与癌症干细胞相关的方法和组合物的制作方法

专利名称：与癌症干细胞相关的方法和组合物的制作方法
与癌症干细胞相关的方法和组合物政府权利本发明在NIH国立癌症研究(NIH National Cancer Institute)所授予合同 CA104987的政府支持下取得。政府对本发明享有一定权利。
背景技术：
乳腺癌是美国妇女中最常见的恶性肿瘤。虽然目前可采用的治疗法能缩小转移， 但这些作用是暂时的，绝大多数4期乳腺癌患者死于转移。包括放疗、化疗和激素治疗在内 的传统治疗方法虽有用，但出现了对治疗有耐受性的癌细胞使其受限。需要新的方法来检 测和治疗乳腺癌。与许多其它类型实体瘤相似，死亡率的主要原因是癌症从原发部位扩散至远端器 官和组织。这是癌细胞从初始肿瘤入侵周围乳腺组织以及淋巴组织和血管所致。入侵的癌 细胞然后形成新肿瘤，最终损伤了癌症所扩散的关键器官，例如肝、肺或脑的功能，最终导 致患者死亡。由于乳腺癌死亡率的主要原因是癌症播散至其它器官，为改善存活必须既要 防止肿瘤细胞扩散又需根除远端肿瘤。肿瘤可视作通过突变积累而获得无限增殖能力的致瘤性癌细胞所产生的异常器 官。在将肿瘤视作异常器官的此种观点中，应用正常干细胞的生物学原理可更好地理解肿 瘤如何产生和播散。许多观察提示正常干细胞与致瘤性细胞之间有相似性是合适的。正常 干细胞和致瘤性细胞均具有广泛的增殖潜力以及产生新(正常或异常)组织的能力。致瘤 性细胞可视作经历器官发生异常和不佳调控过程的癌症干细胞(CSC)，与正常干细胞的经 历相似。肿瘤和正常组织均由表型特征不同和增殖潜力不同的异质细胞组合构成。发现急性髓性白血病中只有一个小亚组的癌细胞有引发肿瘤的潜能和维持自我 更新的能力。由于白血病细胞中集落生成的差异反映了正常造血细胞中集落生成的差异， 故可将集落生成性白血病细胞描述为白血病干细胞。实体瘤还显示细胞表型为异质性，只 有少部分细胞有致瘤性能在体内自我更新。与白血病干细胞的情况一样，这些观察导致上 皮肿瘤中只存在稀少干细胞这一假设。还可根据细胞表达的表面标记分离致瘤性和非致瘤性乳腺癌细胞群。在许多乳腺 癌病例中，只有一个小细胞亚群能形成新肿瘤。许多患者的乳腺癌肿瘤含有能在免疫缺陷 小鼠中形成肿瘤的癌细胞亚群，而其它癌细胞则不能。注射免疫缺陷小鼠时，最少100个致 瘤性癌细胞即能形成肿瘤，所产生的肿瘤含有在患者的原始肿瘤中发现的表型异质的致瘤 性和非致瘤性癌细胞群。在中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤中发现了实体瘤中存在CSC的进一步证据。采用 类似于培养正常神经元干细胞所用的培养技术，已证明神经元CNS恶性肿瘤含有一小群在 体外具有集落生成活性在体内能引发肿瘤的癌细胞，而肿瘤中的其余细胞没有这些特性。 重要的是，干细胞生物学的原理极其适用于理解乳腺癌肿瘤生物学。癌症干细胞的存在对癌症治疗有深远影响。目前，对肿瘤中表型相异癌细胞的所 有治疗仿佛将它们看成均具有无限增殖潜力和获得转移的能力。然而，多年来已认识到，在 从未表现出转移性疾病的患者中距原发性肿瘤远处部位可检测到少量播散的癌细胞。一种
4可能性是大多数癌细胞缺乏形成新肿瘤的能力，因此只有稀少癌症干细胞的播散才能导致 转移性疾病。因此，治疗的目的必须是鉴定和杀伤此类癌症干细胞群。已开发的现有疗法很大程度上是针对肿瘤细胞大群(bulk population)，因为是 通过能否缩小肿瘤块来鉴定这些疗法。然而，由于癌症的大多数细胞增殖潜力有限，能否缩 小肿瘤主要反映了能否杀伤这些细胞。专门针对癌症干细胞的治疗可能产生更持久的反应 并治愈转移性肿瘤。MiRNA是小的非编码调节性RNA，通过抑制核糖体功能、使5’帽结构脱帽、使多聚 腺苷酸尾脱腺苷化和降解靶mRNA而调节mRNA翻译。MiRNA能同时调节数百种mRNA的表达， 因此能调控各种细胞功能，包括细胞增殖、干细胞维持和分化。已充分研究的miRNA之一为 秀丽线虫(Caenorhabditiselegan)let-7，最初是通过遗传分析发育期缺陷的突变体得以 鉴定。随后，将Dicer 1鉴定为miRNA加工和功能中的关键酶；Dicer 1无效突变可导致胚胎 死亡和干细胞消除。此外，组织特异性缺失Dicer会影响到胚胎干细胞的自我更新，B淋巴 细胞谱系细胞的发育和组织形态发生。在皮肤中，miR-203对发育至关重要。缺失miRNA 加工的另一种关键酶DGCR8也会改变胚胎干细胞分化中自我更新基因的沉默。这些发现证 明miRNA是组织维持和分化的关键调节剂。近年研究显示，癌症中所见的许多共同染色体 扩增和缺失含有miRNA编码序列，一些miRNA起着癌基因或肿瘤抑制基因的作用。例如， miR-17-92簇失调可诱生B-细胞淋巴瘤，let-7下调与肺癌患者的肿瘤发展和预后差相关。 在体内异种移植肿瘤试验中，表达let-7也能防止乳腺细胞系形成肿瘤球(tumorsphere) 和抑制其致瘤性。本发明涉及检测和操纵癌症干细胞的微小RNA。预计若能够鉴定干细胞丰富的细 胞群，将得以研究这些细胞，从而获得关键的干细胞功能分子调节剂线索。癌症干细胞的描述，例如可参见Pardal等，(2003)Nat Rev Cancer 3,895-902 ； Reya 等，(2001)Nature 414，105-11 ;Bonnet 和 Dick(1997)Nat Med3，730-7 ;Al_Hajj 等， (2003)Proc Natl Acad Sci U S A 100，3983-8 ;Dontu 等，(2004)Breast Cancer Res 6， R605-15 ;Singh 等，(2004)Nature 432,396-401。发明概述本文提供了乳腺癌干细胞(BCSC)的微小RNA标记。与正常对应细胞相比和与腺 癌中发现的非致瘤性细胞相比，这些标记是在BCSC中差别表达的多核苷酸。采用此类标记 物包括将其用作治疗性干预的靶标；药物开发的靶标和涉及乳腺癌和BCSC细胞群的诊断 或预后方法。本发明的一些实施方式提供治疗乳腺癌的方法，该方法包括提供微小RNA活性， 例如通过引入表达载体或向BCSC直接提供微小RNA。在本文中，用于上调的感兴趣微小 RNA 显示在 BCSC 中下调，包括但不限于 200c-141 簇(miR200c,miR141) ；200b-200a_429 簇 (miR200b, miR200a, miR429)；和 182-96-183 簇(miR182, miR96, miR183)中的微小 RNA。其它实施方式提供治疗乳腺癌的方法，该方法中下调微小RNA的表达。用于下 的调感兴趣微小 RNA 包括但不限于miR214 ；miR-127 ；miR142_3p ；miR-199a ；miRl_125b ； miR-146b ；miR199b 和 miR-222。本发明的一些实施方式提供癌症分类或临床分期的方法，其中BCSC数量越多表 明癌症表型的侵袭性更强。分期可用于预后和治疗。在本发明的一些实施方式中，用包括免疫组化方法、原位杂交等组织化学方法分析肿瘤样品中是否存在本文鉴定的miRNA表达降 低细胞。存在此类细胞表明存在BCSC，从而能明确原发肿瘤中的BCSC微域(microdomain) 以及淋巴结或远端转移灶中的细胞。通过BSCS的独特表型鉴定它们从而提供比常规治疗 更有特异性的靶标。此外，实施本发明的一种方式还提供预测疾病发展、复发和产生药物耐 受性的方法。在本发明的另一实施方式中，miRNA或它们的靶标可用于，例如能增加此类miRNA 在癌症干细胞中表达或降低它们的靶蛋白表达的化合物的筛选方法。该方法包括混合该化 合物与miRNA表达低的细胞群，然后测定该化合物产生的调节作用。这可包括检测细胞活 性，或检测某些靶蛋白质、活力、毒性、代谢变化或对细胞功能的影响。还提供给予治疗剂的 方法，所述治疗剂靶向与本文所述miRNA的功能相关的癌症干细胞。附图简述

图1.人乳腺癌干细胞miRNA表达概况(A)乳腺癌miRNA筛选。显示了用于鉴定 CD44+CD24_/<S谱系_致瘤性癌细胞(TG细胞)和其余谱系-非致瘤性癌细胞(NTG细胞)差 别表达的37种miRNA的筛选细节。(B)致瘤性人乳腺癌细胞中37种miRNA的表达概况。 采用流式细胞术分离11份人乳腺癌样品(BC1-BC11)中的TG细胞和NTG细胞。用多重定 量实时PCR分析100个分选癌细胞中的miRNA表达量(Ct值)。数值代表从TG细胞和NTG 细胞获得的Ct值的差别(ACt)。(C)在致瘤性人乳腺癌细胞中下调的3种miRNA簇的示意 图。具有相同种子序列(seed sequence) (2-7个碱基对)的miRNA用同一颜色标注。(D) 与人乳腺癌细胞相比，Tera-2胚胎癌细胞中的miRNA表达。用多重定量实时PCR比较100 个Tera-2细胞中miRNA表达的强度与100个人乳腺癌TG和NTG细胞(BC1-BC11)中miRNA 表达。对11组乳腺癌TG和NTG细胞的Ct值取平均值。数值表示为从Tera-2细胞获得的 Ct值与NTG细胞相比的差别(A Ct)。图2.正常和恶性乳腺干细胞之间共有的miRNA下调概况。㈧， ⑶45TD31TD140a-Terll9-小鼠乳腺细胞依据它们⑶24和⑶49f表达的分布情况。MRU是 富含乳腺干细胞的细胞群。MaCFC是在体内不能再生乳腺的祖细胞。⑶与MaCFC相比，MRU 中miRNA的表达。分析了用流式细胞术分离正常小鼠乳房脂肪垫的MRU和MaCFC中，致瘤 性人乳腺癌细胞的miRNA表达下调。用定量实时PCR检测了 100个MRU和MaCFC中miRNA 的表达水平。采用衍生自独立分离的MRU和MaCFC细胞群两组样品重复分析两次。数值代 表从MRU和MaCFC获得的Ct值的差别。图 3. MiR-200c 的靶标 S0X2。(A) S0X2 的 3，UTR 内 miR_200bc/429 靶序列的示意 图。在S0X2的3，UTR中有两个核苷酸(对应于miR-200bc/429的核苷酸6和8)发生突 变。数字表示参比野生型序列(匪003106)中该核苷酸的位置。(B)与S0X2的3，UTR相 连的萤光素酶基因的活性。将含S0X2野生型或突变型3’UTR序列的pGL3萤火虫萤光素酶 报道基因质粒与用于标准化的Renilla萤光素酶报道基因一起瞬时转染入HEK293T细胞。 48小时后检测萤光素酶活性。将pGL3对照载体转染细胞结果的平均值设为100%。数据 是分别不同转染(n = 4)的平均值和S. D.。(C)胚胎癌细胞的S0X2蛋白表达。感染6天 后用流式细胞术收集被表达所示miRNA慢病毒感染的Tera-2胚胎癌细胞。将被对照慢病 毒或被表达所示miRNA慢病毒感染的30，000个分选Tera-2细胞的裂解液加载于各泳道， 用蛋白质印迹分析S0X2表达。用肌动蛋白的表达作为对照。(D)从原代人乳腺癌样品分离的TG和NTG癌细胞中S0X2蛋白的差别表达。解离原代人乳腺癌样品，通过流式细胞 术收集CD44+CD24" 谱系_致瘤性癌细胞和其余非致瘤性谱系-癌细胞。将6，000个分选 细胞的裂解液加载于各泳道，用蛋白质印迹分析S0X2表达。用肌动蛋白的表达作为对 照。图4. miR-200c和miR-183抑制胚胎癌细胞的生长。(A)表达miRNA的胚胎癌细胞 的图像。感染4天后，用流式细胞术收集被表达所示miRNA慢病毒感染的Tera-2细胞。收集 Tera-2细胞19天，用姬姆萨怀特(Giemsa Wright)染色液染色。(B)miR_200c和miR-183 增强了胚胎癌细胞的分化。用针对早期有丝分裂后神经元标记Tuj 1的第一抗体，然后用 Alexa-488标记的第二抗体染色如(A)所述被感染和收集的Tera-2细胞。用DAPI复染细 胞。(C)miR-200c和miR-183抑制了体外胚胎癌细胞的生长。如(A)所述收集表达对照 miRNA或所示miRNA的3000个Tera_2细胞在96-孔板中培养。计数7、12和19天时的细 胞总数。结果为3个独立孔的平均值和S. D.。图5. miR-200c和miR-183对MMTV-Wnt_l鼠乳腺癌细胞集落生成的影响。(A)表 达miR-200c和miR-183的MMTV-Wnt_l乳腺癌细胞形成集落的发生率。解离MMTV-Wnt_l乳 腺癌细胞，用流式细胞术去除谱系阳性细胞。用表达所示miRNA的慢病毒感染15，000个乳 腺癌细胞，在含经辐照的3T3饲养细胞层的24-孔板中培养。培育6天后，计数含10个以上 GFP阳性细胞的集落数。结果显示为4个独立孔的平均值和S. D.。(B)用细胞角蛋白14、 19和8/19的抗体染色集落的免疫荧光图像。用抗细胞角蛋白第一抗体，然后用Alexa-488 和Alexa-594标记的第二抗体，标记和染色GFP阳性集落。用DAPI复染细胞。图6.体内表达miR-200c和miR-183的胚胎癌细胞的肿瘤生长。(A)注射了 Tera_2 胚胎癌细胞小鼠中的代表性肿瘤。用流式细胞术收集被表达所示miRNA慢病毒感染的 Tera-2细胞和表达GFP的细胞。将被所示慢病毒感染的50，000个GFP+Tera-2细胞皮下注 射入免疫缺陷N0D/SCID小鼠中。注射后监测肿瘤生长3个月。通过实时PCR分析证实被感 染的Tera-2细胞表达了 miRNA。(B)表达miRNA的Tera-2细胞的肿瘤发生率。3个月后， 3个被对照慢病毒感染的Tera-2细胞均产生了肿瘤。表达miR-200c或miR-183的Tera-2 细胞不形成肿瘤。结果是3次独立肿瘤注射实验的小结。图7. miRNA表达对乳腺过度生长(mammary outgrowth)的作用。实施方式详述在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于以下所述的本发明具体实施方 式，可对具体实施方式
