专利名称：用于检测被分析物的测量装置和测量方法
技术领域：
本发明涉及权利要求1的用于检测和/或测定至少一种溶于液体介质中的被分析物的测量装置，涉及权利要求43的用于生产该测量装置的方法，涉及权利要求48的测量装置的操作方法，和涉及权利要求53的测量装置的应用。
背景技术：
用于测定试样溶液中被分析物的传感器为本领域中已知的。因此，在DE-A1-100 32 042中，已经将包括工作电极和对电极的系统应用于塑料载体材料。工作电极由叠层构成，即由至少一个反应层和一个保护层构成。保护层是必要的，因为试样溶液中的电化学信号被转移到可升华介体，并由此转移到工作电极。没有保护层，介体将升华掉，而传感器功能将受到损害。然而，叠层布置使其难以准确地限定与工作电极接触的试样或底物溶液的量，这可导致测量不准确。此外，测量需要多个洗涤步骤，延长了测量时间。
在WO-A1-99/58709中，描述了由载体、电极系组成的测试装置，其中电极系位于载体上并由三个不同尺寸电极和一定数量的网状织物和在其上面淀积的保护层组成。这些层和织物使各个电极彼此绝缘。此外，它们保证通过最上层中的开口进样的测量试样将通过挠性叠层近乎令人满意地在电极周围分布。然而，弹性叠层不会每次准确地以相同方式吸收连续进样的液体试样并每次以相同方法在各个层之间分散它们。因此，不能使恒定量的测量试样以限定的容积范围围绕电极。因此，可能发生测量误差，并且测量值的重现性差。在其它方面，描述的夹层状叠层布置的生产复杂。
在EP-B1-0 170 375中描述的测试装置克服了挠性结构的缺点。其公开了由两个板状硬塑料表面组成的测量池。其以彼此接近的距离布置并在其间封入粒子选择性电极系。两个表面彼此之间的距离由沿着该表面纵向侧延伸的边缘设定。两个塑料表面之一的构造比另一个更大并形成可以进样分析溶液的唇状物。由毛细管力驱动，这种溶液尽量向电极系远处流动同时引起位于其前面的空气向下游移动并从而离开测试装置。因此，分析溶液流入测试装置直到测试装置完全充满液体。如果不预先费力地通过吸收性的羊毛或织物除去已经封入两个板之间的溶液，则不可能再向测试装置内部引入更多的液体，例如用于洗涤目的。
WO-A1-00/70327也不能完全克服上述缺点。其公开了用于定量电化学分析固相中被分析物的试验设备。其由包含电极的层和在其上面布置的有孔的支持层组成。孔直接位于电极的顶部。在支持层上为色谱测试条。这被分为三部分，包括与膜状流动面邻接的试样收集垫和吸收垫。试样收集垫包含对被分析物有特异性的可溶性物质，所述物质带有标记。
第一步，将液体试样施用于试样收集垫。大部分试样液体流过膜进入吸收垫。只有小部分到达电极以上的孔。因此，只能在大试样量的情况中用液体将其完全地充满。如果寻找的被分析物存在于在向下游流动的试样中，其将与特异物质形成复合物。其进一步向下游移动并结合于固定在孔区域内膜上的另一种特异物质。形成夹层化合物，其量只能在膜和电极通过孔彼此液体接触时才能电化学检测到。
第二步，将底物溶液进样到试样收集垫或直接进样到孔上面的膜，使得孔近乎完全地被液体充满(取决于进样量)。其与已经存在于孔中的试样溶液混合。因此不可能向孔中加入限定量的不含微量的各种其它溶液的单一溶液。此外，不可能用底物溶液完全地取代试样溶液。这可能导致测量不准确和测量结果没有重现性，特别是如果试样溶液包含底物溶液中没有的电活性(electroactive)组分。包括多个单独部件的现有技术的试验装置结构复杂，因此生产费用昂贵。
发明内容
本发明的目的是通过提供精确和迅速检测液体介质中被分析物浓度的测量装置和测量方法克服现有技术的缺点。在该方法中，测量试样中的电活性杂质对测量结果的影响和使用不同量液体的影响一样小。该测量装置应该是便宜的(使用材料少)并且产生简单，另外，其应该是在相当长时间储存之后也是机械和化学上稳固的，使得产生精确和可重现的读数。
本发明的主要特征在权利要求1、43、和48、和权利要求53中详细说明。权利要求2到42、44到47、和49到52涉及详细说明。
根据权利要求1，在包括具有两个纵向边缘的条形载体(已经向该载体施用了包括至少一个参比电极和至少一个工作电极的印刷多电极组)、和适合于结合生物活性特异性结合分子或被分析物的配体的用于检测和/或测定至少一种存在于液体介质中的被分析物浓度的装置中，本发明提出包括适合于介质沿着条形载体连续流动的刚性的反应和检测箱的装置，所述反应和检测箱由施用于所述载体的所述纵向边缘的伸长支柱形成，在所述支柱上布置覆盖物，和在所述反应和检测箱的下游布置的液体吸收件。可以以不同量向载体进样测量溶液，以通过相同的朝向液体吸收件的方向流动。然而，不管起始量如何，总是有恒定量的溶液保留在反应和检测箱中，这就是为什么可以实现精确测量的原因。此外，可以使用第二溶液清洗反应和检测箱的痕量溶液。虽然如此，仍有相同量的液体保留在反应和检测箱中。因此即使连续使用多种溶液进行测量，也仍然可以非常精确地测定被分析物的浓度。
