专利名称：纤维素或者木质纤维素生物质的预处理方法
技术领域：
本发明涉及纤维素或木质纤维素生物质的预处理，例如在糖化、发酵和乙醇回收 之前的预处理。
背景技术：
木质纤维素生物质是一术语，指的是一包括纤维素、木质素和半纤维素的植物材 料。这三种细胞壁组分具有不同的量，这取决于植物种类、养分有效性和气候条件。纤维素 是植物细胞壁的主要结构组分，聚合度范围为500至20000。纤维素分子是线性的、无支链 3，1_4连接葡萄糖聚合物，具有在内部或相互之间形成氢键的强烈倾向。纤维素分子束聚 集以形成微纤维，微纤维中高度有序(结晶的)区和较少有序(无定形的)区相间。微纤 维再组成纤维，并最终组成纤维素纤维。由于其纤维结构和强氢键，纤维素具有非常高的强 度，不溶于大多数溶剂。半纤维素是杂多糖，其由各种形成植物细胞壁的非纤维质多糖组分的单体所形 成。大多数的一般单体是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖(己糖)、木糖、海藻糖和阿拉伯 糖(戊糖)，还包括葡萄糖和半乳糖的糖醛酸(Eaton和Hale，1993b)。大多数的半纤维素 的聚合度大约在50-300，大大低于纤维素。半纤维素可以分为三个主要族，木聚糖、甘露聚 糖和半乳糖体，以其骨干聚合物命名。木质素是一种具有非常高分子量的三维大分子。木质素是无定形的、长的交联 生物聚合物。木质素通过三个单体丙苯单元的聚合而合成芥子醇、P"香豆醇和松柏醇 (Boer jan等，2003)。木质素通过与纤维素微纤维结合在一起而提供强度和硬度。其性质 上疏水，影响植物细胞壁的膨胀性能，使血管系统的水消耗最小化，并且能提供抗酶催促解 性。纤维素类生物质是一术语，指的是主要包括纤维素的生物质。例如包括纸、废弃棉 纺织品或者棉花加工废弃物。木质纤维素在生物技术和遗传工程的UN FAO Glossary中被定义为“木质素、半纤 维素和纤维素的组合，形成植物细胞壁的结构架构”。参见FAOResearch and Technology Paper No. 7, accessed 7April 2008 网 土ih ;http://www. fao. org/D0CREP/004/Y2775E/ Y2775E00.HTIvno已有与包含生物质的木质素的量相关的从纤维素生物质到木质纤维素生 物质的组成的图谱(以及纤维素、半纤维素和其他组分的比例)。这包括从“纤维素”生物 质中的非常低的含量(例如小于重量百分比木质素)至木质纤维素生物质中的相对高 的含量(例如木头中30%重量百分比的木质素)的范围。通常木质纤维素生物质含有高 于4%的木质素，即低于4%的木质素生物质在性质上主要被认为是“纤维素”，超过7%其 性质更多的是在“木质纤维素”范围。对木质纤维素进行糖化(糖类的水解)和发酵获得的乙醇产物具有相当高的商 业价值。糖化时木质素、其它酚类化合物、果胶、半纤维素组分的提取也是有价值的，以提 高作为动物饲料的木质纤维素生物质的价值(Pu等，2008 ；Ragauskas等，2006 ；Rogers等，2007 ；Sun 等，2007 ；ffyman, 2002)。已经存在这各种对生物质进行预处理的方法。通常的处理如下生物预处理生物预处理使用真菌进行微生物脱木质化(Dorado等，2001 ； Gutierrez等，2001 ；Helmy和El_Meligi，2002)，典型的为使用白腐菌，例如变色栓菌和黄 孢平革菌。然而，真菌降解是一个缓慢过程，大多数真菌进攻的不仅是木质素，还有纤维素， 因此导致随后可使用的总糖的消耗。物理预处理物理预处理可以分为两大类机械的(磨碎)和非机械的(例如高压 蒸煮、高能辐射和热解)。机械预处理过程中，物理力(例如剪切或压碎)将木质纤维素变 细为更细粒料。这些物理力能降低纤维素结晶度、微粒大小和聚合度并提高体积密度。这 些结构改变获得一种能更易于随后处理的材料，但是机械处理耗能且耗时，因此其本身不 实用。非机械物理预处理方法也可以提高可消化性，但是具有类似的缺陷。物理化学预处理蒸汽爆发，氨纤维爆炸(AFEX)和二氧化硫催化蒸汽爆炸是物理 化学预处理的例子。蒸汽爆炸中湿木质纤维素被加热至高温(大约250°C )，快速释放压力， 导致粒径降低。高温结合一些化学处理能从半纤维素中产生乙酸，因此存在一些生物质的 自水解(Nigam，2002)。这些改变能使得随后处理更易于操作，但是剧烈条件也产生了降解 产物，这些降解产物能抑制水解和发酵。这些产物可以通过用水清洗而移除，但是这也移除 了水溶性的半纤维素，这在一些情况下是不期望的。因此，这些方法具有缺陷。化学预处理许多化学处理被用来改变生物质细胞壁的结构，以使糖类组分更易 于糖化。例如包括使用石灰水或氢氧化钠、氨水、稀酸、氧化剂和溶剂抽提剂，在这些所有的 预处理方法中，生物物质的本身性质影响方法的总效率。化学预处理还可能产生抑制剂，这 对后续糖化和发酵步骤产生负面影响。因此，需要替代的预处理方法。本说明书中所列举或讨论的明显在先公布文献不可以就被视为承认那些文献是 现有技术或公知常识的一部分。