作出某些改变但而仍属于本发明权利要求的范围内。还应理解所用 术语目的是描述特定的实施方式，并非限制。本发明的范围是由所附权利要求书所确定。除 非文中另有明确表述，本说明书和随附的权利要求书中，单数形式“一”、“一个”和“该”包 括复数形式。提供数值范围时，除非文中另有明确说明，应理解该范围上限和下限之间的各插 入值(至下限的十分之一单位)和所述范围内的任何其它所述值或插入值都包括在本发明 中。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在该较小范围内，也包括在本发明中，包括所 述范围中任何专门排除的界限。当所述范围包括上限和下限之一或二者时，不包括所述上 限或下限之一或二者的范围也包括在本发明中。除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然可采用与本文所述相似或等价的方法、装置和材料来实施或检 验本发明，但是本文描述的是优选的方法、装置和材料。本文述及的所有出版物通过引用纳入本文，目的是描述和公开这些出版物中所述 的本发明组分，这些组分可与当前描述的本发明联用。如上所述，本发明涉及癌症分类的方法以及用于实施本发明方法的试剂和试剂 盒。所述方法也可测定治疗具体癌症的合适水平。还提供了优化治疗的方法，先分类，根据分类信息选择合适的疗法、剂量、治疗方 式等，从而优化将抗增殖治疗递送给不需要的靶细胞之间的差异，同时最大程度降低有害 毒性。通过选择最大程度降低有害毒性同时提供有效的抗增殖活性而优化治疗。本发明可用于癌症，例如乳腺癌的预防、治疗、检测或研究。癌症是包含上皮来 源赘生细胞的癌症。上皮细胞覆盖了机体外表面，形成内腔和腺体组织的衬里。在成人 中，癌症是最常见的癌形式。癌症包括各种腺癌，例如前列腺癌、肺癌等等；肾上腺皮质癌 (adernocartical carcinoma)；肝细胞癌；肾细胞癌、卵巢癌、原位癌、导管癌、乳腺癌、基底 细胞癌；鳞状细胞癌；移行细胞癌；结肠癌；鼻咽癌；多房囊性肾细胞癌；燕麦细胞癌、大细 胞肺癌；小细胞肺癌等等。癌症可见于前列腺、胰腺、结肠、脑(通常作为继发性转移)、肺、 乳腺、皮肤等等。本领域已描述了癌干细胞的某些表型属性，包括诸如⑶44、⑶133、⑶24、⑶49f ； ESA;⑶166和谱系组(lineage panel)等标记。具体标记组合和表型的例子描述可参见， 例如 Al-Hajj 等 (2003) Prospective identification oftumorigenie breast cancer cells (致瘤性乳腺癌细胞的预期鉴定).Proc NatlAcad Sci U S A 100,3983-8 ；Singh 等 (2004) Identification of human braintumour initiating cells (人脑月中瘤弓| 发 iffllfiW^^ ). Nature 432,396-401 ；Dalerba ^ . (2007)Phenotypic characterization of human colorectal cancerstem cells (人结肠直肠癌干细胞的表型表征) Proc Natl Acad Sci U S A 104，10158—63 ;0 ' Brien 等.(2006)A human colon cancer cell capable of initiatingtumour growth in immunodef icient mice (能在免疫缺 陷小鼠中引发肿瘤生长的人结肠癌细胞).Nature ；Prince等 (2007) Identification of a subpopulationof cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cellcarcinoma(在头和颈鳞状细胞癌中鉴定到具有癌症干细胞特性的细胞亚 群).Proc Natl Acad Sci U S A，各篇文献通过引用纳入本文说明癌症干细胞的标记表型。 本发明的一些实施方式联用此类表型鉴定和微小RNA检测。本文定义的术语“癌症干细胞”指具有自我更新和分化能力的致瘤性癌细胞亚群。 这些致瘤性细胞负责维持肿瘤，也能产生大量非致瘤性的异常分化后代。与CD44阴性肿瘤 细胞相比，这些细胞在约102个细胞、约5X102个细胞、约103个细胞的剂量时能引发肿瘤 生长，提供至少100倍的肿瘤引发潜能增长。细胞膜CD44染色阳性能确定原发肿瘤中的癌 症干细胞微域。存在此类微域可用于诊断原发和转移部位的癌细胞，此类微域数增加表明 肿瘤具有更高的肿瘤发生能力。这些细胞能在体内形成肿瘤，自我更新产生致瘤性后代 ’产 生异常分化的非致瘤性后代并差别表达至少一种干细胞相关基因。可通过选择表达细胞表 面标记CD44的细胞来富集癌症干细胞群。以乳腺癌为例，在功能试验中，CD44+CD24_/<S谱 系群的细胞具有癌症干细胞自我更新和分化的癌症干细胞独特特性，能形成有助于癌症诊断的独特组织学微域。与其它癌症细胞亚组，如采用小鼠异种移植试验所示的相比，该群细 胞的致瘤能力更高。这种谱系组通常包括正常白细胞、成纤维细胞、内皮细胞、间充质细胞 等标记的特异性试剂。本文所指的“微小RNA(miRNA) ”是一类丰富的非编码RNA，认为其通过调节基因表 达在许多生物学过程中起着至关重要的作用。它们是长度约20-25个核苷酸，例如约21-24 个核苷酸，例如22或23个核苷酸的单链RNA分子。这些非编码RNA能使蛋白质编码基因 的信息靶向从而切断或抑制生产性翻译从而在发育中起着关键作用。人类有200-255种编 码miRNA的基因，丰度对应于大约1 %的蛋白质编码基因。miRNA是长度约20-25个核苷酸， 例如约21-24个核苷酸，如22或23个核苷酸的单链RNA分子。在一些实施方式中，miRNA标记差别表达，其水平低于相当的非致瘤性细胞，可低 于至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少10倍或更多。本发明提供采用本文所述标记，诊断癌症、分类和治疗癌症，特别是癌瘤的方法。 可用这些方法特征鉴定CSC、有利于诊断对象癌症的严重程度(例如，肿瘤等级、肿瘤负荷 等)、有利于测定对象的预后和评估对象对治疗的反应。可在体外或体内，可对分离的细胞， 或完整组织或体液，例如血液、淋巴结活检样品等实施本发明的检测方法。本文所用的术语“在癌症干细胞中差别表达的miRNA”和“在癌症干细胞中差别表 达的多核苷酸”在本文中可互换使用，通常指代表或对应于在癌症干细胞中与同一细胞类 型的非致瘤性细胞相比差别表达的miRNA的多核苷酸，例如发现mRNA水平有至少约25%、 至少约50% -75%、至少约90%、至少约1. 5-倍、至少约2-倍、至少约3-倍、至少约5-倍、 至少约10-倍、或至少约50-倍或更多的差别表达。可通过某多核苷酸“鉴定”所述miRNA，如果该多核苷酸对应于或代表该miRNA的 话，其中“可鉴定性序列”是某序列中唯一可鉴定或确定某多核苷酸序列或其互补序列的连 续核苷酸小片段。术语“生物学样品”包括获自生物体的各种类型样品，可用于诊断或监测试验。该 术语包括生物学来源的血液和其它液体样品、实体组织样品，例如活检样本或组织培养物 或其衍生的细胞及其后代。该术语包括获取后以任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶 解或富集某些组分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞悬液、细胞裂 解液、血清、血浆、生物学液体和组织样品。本发明方法所用的临床样品可得自各种来源，特别是活检样品，但是在一些例子 中，可采用诸如血液、骨髓、淋巴液、脑脊液、滑膜液等样品。可先通过离心、淘选、密度梯度 分离、血浆分离置换、亲和选择、淘洗、FACS、泛影葡胺(Hypaque)离心等分离此类样品再分 析。一旦获得样品，可直接使用，冷冻，或短时维持在合适的培养基中。可采用各种培养基 维持细胞。可用任何常规方法，例如抽血、静脉穿刺、活检等获得样品。样品通常包含至少 约102个细胞，更常至少约103个细胞，优选104、105或更多细胞。样品通常获自人患者，虽 然可采用动物模型，例如马、牛、猪、犬、猫、啮齿类如小鼠、大鼠、仓鼠，灵长类动物等。可采用合适的溶液制备细胞样品的分散液或悬浮液。此类溶液通常是平衡盐溶 液，例如生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，可方便地添加了胎牛血清或其它天然因子，连 用低浓度的通常5-25mM的可接受缓冲液。方便的缓冲液包括HEPES、磷酸缓冲盐水、乳酸盐 缓冲液等。
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可用常规方法分析细胞染色。精确计数的技术包括复杂程度不同，例如多色通道 (multiple color channel)、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等荧光活化细胞分 选术。可采用死细胞相关染料(例如，碘化丙啶)选出死细胞。特别感兴趣的是采用抗体作为亲和试剂。这些抗体可方便地偶联于标记物用于分 离。标记物包括用于直接分离的磁珠，可用结合于支持物的亲和素或链霉亲和素来除去生 物素，可利用荧光分选荧光活化的细胞等等，而易于分离特定类型的细胞。可用的荧光染料 包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红。通常用不同的荧光染料 标记各抗体，从而能独立分选各标记(细胞)。将抗体加入细胞悬液并培育足够时间使之结合细胞表面可用的抗原。通常培育至 少约5分钟，常常少于约30分钟。反应混合物中宜含有足够浓度的抗体，从而不会因缺乏 抗体而限制分离效率。可通过滴定确定合适的浓度。分离细胞的培养基可以是能维持细胞 活力的任何培养基。优选的培养基是含有0.1-0. 5% BSA的磷酸缓冲盐水。可商品化购得 和按照细胞的性质使用各种培养基，包括Dulbecco改进Eagle培养基(dMEM)、汉克基础盐 溶液(HBSS) .Dulbecco 磷酸缓冲盐水(dPBS)、RPMI、Iscove 培养基、含 5mM EDTA 的 PBS 等， 常补加胎牛血清、BSA、HAS等。然后如前文所述定量测定表达细胞表面标记的细胞。本文所用的“诊断”通常包括测定对象对某疾病或病症的易感性，测定对象目前是 否受某疾病或病症的影响，预后患某疾病或病症的对象(例如，鉴定癌性状态、癌症阶段或 癌症对治疗的反应)和可用的治疗方法(therametrics)(例如，监测对象的状况从而提供 治疗作用或效果的信息)。本文所用的术语“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。 这种作用可以是预防性的完全或部分阻止疾病或其症状的发生，和/或可以是治疗性的部 分或完全稳定或治愈疾病和/或该疾病所致的不良作用。本文所用的“治疗”包括治疗哺 乳动物，特别是人的疾病，包括(a)预防易感该疾病或症状但尚未作出该疾病或症状诊断 的对象产生该疾病或症状；(b)抑制疾病症状，即停止其发展；或(c)减轻疾病症状，即导致 该疾病或症状消退。术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指需要诊断、处理或 治疗的任何哺乳动物对象，特别是人。本文所用的“宿主细胞”指培养成单细胞实体的微生物或真核细胞或细胞系，可用 作或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的受者，包括经过转染的原始细胞的后代。应理 解，由于天然、偶然或特意的突变，单细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补上不一定与 原始亲代完全相同。“治疗靶标”指调节其活性后(例如，通过调节表达、生物学活性等)，基因或基因 产物可调节癌症的表型。通篇使用的“调节”表示所示现象的增加或降低(例如，调节生物 学活性指生物学活性增加或生物学活性降低)。乳腺细胞癌乳腺癌是美国妇女中最常见的恶性肿瘤，有八分之一的妇女在其一生中受该病影 响。某些病例，例如携带突变型BRCA1或BRCA2基因而具有遗传倾向者产生乳腺癌的风险 增加。“乳腺癌癌瘤”本文指细胞衬里导管或小叶产生的上皮肿瘤。它们的来源还常是腺 体。癌症分成原位癌和侵袭癌。
