.9256487At1g31540 抗疾病蛋白质(TIR-NBS-LRR类)，推定的 3.02.1259428At1g01560 MAP激酶 3.01.7266834s At2g30020 蛋白磷酸酶2C(PP2C) 3.02.6267364At2g40080 表达的蛋白质3.02.3Table 1C在ice1高诱导性冷反应基因探针 AGI序号基因名称倍数变化野生型ice1261248At1g20030 钙网蛋白 4.613.9258383At3g15440 假设蛋白质4.39.2
ice1突变削弱耐寒耐冻性在正常生长温度下，ice1和野生型籽苗大小相似(图2A)。虽然成体ice1植物比较小，但它们的开花期和生殖期与野生型差不多(图2B)。10天龄的ice1和野生型各占一半放在同一个琼脂培养皿内，在4℃下冷适应四天，然后作耐冻试验。在所有的冷冻处理过程中，ice1突变体的耐冻性比野生型的差(图2C和2D)。在2个小时的-10℃处理中，约50％的ice1突变体死亡，而野生型死亡不到20％(图2D)。当把新发芽的(22℃)ice1突变体和野生型籽苗转移到4℃条件下(30±2μmol quanta.m-2.s-1的光照)，经过四星期的冷处理，冻伤在突变体里变得很明显(图2E)。六个星期的冷处理之后，野生型100％存活，而icel突变体只有20％存活下来(图2F)。
ICE1的定位克隆为对ice1突变体作图，在CBF3-LUC Columbia本底的纯合ice1突变体与Ler生态型的野生型植物杂交。杂交F1代自交产生F2种子。因为ice1突变体是显性性状，我们从隔离F2代选择带有野生型性状(基于植物的大小和形态)的籽苗作图。一共选择662个野生型植物用来作图，利用简单序列长度多态现象和分裂的扩增的多态现象序列标记(具体参考材料与方法部分)，其最初把ice1放在3号染色体的中部，然后缩小其定位到MLJ15合MDJ14BAC克隆的58kb区域。这个区域的候选基因从纯合ice1突变体植物扩增并测序。将序列与发表的拟南芥序列作对比，发现假定的MLJ15.14基因有一个单一的G替换A的突变。
为了确定MLJ15.14就是ICE1基因，MLJ15.14基因，包括其上游的2，583bp的起始密码子和615bp下游的终止密码子，从ice1突变植物克隆出来。这个片段被插入到一个双元载体并通过土壤杆菌做媒介的转化作用导入到CBF3-LUC Columbia野生型植物。依据它们的抗潮霉素特性，选择转基因植物，以及将T2代品系冷诱导生物发光与野生型冷诱导生物发光进行比较。ice1的MLJ15.14基因抑制野生型的冷诱导发光(图3A和3B)并将植物高度减小到ice1突变体的高度。因而可以确定MLJ15.14就是ICE1。
ICE1编码一个组成型表达和核定位的似MYC的碱性螺旋-环-螺旋转录因子ICE1的阅读筐(SEQ ID NO1)通过对由RT-PCR获得的cDNA测序来决定。确定的阅读筐如下1 atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct61 ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaattc atgaaatcct cgtgattcta121 ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt181 tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac241 tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg301 ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa361 gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct421 atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta431 cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt541 cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt601 gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat661 gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt721 cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac781 agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc841 aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt901 ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag961 gtgttagcat cgtctggtgc acagcctact ctgttccaga aacgtgcagc tatgcgtcag1021 agctctggaa gcaaaatggg aaattcggag agttcgggaa tgaggaggtt tagtgatgat1081 ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata1141 aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag1201 aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat1261 aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata1321 cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat1381 gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg1441 acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta1501 ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg1561 aacattcata tgttctgtgg tcgtagaccg ggtctgttgc tcgctaccat gaaagctttg1621 gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg1681 gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa1741 gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag1801 tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt1861 tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa1921 tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa1981 cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtc t预测ICE1编码一个有494个氨基酸的蛋白质，预测的分子量是53.5kDa，序列如下(SEQ ID NO2)MGLDGNNGGGVWLNGGGGEREENEEGSWGRNQEDGSSQFKPMLEGDWFSSNQPHPQDLQMLQNQPDFRYFGGFPFNPNDNLLLQHSIDSSSSCSPSQAFSLDPSQQNQFLSTNNNKGCLLNVPSSANPFDNAFEFGSESGFLNQIHAPISMGFGSLTQLGNRDLSSVPDFLSARSLLAPESNNNNTMLCGGFTAPLELEGFGSPANGGFVGNRAKVLKPLEVLASSGAQPTLFQKRAAMRQSSGSKMGNSESSGMRRFSDDGDMDETGIEVSGLNYESDEINESGKAAESVQIGGGGKGKKKGMPAKNLMAERRRRKKLNDRLYMLRSVVPKJSKMDRASILGDAIDYLKELLQRINDLHNELESTPPGSLPPTSSSFHPLTPTPQTLSCRVKEELCPSSLPSPKGQQARVEVRLREGRAVNIHMFCGRRPGLLLATMKALDNLGLDVQQAVISCFNGFALDVFRAEQCQEGQEILPDQIKAVLFDTAGYAGMI
数据库检索表明ICE1在它的C末端一半处含有一个似MYC碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域(图4A和4B)。在整个蛋白质的长度上，ICE1显示出其氨基酸序列与一个拟南芥(Atlg12860)未知蛋白质序列相似。在这两种拟南芥蛋白质里是保守的，但在ice1突变中，Argg236变成His。ICE1的bHLH结构域对已知的MYC-相关的bHLH转录因子的氨基酸序列有很高的相似性(图4B)。所有的MYC结合启动子元件含有CA核苷酸，其被bHLH拉链结构域保守的谷氨酸所接触(Grandori et al.，2000)。这个谷氨酸残基(Glu312)在ICE1的碱性DNA结合域也是保守的(图4B)。靠近氨基端的酸性结构域以转录因子bHLH家系为特征，以及靠近羧基末端以保守的bHLH的DNA结合位点和二聚化结构域为特征(Purugganan和Wessler1994)。所有这些特征在ICE1蛋白质里存在(图4A)。
为分析ICE1在不同组织内的表达形式，表达IC1启动子-GUS转基因的转基因拟南芥植物的T2代被用来作分析。GUS的表达在根、叶、茎和花的部位都可测试到。半量化RT-PCR分析表明ICE1被组成型地表达，而且在叶和茎的表达比在其它的组织表达强(图5A和5B)。RNA印迹分析显示ICE1转录产物被寒冷、NaCl和ABA稍有正调控，但不被脱水正调控(图5C)。
为了测定ICE1蛋白质的亚细胞定位，将ICE1符合读框融合到绿色荧光蛋白质(GFP)的C-末端一侧，并且在CaMV35S启动子的控制下进行表达。T2转基因植物的GFP荧光共焦成像显示GFP-ICE1融合蛋白存在于细胞核中无论是在温暖或寒冷的条件下(图5D)。
ICE1在CBF3启动子结合MYC的识别位点ICE1有一个碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，而且它的氨基酸序列在碱性区域与其它bHLH蛋白质是高度保守的(图4B)，因此，可以识别与已知bHLH蛋白质DNA结合位点相似的启动子元件。这些蛋白质用契合序列CANNTG识别DNA(Meshi和Iwabuchi，1995)。在CBF3的启动子区域，转录起始位点的1kb区域上游内有五个潜在的MYC-识别元件(ShinWariet al.，1998)。这些可能的MYC-识别位点从MYC-1到MYC-5，分成四个组，因为MYC-3和MYC-5的契合序列是一样的，即，CATTTG(图6A)。因而，MYC-3可以用来代表MYC-3和MYC-5。为了确定在CBF3启动子内ICE1是否结合到这些MYC识别位点，我们将His-ICE1融合蛋白在大肠杆菌里进行表达和纯化。四个包含可能的每一个MYC结合位点的DNA片段用来在电泳迁移率变动分析(EMSA)中与His-ICE1相互作用。