发明内容
我们发现褐腐(BR)朽木菌的机理(先前背景中未研究过)可以用作生物“预处 理”(参见图1)，例如在可控条件下(批量生物质接种、糖化、发酵)对木质纤维素或纤维素 原料(例如软木、谷类稿杆、巨草(giant grasses)、废纸、废棉纺织品或者棉处理废弃物) 提供增强的糖化以及糖类和木质素的利用。术语“褐腐”也用在植物病理学领域，指的是一种成熟或者熟成水果上的一种腐 烂。这种类型腐烂的病原生物与普遍的导致木材和相关的木质纤维素生物质褐腐的担子菌 类真菌不同且属于不同的真菌系，其中木质纤维素生物质是本发明的课题。本发明的第一方面提供了木质纤维素降解褐腐真菌在预处理木质纤维素或纤维 素生物质的方法中的用途，以从生物质中利用糖类或木质素。例如，可以在进一步的加工中 使用在褐腐真菌预处理后剩下的木质素，以生产具有显著经济意义的化学产品，或者燃烧 以为乙醇生产过程制造能量(Pu等，2008 ；Ragauskas等，2006)。本发明第二方面提供了一种预处理木质纤维素或纤维素生物质的方法以利用生 物质中的糖类或木质素，方法包括对木质纤维素或纤维素生物质接种木质纤维素降解褐腐真菌，以及在促进木质纤维素降解褐腐真菌生长的条件下培养所述接种过的生物质。因此， 接种过的生物质可以在温度2-45°C或50°C、优选为5-40°C或10_35°C、以及木材水份含量 高于纤维饱和点但是细胞腔孔隙不饱和的条件下培养。相关的水份含量取决于生物质类 型例如，理想的热带硬木和谷类稿杆之间的差异非常大。对应于上述标准的典型的相关含 水量是基于烘干在25-150%之间，例如在软木中为大约50%。含水量以及可用的氧都是褐 腐真菌生长的关键因素，因为它们都是绝对耗氧微生物。生物质的含水量可以通过自然风 干燥、人工干燥、添加水例如通过喷雾或者添加液体真菌培养液来进行控制。含水量通常通 过重量分析测定，通过一些电导率或电阻率仪器能测量不高于大约40-50%的含水量，高于 这个范围将变得不准确。木质纤维素降解褐腐真菌引起植物细胞壁的纤维素和半纤维素组分的快速的大 量的解聚，以及有限的，但是明显的，木质素组分的改性，通常在褐腐过程的早期通过脱甲 氧基进行(NilSSOn，1988)。对纤维素的作用的机理被认为是通过羟基自由基或者可能是 由芬顿体系所产生的等效的金属-氧进行的，草酸也参与而在通过褐腐真菌进行的纤维素 解聚中起了重要作用(k0enigS，1974)。值得注意的是即使最小量的纤维素酶也太大而不 能在细胞壁的S3和S2层穿透木材孔，即使是在晚期的腐朽过程(Green和Highley，1997 ； Srebotnik和Messner，1991)。因此，推测褐腐木质纤维素降解真菌的菌丝释放低分子量的 高扩散的介质，以引起观察到的细胞壁聚合物的先于随后的酶攻击(导致由这一酶作用的 产物微生物的同化)的早期解聚。过氧化氢(或相关的化学试剂)及其与木材中二价铁的 反应已经被提出作为一种可能机理，通过该机理，在纤维素链的一些葡萄糖吡喃糖环中引 起氧化断裂的瞬态自由基可以由褐腐真菌所产生(Green和Highley，1997)。这样的试剂将 破坏微晶结构，使得纤维素酶随后能在S3层和内腔之间的接口处起作用。BRF降低了他们的直接环境的pH，这被认为促进了一些非酶系统活性，这些非酶 系统被推测认为具有和纤维素酶活性一样的活性(Goodell，2003a)。细胞壁的全纤维素组 分的非常快的解聚导致腐朽木材的强度的快速降低(Eaton和Hale，1993b)。在一个实施方式中，进行培养以便本质上只发生褐腐真菌腐烂机理的非常早的阶 段(解聚)，本质上不进行同化阶段。通过以这种方式进行培养，认为提高了糖类和木质 素组分的可获得性，而不被褐腐真菌通过随后的同化而降低糖类的量。