原位癌是癌细胞在导管或小叶内增殖但不侵入基质组织。然而，原位癌也可能变 得具有侵袭性。乳腺癌局部侵入和扩散最初通过局部淋巴结、血流或二者。转移性乳腺癌 可影响体内的几乎任何器官，最常见为肺、肝、脑和皮肤。可能的乳腺恶性肿瘤症状包括纤维变性改变、存在团块和不正常排出物。如果产 生此类症状，需要检验以区分良性病损与癌症。怀疑晚期癌症时，通常先进行活检。活检可 以是针刺(如果肿瘤小的话)或切开式活检或者切除活检。对于大多数患者，初步治疗是外科手术，常联用放疗。也可根据肿瘤和患者特征采 用化疗、激素治疗或二者。对于炎性或晚期乳腺癌，初步治疗是全身性治疗，对于炎性乳腺 癌，随后进行外科手术和放疗；外科手术通常对晚期癌症无帮助。对于侵入性癌症患者，通常在外科手术后不久开始化疗或激素治疗，持续数月或 数年；这些治疗能延迟或阻止几乎所有患者的复发并延长一些患者的存活。组合化疗方案 (例如，环磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶；阿霉素加环磷酰胺)常比单一药物更有效。癌症转移时，治疗仅延长中值存活3-6个月，虽然毒性较大的治疗(如化疗)可缓 解症状并提高生活质量。治疗的选择取决于肿瘤的激素-受体状态、无病间隔的长度(从 诊断到出现转移)、转移部位和受影响器官的数量和患者的绝经期状态。可用全身性激素治 疗或化疗治疗具有转移疾病症状的大多数患者。治疗转移性乳腺癌的一些细胞毒性药物是 卡培他滨、阿霉素(包括其脂质体制剂)、吉西他滨和紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛和长春瑞 滨)。微小RNA探针和癌干细胞中的靶标在一些实施方式中，用于本发明方法的微小RNA(miRNA)包括相对于非治疗性细 胞可在BCSC中差别表达的那些miRNA。微小RNA能使蛋白质编码基因的信息靶向从而切 断或抑制生产性翻译在调节细胞基本功能中起着重要作用。在某些实施方式中，显示感 兴趣的miRNA通常在BCSC中下调。一个感兴趣的人miRNA亚组的核苷酸序列见表1。其 它感兴趣序列列于图 1B 中，这些 miRNA 包括 miR-214 ；miR-127 ；miR-142_3p ；miR-199a ； miR-409-3p ；miR_125b ；miR_146b；miR_199b ；miR-222 ；miR-299_5p ；miR-132 ；miR-221 ； miR-31 ；miR-432 ；miR-495；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ；miR_34b ；miR-212 ；miR_146a ； miR-126 ；miR-223 ；miR-130b ；miR-196b ；miR-521 ；miR-429 ；miR-193b ；miR-183 ；miR-96 ； miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ;miR—200b。表1 在致瘤性与非致瘤性乳腺癌细胞中差别表达的微小RNA的部分列表表 ImiRNA 序列茎环序列成熟序列miR-200aSEQ ID NO:l ccgggccccugugagcaucuuaccggacagugcuggauuucc cagcuugacucuaacacugucugguaacgauguucaaaggug acccgcSEQ ID NO:2 uaacacugucugguaacga ugumiR-141SEQ ID NO:3 cggccggcccuggguccaucuuccaguacaguguuggauggu cuaauugugaagcuccuaacacugucugguaaagauggcucc cggguggguucSEQ ID NO:4 uaacacugucugguaaaga uggmiR-200bSEQ ID NO : 5 ccagcucgggcagccguggccaucuuacugggcagcauugga uggagucaggucucuaauacugccugguaaugaugacggcgg agcccugcacgSEQ ID NO:6 uaauacugccugguaaug augamiR-200cSEQ ID NO:6 cccucgucuuacccagcaguguuugggugcgguugggaguc ucuaauacugccggguaaugauggaggSEQ ID NO:7 uaauacugccggguaaug auggamiR-429SEQ ID NO:8 cgccggccgaugggcgucuuaccagacaugguuagaccuggc ccucugucuaauacugucugguaaaaccguccauccgcugcSEQ ID NO:9 uaauacugucugguaaaac cgumiR-182SEQ ID NO: 10 gagcugcuugccuccccccguuuuuggcaaugguagaacuca cacuggugagguaacaggauccggugguucuagacuugccaa cuauggggcgaggacucagccggcacSEQ ID NO: 11 uuuggcaaugguagaacu cacacumiR-96SEQ ID NO: 12 uggccgauuuuggcacuagcacauuuuugcuugugucucuc cgcucugagcaaucaugugcagugccaauaugggaaaSEQ ID NO: 13 uuuggcacuagcacauuu uugcumiR-183SEQ ID NO: 14 ccgcagagugugacuccuguucuguguauggcacugguagaa uucacugugaacagucucagucagugaauuaccgaagggcca uaaacagagcagagacagauccacgaSEQ ID NO: 15 uauggcacugguagaauu cacu所述miRNA包括序列与公开的核酸不相同的那些序列及其变体。变体序列可包含 核苷酸取代、添加或缺失。在一些实施方式中，提供表达和调节受上述miRNA下调影响的靶蛋白用于本发明 方法。该组蛋白包括抗凋亡蛋白例如BCL-2家族成员、转录调节物、原癌基因、癌基因和参 与自我更新过程的其它蛋白质。下文更详细地描述了一些靶蛋白。ZFHX1B是通过调节E-钙粘蛋白参与TGF0信号转导途径和上皮-间充质过渡 (EMT)过程的转录阻抑物。ZFHX1B和miR-200b在成年小鼠脑中局部共表达。miR_200b过 表达导致内源性ZFHX1B阻遏，抑制miR-200b可缓解ZFHX1B阻遏。发现E-钙粘蛋白启动 子的活性受miR-200b和miR_200c调节。BCL-2家族成员既能促进促凋亡过程又能促进抗凋亡过程。参与抗凋亡的成员包 括Bcl-2、Bcl-XL、BCl-W、MCl-l和A1。已知它们能通过线粒体膜的渗透性调节凋亡。该蛋 白质家族的高水平表达参与致癌作用和正常干细胞的自我更新。作为所公开的miRNA靶标的另一组蛋白是polycomb-组蛋白。属于该家族的蛋白 能重塑染色质，作转录因子不能结合DNA中的启动子序列。Polycomb家族蛋白能调节经历 更新或衰老的细胞的关键事件。此类家族的一个成员是BMI1，其mRNA靶序列在物种之间高
12度保守。发现BMI1在非致瘤性癌细胞中下调。miRNA的其它靶标包括造血细胞系和组织中表达的MYB原癌基因家族成员，认为 它们与增殖和分化的调节相关。Myc-家族蛋白参与肿瘤发生和干细胞基因调节(例如，NMYC)。还发现胰岛素样 生长因子结合蛋白，例如IGFBP1与某些癌症有关，也受miRNA的调节。miRNA可调节的另一蛋白质家族是癌基因的Ras家族。Ras癌基因能调节信号转 导和细胞增殖。在许多癌病例中，K-ras蛋白的累积与潜在的K-ras基因突变相关。叉头盒OIA(FOXOIA)是参与细胞分化和细胞融合早期步骤的一种必需转录因子。 它在干细胞维持中也起着重要作用。miRNA调节的另一靶标是转录因子的SRY-相关HMG-盒(S0X)家族。该家族参与胚 胎发育的调节和决定细胞命运。与其它蛋白形成蛋白质复合物后，该家族的成员S0X2-起 着转录活化剂的作用。它在细胞修复和DNA重组中也有作用。这些多核苷酸、多肽及其片段的用途包括但不限于本文所述的作为探针和引物 起始材料的诊断探针和引物，用作癌症诊断和治疗抗体的免疫原等。核酸组合物包含片段和引物，至少长约15bp、至少长约30bp、至少长约50bp、至少 约lOObp、、至少长约200bp、至少长约300bp、至少长约500bp、至少长约800bp、至少长约 lkb、至少长约2. Okb、至少长约3. Okb、至少长约5kb、至少长约10kb、至少长约50kb，长度通 常少于约200kb。在一些实施方式中，多核苷酸片段是多核苷酸的编码序列。还包括本文所 提供序列的变体或简并变体。本文提供的多核苷酸的变体具有与所提供序列相同大小的片 段相比，通过牛津分子公司(Oxford Molecular)的MPSRCH程序执行Smith-Waterman同源 性检索算法测定的序列相同性高于至少约65%、高于至少约70%、高于至少约75%、高于 至少约80 %、高于至少约85 %、或高于至少约90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高(即 100% )的片段。可通过在低严谨性条件下-例如50°C和10XSSC(0. 9M盐水/0. 09M柠檬酸 钠)_杂交来检测具有序列相似性的核酸，该核酸在55°C，1XSSC中洗涤时维持结合。可通 过在高严谨性条件下_例如50°C或更高和0. 1XSSC (9mM盐水/0. 9mM柠檬酸钠)-杂交来检 测序列相同性。杂交方法和条件是本领域熟知的，参见，例如美国专利号5，707，829。与所 提供多核苷酸序列基本上相同的核酸，例如等位基因变体(该基因的遗传改变形式)在严 谨性杂交条件下能结合所提供的多核苷酸序列。可利用本文所述多核苷酸序列产生本文所述miRNA的特异性探针。探针通常是本 文提供的多核苷酸序列的片段。可化学合成或用限制性酶从较长的多核苷酸产生所述探 针。例如，可用放射性、生物素化的或荧光标签标记探针。优选根据本文提供的多核苷酸序 列之任一种鉴定的序列设计探针。癌干细胞的特征在癌症中，特征分析癌症干细胞能开发专门靶向该关键细胞群，特别是它们自我 更新能力的新治疗方法，从而获得更有效的治疗。在人类癌症中，致瘤性癌细胞亚群具有自我更新和分化能力。这些致瘤性细胞负 责肿瘤维持，还产生大量非致瘤性的异常分化后代，因此符合癌症干细胞的标准。所有致瘤 潜能(细胞)包括在癌细胞的⑶44+谱系-亚群中。这些细胞在约103个细胞、约5X103个 细胞、约104个细胞剂量下能弓|发肿瘤生长，与之相比，肿瘤悬液需要约106个细胞剂量才能形成肿瘤，CD44—谱系-细胞在高得多的剂量下也不能形成肿瘤。乳腺癌干细胞(BCSC)可通过它们特定标记的表型和/或它们的功能表型鉴定。在 一些实施方式中，通过在例如有或没有特定miRNA存在下使该细胞与感兴趣标记的特异性 试剂结合，来鉴定和/或分离BCSC。待分析的细胞最初可以是活细胞，或者可以是固定或包 埋的细胞。在一个实施方式中，采用实时PCR分析来分析miRNA表达。表1所列miRNA的 高水平表明该细胞是非致瘤性或非侵入性细胞，而低水平表明为CSC细胞。可根据表1所列miRNA表达水平来鉴定和/或特征分析BCSC。表达水平低或不可 检测表明存在癌症干细胞。比较miRNA或蛋白质的表达水平时，可用正常乳腺上皮细胞或 非致瘤性癌细胞作为对照。在一些实施方式中，感兴趣标记的特异性试剂是可直接或间接标记的抗体或多核 苷酸。在某些情况中，抗体可特异性结合受所公开的特异性miRNA调节的靶蛋白质，例如 S0X2。上文所述的蛋白质或多核苷酸探针可用于，例如测定样品中是否存在任一种本文 提供的多核苷酸或其变体。下文更详细描述了这些和其它应用。用本文公开的各种标记染色或与之杂交还能测定原发肿瘤中的癌症干细胞微域。 存在此类微域可用于诊断原发和转移部位的鳞状细胞癌，此类微域数量增加表明肿瘤具有 更高的致瘤性能。差别细胞分析患者样品中存在BCSC可表明癌的阶段或等级。知晓癌细胞亚型和BCSC的位置对 诊断和治疗极有帮助。此外，可利用检测BCSC来监测对治疗的反应并有助于预后。预后因 素有助于确定治疗方案和强度；具有强阴性预后特征的患者通常给予更强形式的治疗，因 为认为其潜在的效益能弥补治疗毒性的增加。可定量测定具有本文所述干细胞表型的细胞来测定BCSC是否存在。除细胞表面 表型鉴定外，可用于定量测定样品中具有“干细胞”特征的细胞，可通过特定基因的表达概 况、所提供miRNA和靶蛋白的表达或通过功能标准，例如自我更新、体内产生肿瘤的能力来 测定，例如采用异种移植模型等等。可采用的一种方法是本文公开的miRNA种类原位杂交。考虑到miRNA片段的长度 短，可采用锁定核酸(LNA)作为探针，考虑到其解链温度高以及已知道各miRNA的阳性和阴 性对照。可在较宽范围内改变解链温度以确定最佳的探针标记条件。还可采用含1、2、3或 4个错配的错配LNA探针构成阴性对照。本文所述miRNA的检测(水平)低或检测不到是 BCSC的标志之一。测定是否存在miRNA种类以供诊断或预后的另一方法是联用RT-PCR与激光捕获 显微解剖。可用多重RT_PCR(逆转录-PCR)测定组织样品中是否存在miRNA种类。也可用任何已知方法进行检测，包括但不限于采用合适标记的多核苷酸进行原位 杂交、PCR(聚合酶链式反应)和“Northern”或RNA印迹、阵列、微阵列等或此类技术的组 合。在本发明测定方法中可采用本领域已知的多核苷酸的各种标记物和标记方法。采用合适的演绎方案、AI系统、统计学比较等，可比较获自患者样品的差别祖细胞 分析和参比样品的差别祖细胞分析。与正常细胞、患相似疾病组织的细胞等参比组织分析 进行比较，能表明疾病的阶段。可编辑参比组织分析的数据库。本发明方法可检测临床症