根据权利要求2，载体设计为用于液体介质的自撑式流动面。根据权利要求3，其为单片，并且由聚合物型不导电的、优选矩形的材料组成。载体的这些实施方案降低了生产成本，并且降低了测量装置的重量。根据权利要求4，如果需要所选择的分子结合在载体的表面上，向其施用配体和/或生物活性特异性结合分子。根据权利要求5，还可能使它们的一些或全部固定在载体上，由此在电极上获得空间以将其它分子固定于其表面。
如果使用的载体材料对反应非常不活泼或不能结合生物活性特异性结合分子，则必须为所述材料的表面作准备以向该表面施用配体。因此，权利要求6提出用由选自动物或者人清蛋白和/或球蛋白和/或糖蛋白的蛋白质组成的一次涂层装备载体。根据权利要求7，可将多肽如聚氨基酸和/或蛋白质的降解产物，优选来源于支持组织和结缔组织的蛋白质的降解产物用于此目的。
在权利要求8定义的测量装置中，在载体的一端形成施样区域。这是可以将待测试样进样到测量装置中的唯一位置。权利要求9描述了该区域或其至少一部分必须用表面活性物质处理，和其必须能够吸收液体介质。根据权利要求10，通过在施样区域放置筛状或多孔性材料(优选用表面活性物质处理过)，实现了对试样吸收的甚至更大的改进。
为了在测量装置中提供电源电压，权利要求11的特征是必要的，根据权利要求11，各个工作电极和各个参比电极导电连接于给定的导电轨迹，并且各个导电轨迹电连接于可以随后连接于电测量仪器的接点上。
根据权利要求12，用于这些电极中的至少一个和用于它们分别指定的导电轨迹及其分别给定的接点的材料为金、银、铂、镍、钯、钛、铜、或碳。根据权利要求13，如果电极中的至少一个由干燥的石墨糊组成或为可从金属糊和/或金属盐糊通过干燥制备的电极，则是特别适合的。这种类型的电极糊可以以任何所需形式在载体上分布，并从而可能实现几乎任何的电极形状。
根据权利要求14，在本发明另外的实施方案中，至少一个工作电极携带配体和/或生物活性特异性结合分子，例如在其表面上。如果将这种粒子直接施用于电极，在电极表面上立即形成电活性底物并发生迅速的信号传输。根据权利要求15，如果在至少一个其它工作电极上布置和/或固定反应非特异性结合分子，可以另外补充电极涂料。这种类型的粒子所记录的测量溶液中的变化不是由特异性电活性底物形成的，因此保证不发生测量误差。
如可以从权利要求16推断的，配体作为浓度为0.0007到0.7mol/l，优选0.035到0.35mol/l的溶液施用。它们包括对本发明有意义的不同类别的化合物。因此，根据权利要求17，它们由核糖核酸或脱氧核糖核酸形成，或根据权利要求18，它们包括氨基羧酸，优选二氨基羧酸(diaminocarboxylic acid)。根据权利要求19，以肽样(peptide-like)方式连接的组成为R-CH(NH2)-(CH2)n-COOH的非单体的同型(homodet)或异型(heterodet)氨基羧酸如聚氨基羧酸特别重要，其中R表示质子或优选表示氨基、亚氨基、羟基、硫醇、羟基烷基、氨基烷基、或羧基烷基，n为0到6的数，优选为0。
根据权利要求20，可使用的其它配体为优选从细菌阿维丁氏链霉菌(Streptomyces avidinii)分离的蛋白(proteide)或蛋白质。最后，权利要求21提出至少一个配体为苯基硼酸，例如用于HbA1c的检测。
如从其命名可以推断出，生物活性特异性结合分子负责产生与表面、配体、和被分析物的连接，其为本发明必须的。为此，根据权利要求22，它们具有用于至少一种配体的结合位点或与配体结合的结合位点。此外，根据权利要求23，它们具有至少一个用于结合被分析物的特异性结合位点。
根据权利要求24，优选一个或多个催化活性蛋白质共价结合于生物活性特异性结合分子和/或配体。利用本发明的这种主要特征，被分析物-结合分子可以同时地将底物分子转变为电活性形式。
为了保证反应和检测箱具有恒定容积，这对于本发明是必要的，必须限定其组成。因此，权利要求25定义将伸长支柱分为两个条，并以两个条的形式永久地粘附连接于载体的两个纵向边缘。根据权利要求26，所述条由聚合物材料和/或熔融粘合剂组成，并具有与液体吸收件相同的厚度。显著开发了权利要求27所述的本发明，因为其定义了条只是建立在载体的两个纵向边缘的一部分上，在条和液体吸收件之间形成空隙，条在纵向边缘上从该空隙朝上游方向延伸。这种空隙有助于和/或保证了这样的事实，即当每次液体对载体进样时，在反应和检测箱中保留限定量的试样。