因此，例如，在木质 纤维素降解褐腐生长的条件下的培养可以在生物质中的葡萄糖实质上消耗发生前终止，例 如，在小于 50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或者4天后，优选的在大约10-25天，温度为大约10-25°C，且最佳的含水量。这在下文中继 续讨论。预处理被认为改进了糖类以及木质素的易获得性(例如，从改善碱溶解度来看)。 可以认为褐腐攻击的早期阶段，如以上实施方式中，木质素更易获得。通过木质纤维素降解褐腐(BR)意味着腐烂，其主要通过全纤维素的大量解聚而 吸收植物细胞壁的糖类组分(Nilsson，1988)。暴露在褐腐中的木材变得更易溶解于氢氧化 钠的稀溶液中(Nilsson，1988)。当含水量超过纤维饱和点(基于烘干大约30%含水量)， 但是细胞腔空隙不饱和，而且温度在5-40°C、优选为10-35°C时(取决于物种)，在木材中开 始褐腐腐烂(Goodell，2003a)。褐腐通常由担子菌类真菌引起，但是其他真菌也可能具有褐腐腐烂性质。
褐腐真菌主要在植物细胞腔内生长。褐腐真菌明显偏爱降解软木木材，尽管有许 多它们对硬木木材和其他木质纤维素生物质起作用的例子。由于能引起木质素降解，褐腐型真菌能容易的从下列本领域所熟悉的公认性质中 被识别出。通常担子菌门的一员。通过消耗生物质的糖类组分和在降解循环结束时遗留木质素样材料作为残留 物，能引起木材中大量质量损失(典型的在软木中，同样也在其他木质纤维素材料中) (Goodell, 2003a ；Green 和 Highley，1997)。降解模式的微形态表明距真菌菌丝一定距离的木质纤维素材料的细胞壁发生了 大量的解聚_腐烂不局限于菌丝(Eaton和Hale，1993b)。木材的褐腐降解过程中，发生了颜色变黑，从浅褐色/奶油色至褐色/深褐色，并 且干燥时，木材样品以典型的立方体裂解模式破碎(Goodel 1，2003a)。结合使用根据上述的观察、质量损失评估、腐烂木材的强度性质、化学分析和显微 镜技术可以容易的检验一未知菌丝的是否具有作为一木质纤维素(木材)降解褐腐真菌的 性质。木质纤维素降解褐腐真菌的例子包括如下(Desch和Dinwoodie，1996 ；Eaton和 Hale,1993b ；Goodell,2003a ；Green 和 Highley，1997 ；Nilsson,1988)鲑色泊氏孔菌(Postiaplacenta)，密粘褶菌(Gleophyllum trabeum)，篱边粘褶 菌(Gleophyllum s印arium)，豹皮香菇(Lentinus 1 印ideus)，凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana), Coniophora arida, Coniophora eremophila Tyromycespalustris, zP
菌(Serpula lacrymans),栋迷孑L 菌(Daedalea quercina),狭擔薄孑L 菌(Antrodia serialis),波状薄孑L菌(Antrodia sinuosa),威兰薄孑L菌(Antrodia vaillantii),黄薄 孑L菌(Antrodia xantha), Meruliporia incrassate,耳状网裙菌(Paxillus panuoides)， Amyloporia xantha，样录Ij管菌(Piptoporusbetulinus)，获|菌(ffolfiporia cocous)。在木材腐烂中最常见的为鲑色泊氏孔菌(Postia placenta)，密粘 裙菌(Gleophyllum trabeum),凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana),干朽菌 (Serpulalacrymans)。本发明中所使用的优选的BR真菌，特别是与软木相关的，包括凹痕粉孢革菌 (Coniophora puteana)禾口 娃色泊氏孑L 菌(Postia placenta)。样剥管菌(Piptoporus betulinus)是被认为可以用于桦木的BR真菌的一个例子。可以使用BR真菌的混合物，这 对本领域技术人员是公知的。有几种可能的不同“系统”，用于为木片或其它形式的木材，例如原木、木盘等，提 供接种物，例如真菌菌丝/孢子在水介质中的悬浮液，通过喷雾或倾注以及搅拌/混合施 用；一种固体/半固体“小球”的接种物(例如，移植小麦/大麦等谷粒与木片“干式混合”; 在水介质中的孢子悬浮液)；一种褐腐感染的木片。我们认为对生物质例如软木的BR预处理能提供商业优势。据估计BR预处理能促 进从软木和其他纤维素或木质纤维素生物质中高的糖释放，或者可选择的使得处理链中的 其它步骤成本更低/能耗小。在一“组合”方法中，BR预处理可以结合使用其他形式的预处 理，例如生物质的研磨、蒸汽爆炸或者酸解。能量节约(且降低了温室效应气体排放)、降低 了处理时间、或者增加了乙醇产量中的至少一种改进是BR预处理的一个直接结果。优选的