14状发作前对更具侵袭性肿瘤生长的易感性，因此能进行早期治疗干预，例如启动化疗、提高 化疗剂量、改变化疗药物的选择等。在某些实施方式中，乳腺癌的诊断和预后可包括组织样品的细胞染色。在某些病 例中，细胞染色有助于描绘肿瘤内的癌细胞亚型和侵袭性癌细胞定位。可采用本领域已知 的常规方法通过细胞染色进行分析。精确计数的技术包括共聚焦显微术、荧光显微术、复杂 程度不同的，例如多色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等荧光活化细胞分选 术。可采用死细胞相关染料(例如碘化丙啶)选出死细胞。抗体试剂可以是miRNA靶向蛋白的特异性抗体，或者也可采用miRNA本身的特异 性多核苷酸探针。与正常细胞或非致瘤性对照相比，miRNA靶标的高表达或miRNA低表达 表明存在BCSC。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，可用转基因动物、经免疫的动物、无限增 殖的人或动物B-细胞、编码该抗体或T细胞受体的DNA载体转染的细胞等产生。制备抗体 和它们用作特异性结合成员是否适合的细节是本领域技术人员熟知的。可依据原位杂交分析或抗体结合于组织切片进行分析。此类分析能鉴定肿瘤块 中组织学不同的细胞并鉴定此类细胞表达的基因。杂交切片可包含一个或多个实体瘤样 品，例如利用组织微阵列(参见，例如West和van de Riin(2006)Histopathology 48(1) 22-31 ；禾口 Montgomery 等.(2005) Appllmmunohistochem Mol Morphol. 13(1) :80_4)。组织 微阵列(TMA)包含多张切片。可用本领域已知的方法标记选择的探针，例如感兴趣标记的 特异性抗体使之结合于组织切片。染色可与其它组织化学或免疫组织化学方法联用。所选 基因在肿瘤基质组分中表达就能根据与软组织肿瘤相关基质细胞的相似性特征鉴定细胞。筛选试验在本发明的某些实施方式中，可将miRNA或它们的靶标用于可能有助于研究或药 物开发的化合物的筛选方法中。在一些实施方式中，进行筛选以发现能提高所提供miRNA 的表达或降低其靶蛋白质在癌症干细胞中表达的化合物或细胞因子。这包括混合候选药物 与miRNA表达量低或不表达的细胞群，例如干细胞或癌症干细胞群，然后测定候选药物产 生的任何调节作用。这还包括测定细胞的活性或检测某些靶蛋白、活力、毒性、代谢改变或 对细胞功能的影响。尤其感兴趣的是对人细胞有活性药物的筛选试验。为此目的可采用各种试验，包 括结合miRNA的靶蛋白的免疫试验；测定细胞生长、分化和功能活性；产生的因子等等。具 体地说，试验包括分析本文鉴定的受miRNA调节的蛋白质的表达。可采用体外培养的细胞、新鲜分离的细胞、遗传改变的细胞或动物、纯化的miRNA、 纯化的miRNA调节的蛋白质等进行筛选。在一个实施方式中，进行筛选以测定能减弱miRNA 靶蛋白活性的候选药物活性。可通过使纯化蛋白质与候选药物接触来测试此类药物。或者， 可将细胞与候选物质接触以调节这些蛋白质各自的转录或翻译。在此类试验中，本文公开 的miRNA可用作协调调节这些蛋白质表达的阳性对照。化合物筛选可鉴定到能调节miRNA 调节蛋白的活性或miRNA本身的药物。能提高特定miRNA活性或表达的候选化合物，可进 一步了解癌症的生物学对开发癌症治疗剂至关重要。尤其感兴趣的是对人细胞毒性低药物 的筛选试验。本文所用的术语“药物”描述了能改变或模拟与缺血相关基因对应的缺血相关激 酶生理功能的任何分子，例如蛋白质或药物。通常可采用不同的药物浓度平行运作多个试验混合物以获得对各种浓度的不同反应。通常取这些浓度之一，即零浓度或检测水平以下 浓度作为阴性对照。候选药物包括许多化学类别，虽然它们通常是有机分子，但优选分子量大于50而 小于约2，500道尔顿的小有机化合物。候选药物包含能与蛋白质结构上相互作用的官能 团，特别是氢键，通常包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能基团。 候选药物常包含一个或多个被以上官能团取代的碳环结构或杂环结构和/或芳族或多聚 芳族结构。也可在生物分子中寻找候选药物，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们 的衍生物、结构类似物或组合。从各种来源获得候选药物，包括合成或天然化合物的文库。例如，可采用已有的许 多方法随机和直接合成各种有机化合物和生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。 或者，可获得或不难制备细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，不难 通过常规的化学、物理和生物化学方法修饰天然或合成产生的文库和化合物，可利于产生 组合文库。可对已知的药物进行直接或随机的化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化等以 产生结构类似物。可从文库，例如天然产物文库或组合文库获得测试药物。许多不同类型 的组合文库和制备此类文库方法的描述可参见，例如各自通过引用纳入本文的PCT出版物 WO 93/0612UW0 95/12608, W0 95/35503, W0 94/08051 和 W0 95/30642。各种其它试剂可包括在筛选试验中。这些试剂包括盐、天然蛋白质(如白蛋白)， 用于促进最佳蛋白质_蛋白质结合和/或降低非特异性或背景相互作用的洗涤剂等试剂。 可采用能改进试验效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。可以任 何顺序加入各组分的混合物以提供所需的结合。可在任何合适温度，通常4-40°C下培育。选 择(达到)最佳活性的培育时间，但也可优化培育时间以促进快速高通量筛选。通常0. 1-1 小时足够了。某些筛选方法包括筛选能调节miRNA靶蛋白，例如ZFHX1B、MYB原癌基因和IGFBP1 表达的化合物。此类方法通常包括进行细胞试验，使测试化合物与表达靶蛋白的一种或多 种细胞接触，然后检测靶蛋白的表达水平变化。用富含致瘤性或非致瘤特性的细胞进行一 些试验。可采用多种不同方法检测表达。可用能与基因转录物(或其衍生的互补核酸)特 异性杂交的探针，检测细胞中表达的mRNA来测定细胞中基因的表达水平。可裂解细胞进行 Northern印迹，或不裂解细胞而用原位杂交技术进行检测。或者，可用免疫学方法检测蛋 白，其中用能特异性结合该蛋白的抗体检测细胞裂解物。其它细胞试验是报道试验。用操作性连接于编码可检测产物的报道基因的异源核 酸构建物进行某种这些试验。可采用许多不同的报道基因。一些报道物本身可检测。此类 报道物的一个例子是发射可用荧光检测器检测荧光的绿色荧光蛋白。其它报道物产生可检 测产物。此类报道物常常是酶。示范性酶报道物包括但不限于葡糖醛酸酶、CAT(氯霉 素乙酰转移酶；Alton和Vapnek (1979) Nature 282 :864_869)、萤光素酶、0 _半乳糖苷酶和 碱性磷酸酶(Toh 等，(1980)Eur. J. Biochem. 182 :231_238 ；和 Hall 等.(1983) J. Mol. Appl. Gen. 2 101)。在这些试验中，使含报道构建物的细胞与测试化合物接触。能结合启动子使之活 化或触发产生感兴趣的miRNA级联反应的测试化合物将导致可检测报道基因的表达。某些
16其它报道试验采用包含异源构建物的细胞进行，所述异源构建物包含能活化表达的转录调 控元件。在本文中，还可通过报道基因表达相关信号的产生，来鉴定能结合转录调控元件而 活化报道基因表达的，或触发能与转录调控元件结合而活化报道基因表达的物质形成的药 物。可将表达或活化水平与基线值比较。如上所述，基线值可以是对照样品的数值或 代表对照群体(如健康个体)的统计学数值。还可测定不表达所提供的作为对照的多核苷 酸或蛋白质的细胞的表达水平。此类细胞在遗传学上通常与测试细胞基本相同。报道试验中可采用各种不同的细胞类型。可采用真核细胞，该细胞可以是通常用 于产生包含重组核酸构建物的细胞的任何细胞。示范性真核细胞包括但不限于酵母菌和 各种高等真核细胞，例如cos、CH0和HeLa细胞系。可实施各种对照以确保观察到的活性真实，包括用缺乏报道构建物的细胞进行平 行反应或使含报道构建物的细胞与测试化合物不接触。也可如下所述进一步验证化合物。可进一步检验通过任何前述筛选方法初步鉴定到的化合物和细胞物质以验证其 表观活性。此类方法的基本形式包括将初步筛选鉴定到的候选物给予用作人模型的动物， 然后测定特定miRNA或靶蛋白的表达是否改变。用于验证研究的动物模型通常是哺乳动 物。合适动物的具体例子包括但不限于灵长类、小鼠和大鼠。设计某些方法来不仅检验前导候选物能否改变模型动物的活性，而且可提供抗侵 袭性癌症的保护作用。在此类方法中，将前导化合物给予模型动物(即动物，通常是除人外 的哺乳动物)。该动物因其自身的遗传组成或环境因素而易于产生侵袭性癌或已患有该癌。 能实现减少侵袭性癌症所需作用的化合物或蛋白物质是进一步研究的良好候选对象。本文所述筛选方法鉴定到的活性测试药物可用作合成类似化合物的前导化合 物。通常合成的类似化合物具有类似于前导化合物的电子构型和分子构象。可采用例如自 洽场(self-consistent field SCF)分析、构型相互作用(CI)分析和简正模式动态分析 (normal mode dynamics analysis)等技术鉴定类似化合物。可得到实施这些技术的计算 机程序。参见，例如 Rein 等，(1989)Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (受体-配体相互作用的计算机辅助建模)(Alan Liss,纽约)。癌症的治疗本发明还提供降低癌细胞生长的方法。该方法能减少带有本文提供的特异性标记 或组合标记的癌细胞数量，降低在癌细胞中差别表达基因的表达，改变miRNA表达水平，或 降低癌症相关多肽的水平和/或活性。该方法还包括引入可减少癌症(细胞)生长作用的 多核苷酸或多肽。例如，可将编码表1所列miRNA的遗传构建物引入癌症干细胞以提高该 细胞的miRNA水平。术语miRNA指提供的任何序列，通常指提供的成熟序列。术语“微小RNA”的范围 中包括活性与天然微小RNA基本上相同的合成分子，例如本领域已知的化学性质改变的合 成寡核苷酸。实施本发明方法时，将有效量的以下簇(但不限于)中的微小RNA的特异性miR 制剂:200c-141 簇(miR200c, miR141) ；200b-200a-429 簇(miR200b, miR200a, miR429)； 和182-96-183簇(miR182，miR96, miR183)引入靶细胞中，可采用任何方便的方法将该制 剂引入靶细胞中。靶细胞通常是癌，包括乳腺癌，更具体地说包括乳腺癌干细胞，例如具有⑶44+CD24_〃s谱系_细胞表型的细胞。本发明方法可用于预防或治疗目的。本文所用的术语“治疗”用于指预防疾病和 治疗已有的疾病。例如，可在疾病明显发生前给予药物来预防自身免疫疾病。尤其感兴趣 的是治疗现有疾病，即通过治疗来稳定或改善患者的临床症状。如本领域所知，miRNA是长度约20_25个核苷酸，例如约21-24个核苷酸，例如22 或23个核苷酸的单链RNA分子。靶标miR181a可与或不与引入的miR181a制剂完全互补。 如果不完全互补，miRNA及其相应靶病毒基因组应至少基本上互补，这样该miRNA长度上 (约20-25个核苷酸)的错配数不超过约8个核苷酸，在某些实施方式中，不超过约6或5 个核苷酸，例如4个核苷酸、3个核苷酸、2个核苷酸或1个核苷酸。miRNA制剂可提高或降低靶miRNA在靶细胞内的水平。当该制剂是抑制性药物时， 其通过降低靶细胞中miRNA的存在量而抑制靶miRNA的活性，所述靶细胞可以存在于体外 或体内。