当把ICE1与四个DNA片段(MYC-1到MYC-4)中的任意一个片段一起培养，可以观测到几个复合体。这表明ICE1是能够结合到这些序列上的(图6B)。MYC-2片段与ICE1形成一个主要复合体，而其它的DNA片段与ICE1形成几个复合体。这些复合体随着带有相同序列的冷竞争剂的增加而被破坏，但不被P1和P2所破坏，其分别含有一个推定的MYB识别点和一个非相关序列(图6B)。这项竞争特殊性更加强化了我们的假设，即DNA和ICE1之间的相互作用需要MYC识别序列。当MYC-2片段作为探针的时候，复合体被MYC-2竞正剂最有效地竞争掉。这说明ICE1在MYC-2位点比其它位点有更高的亲和力(图6C)。由ICE1和MYC-2片段形成的复合体受到突变体竞争剂的影响小于野生型(图6D)。总之，这些结果说明，ICE1在CBF3启动子里特有地与MYC识别位点相互作用。ice1突变体似乎不影响ICE1与CBF3启动子的相互作用，因为ICE1的Arg236变成His的突变形式也能结合到MYC-2探针上(图6E)。
ICE1是正调控CBF表达的转录激活剂利用瞬即表达试验来确定ICE1是否起转录激活剂或抑制剂的作用。通过将ICE1与酵母GAL4转录激活剂的DNA结合域融合，构建一个效应器质粒(GAL4-ICE1，图7A)。当把野生型的GAL4-ICE1和GAL4反应报道基因GAL4-LUC通过粒子轰击转移到拟南芥的叶子里时，不管是带有或不带有仅含有GAL4DNA结合域的效应器质粒，荧光素酶活性相对于对照增加了20倍(图7B)。ICE1的Arg236变成His的突变形式也激活GAL4反应的转录(图7B)。这些结果表明ICE1是一个转录激活剂，而且ice1突变不影响转录活性域的功能。
由T-DNA插入产生的无效等位基因不表现出任何ice1突变体的显性性状。这表明ICE1基因家系有功能丰余。我们使用强的组型超启动子在野生型拟南芥过表达ICE1。没有一个过表达品系显示出ice1突变体的表型。RNA印迹分析说明在温暖的条件下，ICE1-过表达不激活CBF3的表达。但是ICE1-过表达在寒冷条件下增进内生性CBF3基因以及CBF3-LUC报道基因的表达(图7C和图7D)。CBF2、RD29A和COR15A在超ICE1转基因植物的冷诱导也得到增强(图7C)。当把在同一个琼脂培养皿上的超ICE1转基因植物和野生型对照植物在4℃进行冷适应5天然后施以-8℃的冷冻处理4小时之后，ICE1过表达转基因籽苗表现了一个比对照植物(37.2±12.6％)高的存活率(75.9±6.5％)(图7E)。ICE1过表达转基因植物也没有表现出生长或发育异常。结果表明，ICE1是CBF3的正调控剂，并且ice1的显性性状有可能是突变作用的显性负作用引起的。
根据以上的说明，各种针对本发明的修饰和改动都是可能的。因而理解本发明在所附的权利要求书的范围内实施，除非特别指出外。
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权利要求
1.一个分离的多聚核苷酸，其编码含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质。
2.如权利要求1所述的分离的多聚核苷酸，其中所述的蛋白质具有ICE1转录激活剂的活性。
3.一个分离的多聚核苷酸，其含有序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
4.一个分离的多聚核苷酸，其与权利要求3的多聚核苷酸互补。
5.一个分离的多聚核苷酸，其与权利要求3的多聚核苷酸至少70％相同。
6.一个分离的多聚核苷酸，其与权利要求3的多聚核苷酸至少80％相同。
7.一个分离的多聚核苷酸，其与权利要求3的多聚核苷酸至少90％相同。
8.一个分离的多聚核苷酸，其在严格的条件下与权利要求3的多聚核苷酸杂交；其中所述的严格的条件包括在5X SSC，温度为55-68℃的条件下清洗。
9.如权利要求3所述的分离的多聚核苷酸，其编码具有ICE1转录激活剂活性的蛋白质。
10.一个载体，含有权利要求1所述的分离的多聚核苷酸。
11.一个载体，含有权利要求3所述的分离的多聚核苷酸。
12.一个宿主细胞，含有权利要求1所述的分离的多聚核苷酸。
13.一个宿主细胞，含有权利要求3所述的分离的多聚核苷酸。
14.一个植物细胞，含有权利要求1所述的分离的多聚核苷酸。
15.一个植物细胞，含有权利要求3所述的分离的多聚核苷酸。
16.一个转基因植物，含有权利要求1所述的分离的多聚核苷酸。
17.一个转基因植物，含有权利要求3所述的分离的多聚核苷酸。
18.如权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物是拟南芥。
19.如权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物是拟南芥。
20.如权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物是从以下一组植物中选择，小麦，玉米，花生，棉花，燕麦和大豆。
21.如权利要求16所述的转基因植物，其中分离的多聚核苷酸操作连接到诱导启动子上。
22.如权利要求17所述的转基因植物，其中分离的多聚核苷酸操作连接到诱导启动子上。