6软木是辐射松和欧洲赤松。预处理后，通常使用1)酶或2)稀酸或3) —些其它糖化步骤对生物质进行糖化处 理。然后通常将糖溶液发酵成乙醇。不同的是同时进行糖化和发酵，两个步骤在“一个容 器”中进行。然后分离废水/残留物。BR预处理被认为能导致木质纤维素或纤维素生物质的解聚，消耗非常少的能量或 材料，因此，与现有的物理和化学预处理方法相比，在下游的糖化处理中所使用的能量和/ 或处理化学药品的量方面具有潜在的相当优势。由于较温和的反应条件，纤维素的酶糖化相对于稀酸水解具有潜在优势。目前通 过酶方法生产乙醇的最大花费是酶的成本。US DOE进行的研究专注于改进所使用的酶以 及大量和以降低的价格生产酶。假设US DOE预测的酶的价格与它们现有价值相比显著降 低，糖化中的预处理步骤预计花费为从木质纤维素生产乙醇的总生产成本的大约20%。这 仅次于生物质本身的花费(成本的大约35%)。而使用BR预处理能降低后续的糖化步骤 的花费。BR预处理可以在乙醇生产装置上进行，作为他们的操作的一部分，或者，可选择 的，在靠近生物质采伐位置的“现场”进行。后者中，通过在运送至乙醇工厂前在靠近生物质 采伐位置处的能量致密化和降低含水量，“分散式”方法能潜在的节约运输能量。“现场”BR 的使用不期望能引起任何与BR微生物的“逃脱”相关的问题，因为这些微生物通常自然的 存在于环境中(尽管含量太低且易变而不能用在本发明中)。木质纤维素或纤维素生物质优选为软木，例如松木或杉木，但指的是包含植物生 物质的任何纤维素。这一软木生物质可以通过许多方式获得，例如，特定的长成的生物质 庄稼，林业生产的残余物，木材加工处理的副产品，废纸或包装材料或者培植树木的“废弃 物”。木质纤维素或纤维素生物质可以是例如硬木、芒草、竹子、谷类蒿秆、玉米、大米或者 小麦废弃物、油棕废弃物、甘蔗渣、废弃包装材料例如硬纸板、任何纤维素废弃物、纺织品和 纸。如上文所述，在木质纤维素降解褐腐生长的条件下的培养可以例如，在小于50、 40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或者 4 天后终 止，优选的在大约10-25天，温度为大约10-25°C、且最佳的含水量，或者在生物质中的葡萄 糖实质上消耗发生前终止。培养可以例如被开始下一阶段的处理如糖化所终止，或者通过 降低或提高温度终止，例如通过使用流经生物质堆的蒸汽管或者冷水管；或者通过提高或 (更典型的)降低含水量来终止培养。需要培养的时间长短取决于例如培养中的温度和湿 度，以及基板、基板的物理形态和存在的BR真菌的类型。培养需要的时间长短可以使用一 监视系统来分析生物质的聚合度降低和生物质的质量损失来决定，监视系统例如为凝胶渗 透色谱。这些有利于糖化作用的参数特征值(对特定生物质类型的试验所建立)和/或从 木质纤维素或纤维素生物质中释放的木质素或其他组分可以用于过程监视。可选择的与期 望的糖化作用或其他效果相关的BR处理监视参数例如为糖的化学分析、pH监视或光谱分 析。操作可以利用图或表设置在不同条件下特定的基板和BR真菌的期望的腐烂过程，结合 评估本地条件即温度、湿度、基板状态等来管理BR过程或通过基于先前所用的试验例如监 视系统或先前的对预处理过的生物质的后续处理结果进行经验预测。可以使用类似于实施 例1中所使用的方法。