“降低含量”表示与对照，即未用本发明方法处理的相同靶细胞相比，靶细胞中的 靶miRNA水平或含量降低了至少约2-倍、通常至少约5-倍，例如10-倍、15-倍、20-倍、 50-倍、100-倍或更多。当miRNA制剂提高了细胞中的靶miRNA活性时，靶细胞中miRNA的含量提高，所 述靶细胞可以存在于体外或体内。“提高含量”表示与对照，即未用本发明方法处理的相 同靶细胞相比，靶细胞中的靶miRNA水平或含量提高至少约2-倍、通常至少约5-倍，例如 10-倍、15-倍、20-倍、50-倍、100-倍或更多。miRNA抑制制剂表示能抑制靶miRNA活性的制剂。抑制性制剂可通过各种不同的 机制抑制靶miRNA的活性。在某些实施方式中，抑制性制剂是能结合靶miRNA并藉此抑制 其活性的制剂。代表性miRNA抑制性药物包括但不限于反义寡核苷酸等。其它感兴趣的 药物包括但不限于感兴趣的天然产生或合成的小分子化合物，包括许多化学类别，虽然它 们通常是有机分子，但优选分子量大于50小于约2，500道尔顿的小有机化合物。候选药物 包含有与蛋白质结构相互作用的官能团，特别是氢键，通常包含至少一个胺基、羰基、羟基 或羧基，优选至少两个化学官能基团。候选药物常常包含一个或多个以上官能团取代的碳 环或杂环结构和/或芳族或多聚芳族结构。还在生物分子中寻找候选药物，包括肽、糖、脂 肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结构类似物或组合。可用合适的筛选方案鉴定此 类分子。反义试剂可以是反义寡核苷酸(0DN)，特别是含有化学修饰的天然核酸的合成 0DN，或表达此类反义分子的核酸构建物，例如RNA。反义序列与靶miRNA互补并抑制其表 达。可给予一种反义分子或反义分子的组合，所述组合可包含多个不同的序列。可通过表达合适载体中的所有或部分靶miRNA序列而产生反义分子，其中对转录 起始定向从而将反义链制备成RNA分子。或者，反义分子是合成的寡核苷酸。反义寡核苷 酸的长度通常至少约7个、通常至少约12个、更常至少约20个核苷酸，不超过约25个、通 常不超过约23-22个核苷酸，其中该长度受抑制效率、特异性(包括不存在交叉反应性)等 控制。可用本领域已知的方法化学合成反义寡核苷酸(参见Wagner等.(1993)同上和 Milligan等，同上)。优选的寡核苷酸含有化学修饰的天然磷酸二酯键结构以提高它们的 胞内稳定性和结合亲和力。参考文献中已描述了改变骨架、糖或杂环碱基化学性质的许多此类修饰。骨架化学性质中有用的改变是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯(其中两个非桥连氧被 硫取代)；磷酸酰胺酯(phosphoroamidite)；烷基磷酸三酯和硼磷酸酯(boranophosphate) (键)。非手性磷酸酯衍生物包括3' -0' -5' -S-硫代磷酸酯、3' -S-5' -0-硫代磷酸 酯、3' -CH2-5' -0-磷酸酯和3' -NH-5' _0_氨基磷酸酯。肽核酸用肽键替代整个核糖磷 酸二酯骨架。也可采用糖修饰来增强稳定性和亲和力。可采用脱氧核糖的a _端基异构体， 其中碱基相对于天然的端基异构体是倒置的。可改变核糖的2' -0H以形成2' -0-甲 基或2' -0-烯丙基糖，从而提供对降解的抗性而不损害亲和力。杂环碱基的修饰必须维持 适当的碱基配对。一些有用的取代包括脱氧尿苷取代脱氧胸苷；5-甲基-2'-脱氧胞苷和 5-溴-2'-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。当分别取代脱氧胸苷和脱氧胞苷时，已证明5-丙炔 基-2'-脱氧尿苷和5-丙炔基-2'-脱氧胞苷能提高亲和力和生物学活性。感兴趣的反义分子包括拮抗性(antagomir)RNA，例如通过引用专门纳入本文的 Krutzfeldt等(同上)所述。经工程改造使之具有某些“药物-样”特性，例如为稳定性而 作化学修饰和偶联胆固醇以便递送的小干扰性双链RNA(siRNA)已显示在体内能实现内源 基因的治疗性沉默。为开发体内沉默性miRNA的药理学方法，开发了与miRNA互补的、经化 学修饰的偶联胆固醇的单链RNA类似物，称为“拮抗物”。可采用标准固相寡核苷酸合成方 案合成拮抗性RNA。将RNA偶联于胆固醇，还可在一个或多个位置含有硫代磷酸酯骨架。某些实施方式感兴趣的也是RNAi制剂。在代表性的实施方式中，RNAi制剂靶向 微小RNA的前体分子，称为前-微小RNA分子。RNAi制剂指能通过RNA干扰机制调节微小 RNA表达的制剂。本发明一个实施方式中采用的RNAi制剂是以双链体结构存在的小核糖 核酸分子(本文也称为干扰性核糖核酸)，即寡核糖核苷酸，例如两种不同的寡核糖核苷酸 彼此杂交或一种寡核糖核苷酸承担形成小发夹而产生双链体结构。寡核糖核苷酸指长度 不超过约100个核苷酸的核糖核酸，通常长度不超过约75个核苷酸，在某些实施方式中长 度小于约70个核苷酸。当该RNA制剂是两种不同核糖核酸彼此杂交形成的双链体结构， 例如siRNA，该双链体结构的长度通常约15-30bp，常见约15-29bp，在某些实施方式中，约 20-29bp长度，例如尤其感兴趣21bp、22bp。当该RNA制剂是以发夹形式存在的一种核糖 核酸的双链体结构，即shRNA，发夹杂交部分的长度通常与以上siRNA类型制剂所提供的相 同，或更长4-8个核苷酸。该实施方式的RNAi重量通常约为5，000道尔顿至约35，000道尔 顿，在许多实施方式中，至少约10，000道尔顿-小于约27，500道尔顿，常常小于约25，000 道尔顿。当需要提高细胞中miRNA表达，例如诱导分化，药物可以是微小RNA本身，包括以 上关于反义所述的任何修饰的寡核苷酸，例如胆固醇偶联物、硫代磷酸酯键连接等。或者， 可采用表达miRNA的载体，包括与靶向生物相关的前-miRNA(发夹)序列。可利用表达载体将靶基因弓丨入细胞内。此类载体通常在启动子序列附近含有方便 的限制性位点以供插入核酸序列。可制备包含转录起始区、靶基因或其片段和转录终止区 的转录盒。可将转录盒引入各种载体，例如质粒；逆转录病毒，例如慢病毒、腺病毒等中，所 述载体能在细胞中短暂或稳定维持，通常至少约1天，更常至少约数天到数周。表达盒通常采用外源性转录起始区，即除在正常产生的染色体中与T细胞受体结 合的启动子外的启动子。该启动子在宿主细胞，特别是表达盒靶向的宿主细胞中具有功能。
19可用体外重组方法引入启动子，或由合适宿主细胞对该序列作同源整合。该启动子操作性 连接于自身抗原的编码序列从而产生可翻译的mRNA转录物。表达载体在启动子序列附近 方便地含有限制性位点以利于自身抗原序列的插入。将表达盒制备成含有组成型或诱导型转录起始区、编码自身抗原序列的基因和转 录终止区。可将表达盒弓|入各载体中。感兴趣的启动子可以是诱导型或组成型启动子，通常 是组成型启动子，可在疫苗接受细胞中提供高水平的转录。启动子可以仅在接受细胞类型 中具有活性，或者可在许多不同细胞类型中具有广泛活性。许多哺乳动物细胞的强启动子 是本领域已知的，包括肌动蛋白启动子、SV40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、 人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒LTR等等。启动子可与增强子结合或不结合，其中增强子 可以天然与特定启动子结合或与不同启动子结合。在编码区的3’端提供终止区，该终止区可以天然与可变区结构域结合或可衍生自 不同来源。可采用不会有害地影响表达的各种终止区。可在体外或可在合适的宿主细胞， 例如大肠杆菌中进行各种操作。各次操作后，可克隆所得的构建物，分离载体，筛选DNA或 测序以确保构建物的正确性。可通过限制性分析、测序等筛选序列。如上所示，可采用任何便利的方案将miRNA药物引入靶细胞内，所述方案根据靶 细胞是在体外还是体内而有所不同。可采用许多选项将dsRNA递送入细胞或细胞群，例如 细胞培养物、组织、器官或胚胎中。例如，可在胞内直接引入RNA。在此类情况中，通常采用各 种物理方法，例如显微注射给予(参见，例如Zernicka-Goetz等，(1997)Development 124 1133-1137 ；和 Wianny 等，(1998) Chromosoma 107 :430_439)。细胞递送的其它选择包括在 dsRNA存在时渗透处理细胞膜和电穿孔、脂质体介导的转染或用诸如磷酸钙等化学物质转 染。也可采用许多已建立的基因治疗技术将dsRNA引入细胞内。例如，通过将病毒构建物 引入病毒颗粒内可实现将表达构建物有效引入细胞内以转录该构建物编码的RNA。例如，可将抑制性药物直接喂入、注射入含靶基因的宿主生物。可将该药物直接引 入细胞内(即胞内)；或胞外引入体腔、细胞间隙，引入宿主的循环系统，口服引入等。口服 引入的方法包括直接混合RNA与生物体的食物。引入核酸的物理方法包括将RNA溶液直接 注射入细胞或胞外注射入生物体。该药物的引入量应能递送每个细胞至少一拷贝。该药物 的更高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可产生更有效的抑制；对 于具体应用，较低剂量也可能有用。采用脂质体时，可将能结合胞吞作用相关细胞表面膜蛋白的物质连接于脂质体使 脂质体靶向T细胞而促进摄取。可连接的蛋白质的例子包括能结合T细胞的衣壳蛋白或其 片段，能特异性结合循环性T细胞上经历内化的表面蛋白的抗体和靶向T细胞内胞内定位 的蛋白质。基因标记和基因治疗方案的综述见Anderson等，(1992) Science 256 :808_813。在某些实施方式中，采用流体动力学核酸给予方案(hydrodynamic nucleicacid administration protocol)。当药物是核糖核酸时，特别感兴趣的是下文详细描述的 流体动力学核糖核酸给予方案。当药物是脱氧核糖核酸时，感兴趣的是Chang等.， J.Virol. (2001)75 :3469_3473 ；Liu 等 ，Gene Ther. (1999)6 1258-1266 ；Wolff 等 ， Science (1990) 247 1465-1468 ；Zhang 等.，Hum. GeneTher. (1999) 10 1735-1737 ；和 Zhang 等.，Gene Ther. (1999) 7 1344-1349所述的流体动力学脱氧核糖核酸给予方案。其它感兴趣的核酸递送方案包括但不限于以下文献所述的那些感兴趣的美国专
20利包括5，985，847和5，922，687 (其内容通过引用纳入本文)；W0/11092 ；Acsadi等.，New Biol. (1991)3 71-81 ；Hickman 等.，Hum. Gen. Ther. (1994)5 1477-1483 ；和 Wolff 等.， Science (1990) 247 1465-1468 等等。根据药物的性质，可采用能在靶细胞中产生所需miRNA调节作用的任何方便方法 给予宿主活性药物。因此，可将药剂掺入各种制剂以便治疗性给药。更具体地说，可通过与 合适的药学上可接受的运载体或稀释剂混合将本发明的药物配制成药物组合物，可配制成 固体、半固体、液体或气体形式的制品，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射 剂、吸入剂和气溶胶。因此，可以各种方式给予该药物，包括口服、口腔含化、直肠、胃肠外、 腹膜内、真皮内、透皮、鞘内等给予。本文所用的术语“单位剂型”指适合人和动物对象单位剂量的物理上不连续的单 位，每个单位含有经计算足以产生所需作用的预定量的本发明化合物以及药学上可接受的 稀释剂、运载体或载体。本发明新型单位剂型的规格取决于所用的特定化合物和要达到的 效果以及各化合物在宿主中的相关药代动力学。药学上可接受的赋形剂，例如载体、佐剂、运载体或稀释剂不难公开获得。而且，药 学上可接受的辅助物质，例如PH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等不难公开获得。本领域技术人员不难理解剂量水平可随具体化合物的功能、递送载体的性质等而 不同。本领域技术人员不难采用各种方式测定给定化合物的优选剂量。如上所述将有效量 的miRNA物质引入哺乳动物细胞内以调节靶基因的表达，导致修饰癌的致瘤活性，从而提 供用靶向癌症干细胞的方法治疗癌症的方式。“降低癌细胞生长”包括但不限于降低癌细胞增殖，降低非癌细胞变成癌细胞的 发生率。采用任何已知的试验，包括但不限于[3H]_胸苷掺入，一段时期内的细胞计数；检 测和/或测量BCSC相关标记等，不难测定是否实现了癌细胞生长的降低。本发明提供治疗癌症的方法，通常包括给予有此需要的个体能降低癌细胞生长的 物质，给予量应足以降低癌细胞生长并治疗癌症。可采用各种已知的癌症诊断试验，包括但 不限于活检、对比放射照相研究、CAT扫描和检测个体血液中癌症相关的肿瘤标记，来评 估某物质或该物质的具体用量是否有效治疗了癌症。可全身或局部，通常是全身给予该物 质。可使能降低癌细胞生长的药物，例如化疗药物靶向癌细胞。因此，在一些实施方式 中，本发明提供将药物递送给癌细胞的方法，包括将药物_多肽或药物_多核苷酸复合物 给予对象，其中所述复合物对于miRNA-调节的多肽或miRNA本身具有特异性，所述药物是 能降低癌细胞生长的药物，各种药物是本领域已知和上文讨论过的。可通过将药物偶联于 (例如，共价或非共价直接连接或通过接头分子连接，从而形成药物_抗体复合物)miRNA的 特异性抗体或受miRNA调节的多肽来实现靶向。偶联药物形成复合物的方法是本领域熟知 的，本文无需赘述。本说明书述及的各出版物出于所有目的通过引用全部纳入本文。应理解本发明不限于具体的方法、方案、细胞系、动物种或属和所述的试剂，因为 这些均可改变。还应理解本文所用的术语目的只是描述特定的实施方式，不是要限制本发 明的范围，本发明的范围只由随附的权利要求书限制。