23.一种筛选编码具有ICE1转录激活剂活性蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求1的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸进行杂交；表达多聚核苷酸生产蛋白质；以及检测所述蛋白质是否具有ICE1转录激活剂活性。
24.一种筛选编码具有ICE1转录激活剂活性蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求3的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸进行杂交；表达多聚核苷酸生产蛋白质；以及检测所述蛋白质是否具有ICE1转录激活剂活性。
25.一种筛选编码具有ICE1转录激活剂活性蛋白质的多聚核苷酸的方法，包括将权利要求8的分离的多聚核苷酸与要筛选的多聚核苷酸进行杂交；表达多聚核苷酸生产蛋白质；以及检测所述蛋白质是否具有ICE1转录激活剂活性。
26.一种检测具有与权利要求1的核苷酸至少70％同源性的核酸的方法，包括用含有权利要求1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或其互补链至少15个连续核苷酸的探针或引物接触核酸样品。
27.一种生产具有与权利要求1的核苷酸至少70％同源性的核酸的方法，包括用含有权利要求1核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或其互补链的至少15个连续核苷酸的探针接触核酸样品。
28.一种检测权利要求3的核苷酸的方法，包括用含有权利要求3核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或其互补链的至少15个连续核苷酸的探针或引物接触核酸样品。
29.一种生产权利要求3的核苷酸的方法，包括用含有权利要求3核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或其互补链的至少15个连续核苷酸的探针接触核酸样品。
30.一种制造ICE1蛋白质的方法，包括将权利要求12的宿主细胞在适合于ICE1表达的条件下培养一定时间，并收集ICE1蛋白质。
31.一种制造ICE1的方法，包括将权利要求13的宿主细胞在适合于ICE1表的的条件下培养一定时间，并收集ICE1蛋白质。
32.一种制造转基因植物的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸引入植物。
33.一种制造转基因植物的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸引入植物。
34.一种增强所需植物冷适应力的方法，包括将权利要求1的多聚核苷酸引入到所述植物里。
35.一种增强所需植物冷适应力的方法，包括将权利要求3的多聚核苷酸引入到所述植物里。
36.一种增强所需植物冷适应力的方法，包括增强ice1基因在所述植物中的表达。
37.一个分离的多肽，含有序列SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
38.如权利要求37所述的分离的多肽，具有ICE1转录激活剂活性。
39.一个分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少70％相同，并且具有ICE1转录激活剂活性。
40.一个分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少80％相同，并且具有ICE1转录激活剂活性。
41.一个分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少90％相同，并且具有ICE1转录激活剂活性。
42.一个分离的多肽，其与权利要求37的分离的多肽至少95％相同，并且具有ICE1转录激活剂活性。
43.一种增强植物冷适应力的方法，包括ICE1转录激活剂在植物中的过表达。
44.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
45.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂被具有序列SEQID NO1的核酸所编码。
46.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂被具有与序列SEQ ID NO1 70％相同的核酸编码。
47.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂被具有与序列SEQ ID NO1 90％相同的核酸编码。
48.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂被在严格的条件下与序列SEQ ID NO1互补链杂交的核酸所编码，其中所述的严格的条件包括在5X SSC，温度为55-68℃的条件下清洗。
49.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸的序列与序列SEQ ID NO2具有80％的同源性。
50.如权利要求43所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸的序列与序列SEQ ID NO2具有90％的同源性。
51.如权利要求43所述的方法，其中植物为拟南芥。
52.如权利要求43所述的方法，其中植物选自小麦，玉米，花生，棉花，燕麦和大豆。
53.如权利要求43所述的方法，其中植物有从CBF转录因子和DREB1转录因子中选择的一个或多个转录因子的增加的表达。