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BR预处理可以有利于对相对大的木片(大约IOx 5x 30mm)进行。这将降低生物 质所需要的机械处理量并因此减少所需要的能量。我们认为褐腐预处理可以用于相当大范 围的木片，还可以用于“整”木，例如可锯木边料、木质纸浆“卷”等。褐腐预处理还可以应 用于其他种类的纤维素和木质纤维素生物质，例如谷物秸秆、竹材、芒草、纸“废弃物”等，这 些都具有不同的用于处理的最佳尺寸等，一些不需要破碎。作为一个实施例，期望的BR “早期”可以为直至当质量损耗小于材料的烘干质量 的5、10、15%。实施例1中图表明在15天，质量损耗大约7%，并且从此成线性变化，此时 糖化试验中的葡萄糖释放为最大(“稳定”)水平。超过这一时间(在我们选择的条件下)， 质量损耗增加，但是葡萄糖产量开始下降。这两个参数质量损耗和葡萄糖产量可以用作衡 量BR预处理过程已经至其最佳水平。本文所弓I用的任何公开文献在此都通过弓I用引入本文。
本发明现在结合所附的非限制性的附图和实施方式进行阐述。图1 生物质至乙醇的处理步骤；图2 暴露在褐腐真菌凹痕粉孢革菌下的欧洲赤松边材块的基于烘干重量的质量 损失。所有结果以平均值士标准误差表示；图3 暴露在褐腐真菌鲑色泊氏孔菌下的欧洲赤松边材块的基于烘干重量的质量 损失。所有结果以平均值士标准误差表示；图4 从糖化实验中获得的葡萄糖的两个独立试验，葡萄糖产量为欧洲赤松在暴 露在褐腐真菌凹痕粉孢革菌下后的烘干重量(ODW)的百分比。所有结果以平均值士标准 误差表示；图5 从糖化实验中获得的葡萄糖占欧洲赤松在暴露在褐腐真菌鲑色泊氏孔菌下 后的烘干重量(ODW)的百分比。所有结果以平均值士标准误差表示；图6 辐射松边材块在暴露在一系列木材移植真菌之后获得的葡萄糖。释放的葡 萄糖以生物质的总烘干重量(ODW)的百分比显示。n = 3(每个包括8个均勻的木块)。所 有结果以平均值士标准误差表示；图7 从磨碎的生物质材料中测得的暴露过的辐射松的木材ρΗ，η = 3 (每个包括 8个均勻的木块)。所有结果以平均值士标准误差表示；图8 与未暴露的木块相比，在暴露在两种褐腐真菌后磨碎8个辐射松小块所需要 的能量的差异。所有结果以平均值士标准误差表示。
具体实施例方式实施例1 使用褐腐真菌在对软木(欧洲赤松)生物质进行糖化前进行预处理的 糖产量的优化这里我们检验欧洲赤松(Pinus sylvestris) 一段时间内的由BR真菌引起的降解 度以及褐腐腐烂过程的早期阶段对从松木产生葡萄糖的效果。选择两种典型的BR真菌来 分析鲑色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌。这些真菌被用在纯培养真菌腐烂测试中以检测木材 的烘干质量损失程度作为降解度的测量。
从大约150mm直径的风干松木原木上横切下松木边材块(大约5x 30x 10mm)。对 这些木块进行标记、称重并通过伽马辐照灭菌。在这个实施例中鲑色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌都使用纯真菌培养，并在2%的麦 芽琼脂培养皿上培养。真菌培养在接种前生长10-14天，或者直至菌丝生长接近培养皿的 边缘。先将不锈钢衬垫放置在菌丝顶部，然后放入松木边材块，从而将灭菌的松木边材 块加入到真菌培养皿中。在可控室温25°C以及75%的RH(相对湿度)下培养直至3周。从培养皿中取出松木边材块后，对一些木块进行称重，烘干后，再称重，以确定质 量损失。剩下的木块被磨碎，并对材料根据标准NREL实验室方法进行糖化测试(Brown和 Torget，1996 ；Hames 等，2005)。在 JASCO 系统 HPLC 的 BioRad Aminex HPX-87P 柱上进行 糖分析。图2和图3中所示的质量损失数据表明15天后相对低的质量损失，即大约5%。 松木边材的质量损失在大约7天暴露后显示出线性。图4和图5所示是从暴露在褐腐真菌鲑色泊氏孔菌和凹痕粉孢革菌下不同时间的 欧洲赤松边材样品中释放的葡萄糖的数量，并以生物质的总烘干重量(ODW)的比例表示。 这些值是全部的葡萄糖值，并表示存在于木材的半纤维素组分中的任何葡萄糖。这一实施 例表明松木边材的BR预处理能提供几乎四倍的释放的葡萄糖的量的增加(图4)表明从非 预处理的松木中释放的葡萄糖的显著改善。这与现有使用的物理化学预处理技术相比具有 优势(Ewanick 等，2007 ；Frederick 等，2008)。实施例2 褐腐真菌在预处理后独特的提供从松木(辐射松)的改善的葡萄糖糖