除非文中另有明确表述，本文所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。 因此，例如，述及“一个细胞”包括多个此类细胞，述及“该培养物”包括述及一个或多个培 养物和本领域技术人员已知的其等价形式，等等。除非另有表述，本文所用的所有技术和科 学术语具有与本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。实验实施例1鉴定乳腺癌干细胞的基因标签我们曾根据⑶44和⑶24表达将BCSC鉴定为⑶44+⑶24v<s谱系。将从三份乳腺还 原(breast reduction)样品分离的正常乳腺上皮细胞以细胞表面标记的表达定义为ESA+ 谱系_ (⑶64_、CD31—、CD140b_、CD45_)。我们通过微阵列分析，寻找分离自6位患者(有原 发性恶性胸膜渗出的3个人和在免疫缺陷小鼠中乳腺肿瘤生长为实体瘤异种移植物的3 个人)的BCSC与3次还原乳房成形术(reduction mammoplasties)产生的正常人乳腺上 皮细胞之间差别表达的基因。根据表达水平有两倍差异选出一组186种基因，所有样品的 t-检验P值< 0. 005。用本-赫氏方法(Beniamini-Hochberg procedure)控制假发现率 (FDR)。根据以上标准，清单中基因的FDR不到5%。如预计的那样，作为癌症干细胞基因 标签的186种基因的基因表达模式足以鉴别乳腺癌干细胞与正常乳腺上皮细胞。我们还 对3份异种移植物的BCSC样品和1份正常乳腺上皮样品中随机选择的14种基因进行实时 PCR来验证这186种基因的差别表达。实时PCR所见的各肿瘤样品中的基因表达模式在很 大程度上与微阵列数据观察到的相一致在检验的3个肿瘤中，我们观察到所有14种基因 的表达模式相一致，在第三个肿瘤中，14种基因中有9种表达模式与阵列数据相一致。(参 JAL Liu, M. F. Clarke, M. F. Association of a GeneSignature from Tumorigenie Breast Cancer Cells with Clinical Outcome (致瘤性乳腺癌细胞的基因标签与临床结果相关)， The New England Journal ofMedicine，356 :217_226，2007，通过引用专门纳入本文)。用ABI阵列进一步筛选10个患者肿瘤的BCSC和非致瘤性癌细胞表达了 500种以 上的miRNA。用实时RT-PCR证实了这些结果(表2)。根据微小RNA表达的结果，发现miRNA在调节基本BCSC功能中起着重要作用。由 miR-182、miR-182、miR-200a、miR_200b、miR-200c 组成的一组 miRNA 在乳腺癌干细胞中一 致下调。在胚胎癌细胞(EC细胞)中完全丧失所有5种miRNA的表达，但它们在正常胚胎 干细胞(ES细胞)中表达。这些数据证明乳腺癌中存在具有干细胞-样特性的引发肿瘤的 细胞群，其miRNA可用作诊断或治疗靶标。然后研究了这些miRNA的靶标。认为m200b和m200c具有相同的靶标。已经验证 的m200b的一个靶标是抑制E-钙粘蛋白表达并在正常干细胞生物学和EMT中起作用的蛋 白质ZFHX1B。据报道，BCL-2家族中抗凋亡蛋白的多个成员也是靶标。BCL-2家族蛋白不 受控制的表达涉及正常干细胞的致癌作用和自我更新。这些mRNA 中的四禾中(ml83, m200a, m200b, and m200c)可靶向 BMI1。BMI1 在许多 组织的正常干细胞和至少一些癌症干细胞自我更新中起作用。重要的是，我们发现BMI1蛋 白在许多患者的肿瘤中所见的非致瘤性癌细胞中下调。BMI1 mRNA中的靶序列在物种之间 高度保守，使它很可能成为真正的靶标，这些miRNA的其它感兴趣靶标是MYB原癌基因、NMYC、IGFBP1、KRAS、F0X01A和Sox2。MYB和NMYC基因与正常和恶性干细胞更新相关。近年(发现)MYB涉及乳腺癌的 肿瘤发生。F0X01A在干细胞维持中起作用。CSC在微阵列上过表达了这些基因中的几种。 Affymetrix阵列检测到BCSC表达的这些基因中有几种差别达2-14倍。实施例2依据福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤标本开发可用作预后和预测工具的标 记。利用本文鉴定的在BCSC中差别表达的序列产生标记(原位杂交探针)以测定福尔马 林固定石蜡包埋(FFPE)组织中肿瘤干细胞的数量和位置。通过组织学检验分析了所有乳 腺癌活检和切片标本，该检验采用福尔马林固定后石蜡包埋材料的薄切片。因此，全国外科 病理学部门档案室中保存了大量收集的肿瘤标本，可用于组织学研究肿瘤干细胞和它们在 临床结果中所起的作用以及对辅助治疗的反应。利用含有福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的临床结果已知的肿瘤标本的组织微阵 列(TMA)测定这些发现的临床意义。测定了包括肿瘤中的正常基质细胞、乳腺CSC和其它 癌细胞的各肿瘤细胞群所表达的预后或预测标记。开发了原位杂交探针(ISH)以评价石蜡包埋组织中的基因表达。在约10天中产 生ISH探针。这些探针具有成功率。St Croix等和Iacobuzio-Donahue等描述了 ISH技 术。它采用长度为400-600个核苷酸的长RNA探针，依赖于信号的酪胺放大，然后用生色或 荧光底物显色。这些试剂对石蜡包埋福尔马林固定的组织工作得极好。ISH探针优于常规 抗血清或单克隆抗体在于其可包括有义链或错义探针作为对照。对于所选择的探针，对乳 腺癌冷冻标本的激光捕获解剖材料进行RT-PCR以验证其表达模式。构建了含多达500个乳腺癌的TMA可用一个TMA模块代表。乳腺的TMA包括1) 正常乳腺组织的微阵列；2)注释乳腺癌组织的微阵列。将获得这些病例的临床随访报告。 3)为研究乳腺癌之间的变异性，具体地说是患者_特异性因素(与各肿瘤_特异性因素相 反)所确定的各癌症标本中肿瘤干细胞存在数量的(变异)程度，用患者的2个独立原发 乳腺癌(breast cancerprimary)的乳腺癌材料产生TMA。4)为研究转移过程对乳腺癌中 肿瘤干细胞数量的影响，产生了代表20位患者材料的组织微阵列。对于各患者，原发性乳 腺肿瘤用一个或多个淋巴结转移灶和远端部位，例如脑、肺或骨的转移灶一起代表。5)还可 采用含有原发侵袭性乳腺癌标本的乳腺癌组织微阵列，可采用全部患者的结果数据，随访 中值为15. 4年(6. 3-26. 6年)。随访包括总存活数、疾病特异性存活数和首次复发时间。测定组织学切片中存在的miRNA种类.miRNA种类可用作肿瘤干细胞的标记。采 用解链温度远高于RNA的锁定核酸(LNA)进行miRNA种类的原位杂交。采用LNA探针和各miRNA种类的已知阳性和阴性对照检查组织微阵列(由RT-PCR 验证)，实验方法的解链温度变化范围很大。采用含1、2、3或4个错配的错配LNA探针组成 的阴性对照。测定各种组分中(肿瘤细胞与基质细胞)是否存在miRNA种类的第二种方案联用 RT-PCR与激光捕获显微解剖。采用少至25个细胞，线性扩增后可产生足够的材料以可靠地 定量测定约500种不同的miRNA。通过激光捕获显微解剖不难获得细胞数。用miRNA标记 分析这些乳腺癌TMA能测定最佳探针的回溯方式(retrospective manner)。实施例3赋予CSC对抗标准细胞毒性化疗的靶途径.采用外源性miRNA或合成shRNA靶向使CSC对抗治疗的途径。采用了以下三种不同的公布方法递送shRNA:脂质体递送(参见 Sorensen 等.(2003) J Mol Biol 327，761-6)、将 shRNA 与去端肽胶原(atellocolagen)偶 联(参见 Takeshita 等.(2005) ProcNatl Acad Sci U S A 102,12177-82)和将 shRNA 与 单克隆抗体/鱼精蛋白复合物偶联(参见Song等.(2005)Nat Biotechnol 23, 709-17) 0 第三种方法采用能特异性靶向癌细胞的抗体。在后一情况中，检验了特异性结合CSC的抗 体或靶向所有癌细胞的抗体。用流式细胞术鉴定靶向特定异种移植肿瘤中CSC或所有癌细 胞的抗体。检验了 6位不同患者的肿瘤产生的异种移植肿瘤以确定全身递送shRNA是否增 强了化疗(环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素)或放疗效果。产生异种移植肿瘤，当它们达到 0. 5cm大小时，用一种细胞毒药物和脂质体递送的偶联于去端肽胶原的实验性shRNA或对 照shRNA，或一种单克隆抗体/鱼精蛋白复合物治疗小鼠。治疗后继续检测肿瘤体积4个 月。各实验组至少包括10只小鼠，重复实验3次。此外，取出用对照或实验性shRNA治疗 的5只小鼠的肿瘤进行分析以确定shRNA在体内下调了感兴趣蛋白的表达。递送靶向诸如BMI1、MYB、PTEN、STAT等途径(CSC差别表达的miRNA)和其它途径 的shRNA以测定对乳腺癌干细胞存活和自我更新的影响。如上所述进行这些实验。例如全 身性递送在CSC中低表达的miRNA以测定其治疗潜力。实施例4下调微小RNA簇将正常与恶性乳腺干细胞相联系人乳腺癌包含具有回忆正常成人和胚胎干细胞特性的明显癌症干细胞群(BCSC)。 正常和恶性干细胞共有的自我更新和分化的分子调节剂尚未见描述。我们发现BCSC和非 致瘤性癌细胞差别表达37种miRNA。在正常乳腺干细胞、人乳腺癌干细胞和胚胎癌细胞 中，-miR-200c-14UmiR-200b-200a-429 和 miR-183-96_182 三簇下调。miR_200c 可调节已 知的胚胎干细胞自我更新和分化的调节剂S0X2的表达。此外，miR-200c和miR-183的表 达抑制了胚胎癌细胞的体外生长，消除了它们体内形成肿瘤的能力并抑制了乳腺癌细胞的 体外集落生成。这三簇miRNA的下调可提供联系乳腺癌干细胞和正常干细胞生物学的分子 连接。在本项研究中，我们鉴定到在正常小鼠乳腺干细胞、人乳腺癌干细胞和人胚胎癌 细胞中特异性下调的3簇miRNA。miR-200c和miR-183 (位于下调簇中2簇的miRNA)的表 达通过损伤干细胞/祖细胞的维持而抑制胚胎癌细胞的体外生长，抑制了它们体内的致瘤 性并强烈抑制乳腺癌细胞的集落生成。我们的结果表明下调这三簇miRNA调节了正常和恶 性干细胞的干细胞自我更新途径。结果人乳腺和胚胎干细胞的MiRNA模式分析.由于miRNA是参与正常胚胎和组织干细 胞自我更新和分化的关键调节剂，我们比较了人CD44+CD24_/<S谱系_乳腺癌细胞(TG细胞) 与其余_非致瘤性乳腺癌细胞谱系(NTG细胞)之间的miRNA表达模式。在许多乳腺癌患 者中，与其余谱系的乳腺癌细胞相比，小群CD44+CD24_/<S谱系_癌细胞在免疫缺陷小鼠中具 有高度致瘤性。CD44+CD24-/ 谱系_细胞具有干细胞样特性，例如自我更新和分化能力，可 从少至200个细胞产生原始肿瘤，而数万个其余谱系的非致瘤性癌细胞不能。采用多重实时PCR检测了分离自3个人乳腺肿瘤的TG细胞和NTG细胞中460种