54.如权利要求43所述的方法，其中植物有一个或多个冷反应基因的增加的表达。
55.如权利要求54所述的方法，其中冷反应基因编码一种蛋白质，其选自参与碳水化合物呼吸的酶，参与碳水化合物代谢的酶，参与脂呼吸的酶，参与脂代谢的酶，参与苯丙素呼吸的酶，参与苯丙素代谢的酶，参与抗氧化物呼吸的酶，参与抗氧化物代谢的酶，分子陪伴蛋白质，抗冻蛋白，以及参与由于冷冻引起的脱水耐受性的蛋白质。
56.如权利要求43所述的方法，其中植物用一个编码ICE1转录激活剂的载体转化。
57.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
58.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂被序列SEQ IDNO1的核酸编码。
59.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂被与序列SEQID NO1 70％相同的核酸编码。
60.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂被与序列SEQID NO1 90％相同的核酸编码。
61.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂被在严格的条件下与序列SEQ ID NO1的互补链进行杂交的核酸编码，其中所述的严格的条件包括在5X SSC，温度为55-68℃的条件下清洗。
62.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸序列与序列SEQ ID NO2有至少80％的同源性。
63.如权利要求56所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸序列与序列SEQ ID NO2有至少90％的同源性。
64.如权利要求56所述的方法，其中植物是拟南芥。
65.如权利要求56所述的方法，其中植物选自小麦，玉米，花生，棉花，燕麦和大豆。
66.如权利要求56所述的方法，其中植物有从CBF转录因子和DREB1转录因子中选择的一个或多个转录因子的增加的表达。
67.如权利要求56所述的方法，其中植物有一个或多个冷反应基因的增加的表达。
68.如权利要求67所述的方法，其中冷反应基因编码一种蛋白质，其选自参与碳水化合物的呼吸的酶，参与碳水化合物代谢的酶，参与脂呼吸的酶，参与脂代谢的酶，参与苯丙素呼吸的酶，参与苯丙素代谢的酶，参与抗氧化物呼吸的酶，参与抗氧化物代谢的酶，分子陪伴蛋白质，抗冻蛋白，以及参与由于冷冻引起的脱水耐受性的蛋白质。
69.一种增强植物中一个或多个冷反应基因表达的方法，包括用一个编码ICE1转录激活剂的载体转化植物。
70.如权利要求69所述的方法，其中植物具有增强了的冷适应性。
71.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
72.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂被序列SEQ IDNO1的核酸编码。
73.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂被与序列SEQID NO1 70％相同的核酸编码。
74.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂被与序列SEQID NO1 90％相同的核酸编码。
75.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂被在严格的条件下与序列SEQ ID NO1的互补链进行杂交的核酸编码，其中所述的严格的条件包括在5X SSC，温度为55-68℃的条件下清洗。
76.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸序列与序列SEQ ID NO2至少有80％的同源性。
77.如权利要求69所述的方法，其中ICE1转录激活剂的氨基酸序列与序列SEQ ID NO2至少有90％的同源性。
78.如权利要求69所述的方法，其中植物是拟南芥。
79.如权利要求69所述的方法，其中植物选自小麦，玉米，花生，棉花，燕麦和大豆。
80.一个表达盒，包括在植物细胞中的功能性启动子，可操作连于编码序列SEQ ID NO2 ICE1蛋白质的分离的核酸，其中植物细胞中增强的蛋白质的表达增强了所述植物细胞的冷适应力。
81.如权利要求80所述的表达盒，其中启动子选自病毒外套蛋白质启动子、特定组织启动子、单子叶植物启动子、泛蛋白启动子、压力诱导启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合成启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、西红柿E8启动子、patatin启动子、甘露氨酸合成酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养贮存蛋白质启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导以及细胞膨胀—诱导启动子。
全文摘要
本发明提供用来改进植物冷适应力的方法和组合物。更确切地说，本发明利用ICE1在植物和植物细胞中的过表达。
文档编号C07K14/415GK1649483SQ03809834
公开日2005年8月3日 申请日期2003年5月1日 优先权日2002年5月1日
发明者朱健康, 维斯瓦纳坦·钦努撒麦, 太田贤, 西达尔塔·坎雷尔, 李炳贺, 马努·阿加瓦尔 申请人:美国亚利桑那大学董事会