化产量这里，我们表明在松木边材在褐腐真菌下的受限制的暴露后，在酶糖化后的葡萄 糖产量显著增加。结果阐明了使用褐腐真菌作为生物预处理用于生物燃料的生产的潜能， 并且我们表明与现有的预处理技术相比，这将大大的降低能源和化学品输入以释放可发酵 的糖类。为了确定观察到的葡萄糖产量的增加由BR真菌特定的引起的，我们研究将另一 软木生物质(辐射松)暴露在六种不同的真菌下凹痕粉孢革菌(Coniophora puteana) (褐腐)、鲑色泊氏孔菌(Postia placenta)(褐腐)、变色栓菌(白腐)、球毛壳菌(软腐)、 绿色木霉(霉)和一种毛霉菌(霉)。这两种霉菌用于代表能在木材中生长但不有效降解 木材基板的微生物。其他真菌在合适的条件下能有效降解木材。通过横切风干木块，测量5x IOx 25mm的辐射木边材，并通过伽马辐照灭菌，然后 进行木材的真菌暴露。接种前，真菌培养物在4%的麦芽琼脂中生长不超过28天。灭菌的 木块无菌放置到无菌不锈钢环的顶部的固体媒介上，以避免直接接触琼脂。真菌和木块在 22 °C的可控室温下培养直至35天。糖化根据基于修改后的Selig等的方法(Selig等，2008)进行，区别是60FPU/g烘 干纤维素酶生物质(Celluclast 1. 5L, Sigma, UK)和64pNP⑶/g烘干β -葡糖苷酶生物质 (Novozyme 188，Sigma, UK)。在 50°C下培养 168 小时。通过 HPLC 在 Agilent 1200 系列 HPLC配合BioRad aminex HPX-87P柱上用水做流动相分析释放的葡萄糖。木材的糖化外，还测量木材的pH。生物质被磨碎并筛选为粒径在180-850 μ m之间。IOOmgODW的这一物质被添加到沸腾的去离子水中，并培养20分钟。接着，移除样品，并 在用WTW Inolab的pH计测量之前冷却。图6所示结果表明用两种BR真菌的处理增强了葡萄糖从酶糖化中的释放(大约 3倍)。暴露在霉真菌和软腐真菌下的木材对酶糖化的葡萄糖释放没有效果。图7所示是木材的pH值在暴露在两个BR真菌C. puteana和P. placenta后与未 暴露的对照相比从PH5迅速下降至大约pH3至3. 5，非木材腐烂-真菌T. versicolor也显 示出下降，但是下降速度低于BR真菌。这与文献报道的关于BR和白腐真菌之间的区别以及 他们的不同的腐烂机理一致(Goodell，2003b)。BR真菌产生草酸，通过芬顿反应表明这促 进了在BR腐烂木材中观察到的非酶解聚，而这已知能产生羟基自由基(通过H2O2和Fe(Il) 的反应)(Espejo和Agosin，1991)。我们推测纤维素分子的这一解聚是部分的或完全的导 致暴露在BR真菌下后所观察到的葡萄糖糖化产量增加的原因。细胞壁中糖类的解聚引起 木材强度的显著降低(Eaton和Hale，1993a)，我们还观察到与未暴露的木材相比，暴露的 木材破碎所需要的能量也降低(图8)。由于BR预处理使用了温和条件，另外的优势是木质纤维素乙醇产品不含有或 者降低了发酵抑制剂的含量，发酵抑制剂通常由更剧烈的预处理产生。我们通过用酿酒 酵母对通过葡萄糖溶液进行乙醇发酵而证实了这一点，其中葡萄糖溶液是通过对辐射 松(P. radiata)进行酶糖化而获得的，辐射松被暴露在C. puteana下(20天)和暴露在 P. placenta下(25天)预处理过。所有的发酵在0. 5% (w/v)葡萄糖浓度、还有1 % (w/v)的酵母提取物和2% (w/v) 的蛋白胨、最终体积15ml的条件下进行，在30°C下培养24小时。用HPLC在装备有BioRad aminex HPX-87H柱的Jasco Systems HPLC上对乙醇和葡萄糖进行分析。使用无对双尾t 检验(unpaired two-tailed Student' s t-test)评估发酵数据。零假设表明没有显著差 异。当ρ <0.05时，零假设不成立。用BR预处理过的松木获得的糖溶液与单独的葡萄糖对照(乙醇/葡萄糖=0. 42) 相比，没有观察到乙醇产量的显著差异，表明通过BR预处理没有产生发酵抑制剂。实施例3-褐腐真菌处理的进一步优化BR处理方法的进一步优化可以通过下列方法获得“组合”方法_将BR预处理与其他已知的增强效率的预处理方法(例如蒸汽爆炸， 稀酸)结合使用。粒度-BR预处理能有利于对相对大的木片进行(大约IOx 5x 30mm)。这将降低生 物质所需要的机械处理量并因此减少所需要的能量。我们认为褐腐预处理可以用于相当大 范围的木片，还可以用于“整”木，例如可锯木边料、木质纸浆“卷”等。褐腐预处理还可以 应用于其他种类的纤维素和木质纤维素生物质，例如谷物秸秆、竹材、芒草、纸“废弃物”等， 这些都具有不同的用于处理的最佳尺寸等，一些不需要破碎。