24miRNA的表达。我们发现在分析的所有3个样品中，与NTG细胞相比，有37种miRNA在TG 细胞中上调或下调(图1A)。然后检测到总共11组人TG细胞和NTG细胞中有这37种差 别表达的miRNA表达，该分析证实这37种miRNA确实为差别表达(图1B)。三簇miRNA 中，miRNA-200c-141簇位于染色体12pl3上，miR-200b-200a-429簇位于染色体lp36上和 miR-183-96-182簇位于染色体7q32上，在人乳腺癌TG细胞中均下调(图1C)。例如，与 NTG 细胞相比，TG 细胞的 miR-200a、miR-200b 和 miR_200c 表达低 2-218 倍。据认为⑶44+CD24_m谱系_细胞是正常乳腺干细胞或早期祖细胞的对应恶性细胞。 类似地，胚胎癌细胞是生殖细胞产生的恶性细胞，它们共有多能干细胞的许多特性。因此， 检验了 Tera-2胚胎癌细胞的这些miRNA表达。值得注意的是，Tera-2细胞或不表达可检 测水平的各miRNA，或表达水平正好在可检测水平(图1D)。当表达水平与乳腺癌细胞相比 时，Tera-2细胞表达的所有这些miRNA比乳腺癌NTG细胞低至少4倍。miRNA种子序列的 作用是使miRNA指向其mRNA靶标。显然两组含有基本上相同种子序列的miRNA (miR-200c/ miR-200b/miR-429miRNA 和 miR-200a/miR-141miRNA)形成了 miR-200c_141 簇和 miR-200b-200a-429簇(图1C)。鉴于此种相似性和观察到的表达模式，所有这3簇miRNA 在乳腺癌CD44+CD24—M谱系-细胞和Tera-2胚胎癌细胞中的下调对维持癌细胞的干细胞功 能至关重要。MiRNA表达将正常乳腺发育与乳腺癌干细胞分化相联系.癌细胞与正常组织 干细胞功能的相似性提示，正常干细胞自我更新和/或分化途径的活化可解释与恶变 相关的许多特性。因此，我们检验了早期乳腺干细胞和祖细胞及更多的分化乳腺上皮 祖细胞中乳腺癌TG细胞和NTG细胞差别表达的miRNA表达。虽然仍然只部分了解小 鼠乳腺上皮的细胞体系(cellularhierarchy)，但已知CD24 + CD49f s CD29 s Sca-F小 鼠乳房脂肪垫细胞富含在体内能再生整个乳腺的乳腺干细胞。我们收集的⑶24 + CD49f髙CD45TD3rCD140aTerll9-细胞(MRU)富含乳腺干细胞，收集的CD24髙CD49f低 ⑶45_CD31TD140a_Terll9_细胞(MaCFC)富含更加分化的乳腺上皮祖细胞(图2A)。我们发 现与MaCFC相比，在人乳腺癌TG细胞中下调的所有这三簇miRNA在小鼠MRU细胞中也下调 (图2B)。这证明在乳腺癌TG细胞与NTG细胞之间差别表达的这3簇miRNA是正常乳腺细 胞发育途径的关键组分。MiR-200c 向 S0X2.通过 TargetScan 4. 2 预测 miR_200bc/429 的潜在分子靴 标。在潜在的靶标中，我们关注S0X2，因为它具有正统靶标标志性的关键保守核苷酸并且 已知它是调节其它类型干细胞(包括胚胎干细胞)自我更新和分化所必须。通过萤光素酶 报道试验评价了 miR-200c调节S0X2的3，UTR能力。采用不表达miR_200c和miR-429和 仅表达可检测水平miR-200b的HEK293T细胞。将S0X2的3，UTR靶位点克隆入pGL3_对 照载体中萤光素酶小基因的下游。用PGL3萤光素酶载体、pRL-TK Renilla萤光素酶载体 和miR-200c前体RNA共转染HEK293T细胞。我们观察到对于S0X2，萤光素酶活性被抑制了 60% (图3B)；而且，miRNA-200bc/429种子区的突变消除了 miRNA抑制S0X2表达的能力， 从而证明该靶序列对S0X2的特异性(图3A和3B)。还检验了 miR-200c调节内源性S0X2蛋白的能力。为此，我们用表达miR-200c的 慢病毒感染Tera-2细胞。用流式细胞术收集被感染的细胞。蛋白质印迹显示表达miR-200c 的细胞中S0X2蛋白表达降低(图3C)。相反，阴性对照-miR-30a和miR-183不调节S0X2蛋白表达。随后我们检测了收集自人原发乳腺癌样品的致瘤性CD44+CD24_m谱系_细胞(TG 细胞)和NTG细胞中的S0X2表达。如图3D所示，乳腺癌NTG细胞的S0X2蛋白表达明显低 于TG细胞。MiR-200c和miR-183体外抑制癌细胞生长.观察到相同的miRNA簇在正常乳腺 干细胞、致瘤性⑶44+⑶24" 谱系_乳腺癌细胞和胚胎癌细胞中下调，暗示这些miRNA是干 细胞关键功能，例如自我更新和/或分化的调节剂。实际上，近年业已证明miR-200家族 的miRNA通过抑制ZEBl和ZEB2 (E-钙粘蛋白的转录阻抑物)表达而防止了 EMT (上皮向间 充质的过渡)。EMT是干细胞的一种特性，与正常和癌症干细胞相关联。为测定这些miRNA 的一些表达如何影响细胞，我们用表达miR-200c或miR-183的慢病毒载体感染细胞。被 miR-200c或miR-183慢病毒感染的细胞的形态提示它们已分化(图4A)。实际上，用抗-神 经元特异性III类微管蛋白(Tuj-I)抗体染色显示被miR-200c感染的Tera-2细胞优先表 达有丝分裂后早期神经元的标记Tujl抗原，提示该miRNA诱导了神经分化(图4B)。我们发现被miR-200c或miR-183慢病毒感染，但不是被对照慢病毒感染的Tera_2 细胞显示生长迟滞(图4C)。miR-200c导致的生长迟滞强于miR-183，反映为所观察到的神 经发育强度(图4B和4C)。小鼠MMTV-Wnt-I乳腺肿瘤由腔上皮和肌上皮细胞及扩增的乳 腺干细胞库组成。我们用表达miR-200c或miR-183的慢病毒感染MMTV-Wnt-I鼠乳腺癌细 胞。被miR-183或miR-200c感染细胞的集落形成几乎受到完全抑制，与对照慢病毒感染的 细胞相比，miR-200c的集落数降低96%, miR-183降低94% (图5A)。正常乳腺干细胞/祖细胞(MRU，乳腺再生单位)和MMTV-Wnt-I乳腺癌干细胞，是 肌上皮细胞细胞角蛋白CK14和上皮细胞细胞角蛋白CK8/18双表型表达细胞。成熟上皮细 胞表达CK8/18或CK19但不表达CK14。肌上皮细胞表达CK14但不表达CK8/18或CK19。 对照病毒感染的乳腺癌细胞形成了大集落并表达CK14和CK8/18，偶有细胞表达CK19 (图 5B)，而被表达miR-183或miR-200c的病毒感染的细胞仅形成显示CK14水平低的小细胞聚 集体(图5B)。这些结果显示miR-183和miR-200c感染的乳腺癌细胞丧失了祖细胞的表 型，miR-183和miR-200c的表达诱导了乳腺癌干细胞的体外分化。miR-200c和miR-183抑制胚胎癌细胞的致瘤性.为测定miR_200c和miR-183对体 内癌细胞生长影响的意义，用表达miR-200c或miR-183的慢病毒或对照慢病毒感染Tera-2 胚胎癌细胞，通过流式细胞术收集被感染的细胞。然后将被感染的Tera-2细胞皮下注射入 免疫缺陷N0D/SCID小鼠。两个月后，我们观察到注射被对照慢病毒感染的50，000个Tera_2 细胞的3/3只小鼠明显形成了肿瘤，而接受miR-200c感染和miR-183感染的Tera_2细胞 的3只小鼠无一形成肿瘤(图6)。本文报道的结果证明miR-200c-141、miR-200b-200a-429 和 miR-183-96_182 在 正常乳腺干细胞、人乳腺癌干细胞和胚胎癌细胞中下调，S0X2表达受miR-200c调节。S0X2 是HMG-结构域蛋白家族的一员，与0CT4形成的复合物可结合DNA、调节转录并指导胚胎干 细胞和一些谱系的特异性干细胞(例如神经干细胞)的自我更新和分化。在本文中，我们 观察到miR-200c和miR-183表达还抑制了胚胎干细胞的体外生长、诱导它们的神经分化、 消除它们的体内肿瘤形成能力并抑制乳腺癌细胞的体外集落生成性能。因此，我们关于差 别miRNA表达的数据提供了癌症干细胞与胚胎干细胞之间的分子联系，以及对许多患者的 肿瘤中CD44+CD24Vis谱系_乳腺癌细胞亚群显示致瘤性增加的分子解释。
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我们的分析揭示有5种差异表达的miRNA下调、它们共有相同的种子序列、尚未绘 制不同染色体上的两簇图谱。这些miRNA家族的功能性丰余度可能反映了通过确保单一 突变不会干扰它们靶标的调节从而维持干细胞稳态和防止肿瘤的可靠机制。miRNA可调节 S0X2引起了人们的兴趣。实际上，S0X2与0CT4不仅为ESC的自我更新和维持多能性所必 须，而且是体细胞重新编程诱生多能干细胞(iPSC)的核心因子。考虑到这些观察以及报道 的S0X2与乳腺癌的联系，构成癌症干细胞和胚胎干细胞自我更新和分化基础的是共有广 泛的调节基因网络。这些研究描述的miRNA模式无疑指出了可能有许多其它因素使致命癌症与正 常干细胞功能相联系。预测程序，例如TargetscaM. 2提示可能有受miRNA-200c-141、 miR-200b-200a-429和miR-183-96_182调节的许多其它基因在功能上对于干细胞至关重要。我们筛选中鉴定到的其它miRNA可能对致瘤性也至关重要。例如，我们的数据 分析还表明，乳腺癌干细胞的miR-155表达比其它癌细胞要高。值得注意的是，最初将 miR-155鉴定为是B细胞淋巴瘤的致癌BIC基因座的产物，其高水平表达与肺腺癌患者预后 差相关。当血液系统持续表达miR155时，观察到异常增殖和脊髓发育不良。因此，miR-155 表达增加也是乳腺癌干细胞增殖比其它非致瘤性对应细胞更快的标志。EMT是一种广泛分布的发育程序，可调节许多组织和器官的细胞迁移，与正常和恶 性乳腺干细胞功能相关。近年的研究显示在⑶44+⑶谱系-乳腺癌细胞中，包括SNAI2 在内的EMT途径诸组分表达最高。我们在此证明，在人乳腺致瘤性⑶44+⑶谱系_细 胞中miR-200家族miRNA受到强烈抑制。miRNA的miR-200家族抑制了用作EMT诱导物的 ZEB 1和ZEB2的翻译。miR-200家族miRNA靶向ZEBl和ZEB2的3，UTR中多个位点，抑制 ZEBl和ZEB2上调E-钙粘蛋白的表达而抑制EMT。总之这些发现证明miR-200家族miRNA 通过调控正常和恶性乳腺癌细胞中的EMT程序而成为干细胞功能的重要调节剂。小结，本发明的发现提供了正常乳腺干细胞/祖细胞、⑶44+CD24_/is谱系_乳 腺癌细胞与胚胎癌细胞之间的强效分子联系。人乳腺癌细胞亚组和正常乳腺干细胞中 miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141显著下调以及miR_200c能调节自我更新基因的 事实，提示正常干细胞和CD44+CD24_^谱系_乳腺癌细胞共有调节干细胞功能(例如自我更 新和EMT)的分子机制。实验步骤细胞培养.将人胚胎肾脏(HEK) 293T细胞维持在含10% FBSU00U/mL青霉素、100 μ g/mL链 霉素和250ng/mL两性霉素B(英杰公司(Invitrogen))的Dulbecco改进Eagle培养基 (DMEM)中，5% CO2和37°C下培养。人胚胎癌细胞系Tera-2 (HTB-106)购自ATCC，在含100 单位/毫升青霉素G、100 μ g/ml链霉素和250ng/ml两性霉素B和补加15%胎牛血清的改 进McCoy培养基(英杰公司)中生长，5% CO2和371下培养。制备单细胞悬液和流式细胞检测.获得斯坦福大学研究伦理委员会(Research Ethics Boards at Stanford University)和加利福尼亚州希望癌症中心城市(City of Hope Cancer Center in California)批准，原发性乳腺癌标本得自知情同意患者。用机 械方法解剖分离肿瘤标本，与200U/ml LiberaseBlendzyme 2 (罗氏公司(Roche)) —起培育。如前文所述进行细胞染色和流式细胞检测。将用机械方法解剖分离的小鼠正常乳腺标 本与200U/ml LiberaseBlendzyme 4(罗氏公司)一起培育。如前文所述进行细胞染色和 流式细胞检测。将胚胎癌细胞移植入N0D/SCID小鼠.用1_3 %异氟烷麻醉N0D/SCID小鼠(杰 克逊实验室(Jackson laboratory) )0将胚胎癌细胞悬浮于Matrigel (BD生物科学公司 (BD Biosciences))，皮下注射入N0D/SCID小鼠。在斯坦福大学实验动物管理行政委员会 (Administrative Panel on Laboratory AnimalCare of Stanford University)批准下进 行所有实验。多重实时PCR试验.采用前文描述的BD FACSAria分选仪分离11组⑶44+CD24" 谱系_致瘤性和其余谱系非_致瘤性人乳腺癌细胞。通过多重实时PCR进行miRNA模式 分析。对于RNA制备，将100个致瘤性CD44+CD24-/ 谱系_人乳腺癌细胞和其它非-致瘤性 谱系-癌细胞作双重分选进入Trizol (英杰公司)，按照生产商的方案提取RNA。糖原(英 杰公司)用作沉淀运载体。如前文所述进行RT、前-PCR和多重实时PCR。简言之，用466 组第二链合成引物进行多重逆转录反应。然后用466组正向引物和通用反向引物进行多重 前-PCR反应。将多重前-PCR产物稀释8倍，等份加入384孔反应平板，分别检测各miRNA 的丰余度。各引物和探针含有为各miRNA专门指定的邮编序列(zip-coded sequences)以 提高各反应的特异性，因此甚至miRNA中的微小序列差异也能放大和检测到。该方案专用 于检测成熟miRNA并且可靠，因为RT-PCR和微阵列的miRNA检测值相一致。结果按小的核 RNA (C/D盒96A和C/D盒84)表达标准化。两群细胞之间miRNA表达的差异计算为；ACt = 标准化Ct (致瘤性细胞)-标准化Ct (非致瘤性细胞)。质粒载体和诱变.