参考文献Boerjan, W.等，2003. Lignin biosynthesis. Annual Review of Plant Biology. 54,519-546.Brown, L. , Torget, R. , 19 9 6. Enzymatic saccharification of LignocelIulosicBiomass. National Renewable Energy Laboratory. LaboratoryAnalytical Procedure009.Desch，H. Ε.，Dinwoodie，J. Μ.，1996. Timber，structure，properties,conversion and use. Macmillan Press Ltd.，London.Dorado, J.等，2001. Utilization of white-rot fungi for pitch control in pulp andpaper manufacturing. Afinidad. 58，175-180. Eaton，R. A.，Hale，M. D. C，1993a. Wood :decay，pests, and protection. Chapman&Hall，London.Eaton，R. A.，Hale，M. D. C，1993b. Wood :Decay，pests and protection. Chapman and Hall，London.Espejo, E.，Agosin，Ε. , 1991. Production and Degradation of Oxalic-Acid byBrown Rot Fungi. Applied and Environmental Microbiology. 57,1980-1986.Ewanick, S. M. 2007. Acid-catalyzed steam pretreatment of lodgepole pineand subsequent enzymatic hydrolysis and fermentation to ethanol. Biotechnologyand Bioengineering. 98，737-746.Frederick，W. J.等，2008. Production of ethanol from carbohydrates fromlobIo1Iy pine A technical and economic assessment. Bioresource Technology. 99,5051-5057.Goodell, B.，Brown-rot fungal degradation of wood :our evolving view. In :B.Goodel1, et al. ， Eds.)， Wood deterioration and preservation.American ChemicalSociety, Washington DC，2003a，pp.97-118.Goode 11, B. , 2003b. Brown-rot fungal degradation of wood :0ur evolvingview. Wood Deterioration and Preservation. 845,97-118.Green，F.，Highley, Τ. L.，1997. Mechanism of brown-rot decay :Paradigm orparadox. International Biodeterioration&Biodegradation. 39,113-124.Gutierrez, A.等，2001. The biotechnological control of pitch in paper pulpmanufacturing. Trends in Biotechnology. 19，340-348. Hames，B.，et al.