用PCR扩增pGEM-T-Easy载体(普罗迈格公司(Promega))的 多个克隆位点，将其插入到PGL3对照载体(普罗迈格公司)的XbaI位点(pGL3-MC)。用 HEK293T细胞的cDNA作为模板，以PCR扩增S0X2 3，UTR的553bp片段(对应于NM_003106. 2 的1620-2172位置)，将其克隆入pGEM-T-Easy载体中。将S0X2 3，肌1 产物克隆在？61^-]\ 载体萤光素酶基因的3’端。测序所有产物。用斯特拉塔基因公司的快变定点诱变试剂盒 (QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit, Stratagene) ^h S0X2 白勺 3' UTR ft/^m 定的miR-200c靶序列突变。萤光素酶报道基因分析.转染前一天，将HEK293T细胞以每孔IXlO5个细胞 接种48-孔板。按照生产商使用说明书，用脂质转染胺(Lipofectamine) 2000 (英杰公 司)进行所有转染。用含有人S0X2的3，UTR的320ng pGL3萤光素酶表达构建物、40ng pRL-TK Renilla萤光素酶载体(普罗迈格公司)和50nM hsa-miR-200c前体(安毕公司 (Ambion))转染细胞。转染后48小时，裂解细胞，用普罗迈格公司的双-萤光素酶报道试验 系统(Dual-LuciferaseIteporter Assay System)检测萤光素酶活性，报道基因试验系统按 Renilla萤光素酶活性标准化。所有实验一式两份进行，合并三次独立实验的数据。慢病毒产生.用HEK293T或MCF7细胞的cDNA作为模板，以PCR克隆miR_200c和 miR-183的序列，包括茎环结构和侧接基因组序列的上游和下游200-300碱基对。将产物克 隆入pLentiLox 3. 7载体的HpaI和XhoI位点。为产生对照载体，通过XbaI和HpaI消化 除去U6启动子序列，与Klenow酶一起培育并连接。如Tiscornia等.(2006). Nat Protoc 1，241 -245所述产生了慢病毒。
蛋白质印迹.用表达miRNA的慢病毒感染Tera-2细胞，以流式细胞术收集被感染 的细胞。如上所述通过流式细胞术收集人乳腺癌细胞。用SDS样品缓冲液(50mM Tris-HCl pH 6. 8、2% SDS、10%甘油、5mM EDTA、0. 02 %溴酚蓝、3 % β -巯基乙醇)裂解收集的细 胞。用SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品后转移至聚偏(二)氟乙烯滤膜(阿玛西 亚公司(Amersham))上。用0. 05%吐温20/PBS配制的5%脱脂奶封闭后，培育滤膜与 1 2000 (对于原发性乳腺癌样品作1 1000稀释)稀释的抗-S0X2多克隆抗体(米利 波公司(Millipore))或1 2000稀释的抗-β-肌动蛋白抗体(圣克鲁兹生物技术公司 (Santa Cruz Biotech))。然后加入1 10，000稀释的过氧化物酶-偶联的驴抗-兔或绵 羊抗-小鼠IgG抗体(阿玛西亚公司)，用圣克鲁兹生物技术公司的蛋白质印迹鲁米诺试剂 显色。乳腺癌细胞集落形成试验.用200U/ml Liberase Blendzyme 2(罗氏公司)消 化小鼠MMTV-Wntl肿瘤，如(Cho等.，2008Stem Cells 26，364-371)所述解剖分离。用 抗-CD31、CD45和CD140a抗体染色细胞，用流式细胞术去除谱系阳性细胞。通过自旋感染 (spin 丨1^6(^丨011)2小时，然后371在补加了5%85六、2%热灭活卩85、1 50 B27、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、10 μ g/mL 胰岛素和 10 μ g/mL 肝素的 DMEM/F12 中培育 2 小时，用 20M0I 表达miRNA的慢病毒感染15，000个细胞。用相同培养基洗涤被感染的细胞两次，然后用含 5% FBS的Epicult培养基(干细胞技术公司(Stemcelltechnologies))替换该培养基。将 被感染的细胞接种含30，000个经过辐照的3T3饲养细胞层的24-孔板。接种后24小时， 再次用不含血清的Epicult培养基替换原培养基，5% CO2和37°C下培育细胞6天。免疫荧光.用表达miRNA的慢病毒感染Tera-2细胞，以流式细胞术收集被感染的 细胞。IX IO4个细胞生长在24-孔板的孔中，用PBS (20mM磷酸钾pH 7. 4,150mM NaCl)洗 涤两次。用甲醇/丙酮(1 1)固定细胞，用0. 吐温20/PBS洗涤两次，在曲通X/ PBS中培育30分钟。用PBS配制的4%山羊血清封闭细胞，与第一抗体(1 750稀释的 抗-Tujl单克隆抗体(康万斯公司(Covance)))培育后，再用0. 吐温20/PBS洗涤三次， 然后用1 300稀释的Alexa Fluor 488-偶联抗-小鼠IgG抗体(英杰公司)染色。采 用BD法玛金公司BrDU流式试剂盒(BrDU Flow Kits, BD Pharmingen)的固定液染色乳腺 癌细胞。用PBS配制的4%山羊血清封闭细胞，与第一抗体(1 200稀释的兔抗-细胞角 蛋白14(康万斯公司)，大鼠抗-细胞角蛋白19和大鼠抗-细胞角蛋白8/18抗体(开发 研究杂交瘤库(Developmental StudiesHybridoma Bank), DSHB)的 1 200 稀释液)一起 培育后，再用0. 吐温20/PBS洗涤三次，然后用1 200稀释的Alexa Fluor 488-偶联 抗-大鼠IgG抗体和1 200稀释的Alexa Fluor 594-偶联抗-兔IgG抗体(英杰公司) 染色。用荧光显微镜(Leica DMI 6000B)观察着色细胞。实施例5miR-200抑制正常乳腺过度生长如图7所示，miR-200抑制正常乳腺干细胞。用表达miR-200c的慢病毒或对照慢 病毒感染50，000个小鼠正常乳腺细胞后，将其注射入断奶年龄小鼠的清洁乳房脂肪垫中。 注射后6周，分析表达GFP的乳腺树(mammarytree)的生长。图7说明对照慢病毒感染的 乳腺细胞形成了表达GFP的乳腺树，如2/5分支形成所示。相反，GFP表达(表明miR-200c 表达)形成了 0/5分支。
还发现miR-200c和miR-183抑制了人乳腺癌生长。分离人乳腺异种移植肿瘤的 10，000个致瘤性癌症(TG)细胞，用表达miRNA的慢病毒或对照慢病毒感染后注射入NOD/ SCID小鼠的乳房脂肪垫中。注射后16周分析肿瘤发生率。在对照动物中，4/5只动物有 肿瘤，而表达miR-200c细胞(注射的动物)中，1/5有肿瘤；表达miR-183细胞(注射的动 物)中，0/2有肿瘤。
权利要求
一种鉴定癌症干细胞的方法，包括使样品与至少一种选自以下miRNA的特异性试剂接触miR 214；miR 127；miR 142 3p；miR 199a；miR 409 3p；miR 125b；miR 146b；miR 199b；miR 222；miR 299 5p；miR 132；miR 221；miR 31；miR 432；miR 495；miR 150；miR 155；miR 338；miR 34b；miR 212；miR 146a；miR 126；miR 223；miR 130b；miR 196b；miR 521；miR 429；miR 193b；miR 183；miR 96；miR 200a；miR 200c；miR 141；miR 182；miR 200a；miR 200b；其中与非致瘤性细胞相比，癌症干细胞表达所述至少一种miRNA的水平发生改变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过原位杂交定量测定miRNA表达。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过实时聚合酶链式反应进行定量测定。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者是人。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述人正经历癌症治疗。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括使样品与受所述miRNA调节的 蛋白质的特异性试剂接触，其中与非致瘤性细胞相比，癌症干细胞表达所述蛋白质的水平发生改变。
7.一种筛选有效抵御CSC的候选化疗剂的方法，该方法包括使所述药剂与CSC接触，和测定所述药剂改变至少一种选自以下miRNA胞内水平的效果miR-214 ；miR-127 ； miR-142-3p ；miR-199a；miR-409-3p ；miR-125b ；miR-146b ；miR-199b ；miR-222 ； miR-299-5p ；miR-132 ；miR-221 ；miR-31 ；miR-432 ；miR-495 ；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ； miR-34b ；miR-212 ；miR_146a ；miR-126 ；miR-223 ；miR_130b ；miR_196b ；miR-521 ；miR-429 ； miR-193b ；miR-183 ；miR-96 ；miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ； miR-200bo
8.一种改变癌症干细胞致瘤性的方法，该方法包括改变所述细胞中表达的微小RNA活性，其选自miR-214 ；miR-127 ；miR-142-3p ； miR-199a ；miR-409-3p ；miR-125b ；miR-146b ；miR-199b ；miR-222 ；miR-299-5p ；miR-132 ； miR-221 ；miR-31 ；miR-432 ；miR-495 ；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ；miR-34b ；miR-212 ； miR-146a ；miR-126 ；miR-223 ；miR-130b ；miR-196b ；miR-521 ；miR-429 ；miR-193b ； miR-183 ；miR-96 ；miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ；禾口 miR_200b。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微小RNA选自miR-200c、miR-141、 miR-200b、miR-200a、miR-429、miR-182、miR-96 和 miR-183，其中所述方法包括上调活性。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药剂包含选自以下的miRNA基因序列 miR-200c、miR-141、miR-200b、miR-200a、miR-429、miR-182、miR-96 和 miR-183，该序列操 作性连接于在所述细胞中有活性的启动子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述改变步骤在体外进行。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述改变步骤在体内进行。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述癌症干细胞是乳腺癌干细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌干细胞是CD44+CD24-/ 谱系。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述改变步骤包括给予所述细胞降低所述细胞中所述miRNA水平的药剂。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述药物是反义寡核苷酸。
全文摘要
本文提供乳腺癌干细胞(BCSC)的微小RNA标记。所述标记是与正常对应细胞相比，在BCSC中差别表达的多核苷酸。所述标记的应用包括用作治疗性干预的靶标；用作药物开发和乳腺癌及BCSC细胞群体相关诊断或预后方法的靶标。与正常乳腺上皮细胞或并非癌症干细胞的癌症细胞相比，BCSC具有某些miRNA表达较低的表型。
文档编号C12Q1/68GK101981206SQ200980112473
公开日2011年2月23日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年2月1日
发明者M·克拉克, Y·西莫诺 申请人:利兰·斯坦福青年大学托管委员会