， 2005.Preparation of Samples for Compositional Analysis. National Renewable EnergyLaboratory. Laboratory Analytical Procedure.Helmy, S. Μ. , El-Meligi, Μ. , 2002. Biopulping and biobleaching by white rotfungi. Journal of Scientific&Industrial Research. 61,376-381.Koenigs,J. W. ,1974. Production of Hydrogen-Peroxide by Wood-RottingFungi in Wood and Its Correlation with Weight-Loss, Depolymerization, and PhChanges. Archives of Microbiology. 99,129-145.Nigam, J. N. ,2002. Bioconversion of water-hyacinth(Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to motor fuel ethanol by xylose-fermenting yeast. Journal of Biotechnology. 97,107-116.Nilsson，T.，Defining fungal decay types :Final proposal.，The internationalresearch group on wood preservation. IRG Secretariat，Sweden. IRG Doc. No. 88-1355，Madrid，Spain，1988.Pu，Y.等，2008. The new forestry biofuels sector. Biofuels,Bioproducts&Biorefining. 2，58-73.
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1权利要求
1.一种木质纤维素降解褐腐真菌用在木质纤维素或纤维素生物质的预处理方法中的用途，以从生物质中利用糖类或木质素。
2.—种预处理木质纤维素或纤维素生物质以从生物质中利用糖类或木质素的方法，该方法包括对木质纤维素生物质接种木质纤维素降解褐腐真菌，并在促进木质纤维素降解褐 腐生长的条件下培养所述被接种过的生物质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述在木质纤维素降解褐腐生长的条件下的培 养在小于 50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或 者4天后终止，或者在生物质中的葡萄糖消耗发生前终止。
4.根据权利要求1所述的用途或根据权利要求2所述的方法，其中预处理是用于任 何形式的纤维素或半纤维素水解/糖化的预处理；或者是用于稀酸水解或蒸汽爆炸的预处 理。
5.根据权利要求4所述的用途或方法，其中预处理是用于酶糖化、发酵以及乙醇回收 或加工和/或木质素加工的预处理。
6.前述权利要求中任一所述的用途或方法，其中木质纤维素生物质是软木。
7.根据权利要求6所述的用途或方法，其中软木是松木边材。
8.根据权利要求6所述的用途或方法，其中软木源自于辐射松或欧洲赤松树种。
9.前述权利要求中任一所述的用途或方法，其中木质纤维素降解褐腐真菌是或包括凹 痕粉孢革菌或鲑色泊氏孔菌。
10.权利要求6-8中任一所述的用途或方法，其中木材为平均体积为0.1-1cm3的木片 的形式，优选为平均体积为0. 2-0. 5cm3的木片的形式。
全文摘要
一种预处理木质纤维素和纤维素生物质的方法，以从生物质中利用糖类或木质素，该方法包括用木质纤维素降解褐腐真菌接种木质纤维素生物质以及在促进木质纤维素降解褐腐生长的条件下培养接种过的生物质的步骤。在促进木质纤维素降解褐腐生长的条件下的培养在少于50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或者4天后终止，或者在生物质中的葡萄糖消耗前终止。
文档编号C12P19/02GK101998995SQ200980112793
公开日2011年3月30日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月11日
发明者理查德·詹姆斯·墨菲, 麦克·杰森·雷 申请人:帝国创新有限公司