覆盖物帮助产生反应和检测箱的恒定容积。根据权利要求28，其由聚合物的，优选矩形的材料组成，并且以使其覆盖物载体以及多电极组和液体吸收件的方式连接于伸长支柱。或者，根据权利要求29，其也可只覆盖载体的一个或多个部分。
根据权利要求30，覆盖物在其上游侧包括至少一个缝状和/或半圆形的或多边形的凹口和/或开口，其布置为使得可以由液体介质填充载体的施样区域。如权利要求31中定义的，在新型装置的一个实施方案中，液体吸收件粘附固定于覆盖物的面向载体的那一侧。
可以显著地精细化和改善覆盖物的表面特征。根据权利要求32，为此目的，用表面活性物质处理覆盖物或其至少一部分，从而使其被赋予了亲水性表面和/或疏水性表面。在权利要求33中的变体中，覆盖物的面向载体的那一侧在多电极组区域内，特别是工作电极上面和参比电极上面具有亲水性表面性质，在施样区域内至少部分地具有疏水性表面。
根据权利要求34，反应和检测箱朝下游和上游方向开口，并且在其下游端与空隙邻接。因此，一方面，连续的液流会通过载体，另一方面，其构造为使得其帮助或保证在反应和检测箱中提供液体恒定容量。
液体吸收件为本发明必需的，因为其吸取行为改善测量溶液朝下游方向的流动。为此，如权利要求35中定义的，液体吸收件在距离施样区域为一定下游长度的地方布置在载体上，并覆盖导电轨迹使其例如稳固地靠在导电轨迹上。
为了特别充分地吸收液体介质，根据权利要求36，液体吸收件由吸收性的多孔性纤丝状材料组成并通过粘合剂固定于载体。根据权利要求37，其由至少一个纤维层构成或由至少一种织物构成，所述纤维层或织物由纤维素纤维或玻璃纤维或其混合物组成或由有机聚合物组成。根据权利要求38，本发明思想的实践延伸提供了用表面活性物质待处理的液体吸收件，优选用具有亲水性质的表面活性物质处理。这增加了液体介质迅速向下游流动的趋势。
本发明的表面活性化合物在权利要求39和40中定义。它们包括包含亲水基团如-COOMe、-OSO3Me、-SO3Me、-NH2、＝NH、-NR3+和具有10到18个碳或烷芳基基团的疏水性烷基链的物质。根据权利要求40，优选使用具有实验式C20H37NaO7S或C18H29NO3S的物质。
为了赋予本发明装置以必要的刚性以及轻质，使用聚合物是适当的。在这种情况下，如权利要求41中说明的，如果聚合物材料为聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯、环氧树脂、甲基丙烯酸聚合物、聚碳酸酯、聚氯乙烯或所述化合物的共聚物，则特别适合。如权利要求42中进一步定义的，如果聚合物材料为优选由聚酯、聚碳酸酯、或聚氯乙烯制成的箔，则避免了消耗过多的材料。
权利要求43为要求单独保护的本发明的重要部分。其公开了生产用于检测和测定至少一种溶于液体介质的被分析物浓度的装置的方法。根据本发明，这通过处理电极材料以得到糊、然后将糊施用于载体使得形成包括至少一个工作电极和至少一个参比电极和导电轨迹以及与其连接的接点的多电极组而实现。然后将具有多电极组的载体在高温干燥，随后对其施用配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质。这在多电极组区域中进行或在布置在多电极组上游的区域中进行，将伸长支柱、覆盖物和液体吸收件固定于如此得到的载体，使得覆盖物和载体彼此留有间隔。测量装置生产为使得溶液可以通过装置流动，并在所述流动过程中同时在电极区域中保持一定量的溶液。此外，现在可以精确地测定对生物活性结合分子或配体有特异性的被分析物。它们被选择性地从测量溶液分离并结合于电极上或电极附近的载体上。最后，使用导电糊使得有可能生产多种形状、尺寸、和构造的电极和导电轨迹和接点。
本发明重要的是至少一个工作电极具有特异性分子。根据权利要求44，这在于糊包含配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质，并且利用丝网印刷技术施用。该方法节省时间，因为不需要随后的工作电极的涂覆。然而，其只有在配体或生物活性特异性结合分子和催化活性蛋白质为耐热的并且在干燥工艺过程中不被破坏才是可行的。然而，因为这不适用于所使用的所有分子。权利要求45中定义了补充方法。其详细说明用配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质涂覆至少一个干燥电极，优选在交联分子或结合试剂的帮助下。同样地，根据权利要求46，用配体和/或反应非特异性结合分子涂覆至少一个干燥电极，优选在交联分子或结合试剂的帮助下。
如果布置在测量装置下游的区域被亲水化处理，则测量试样更迅速地沿着载体流动。因此，如权利要求47中定义的，用表面活性物质的溶液处理液体吸收件并干燥，在优选实施方案中这些物质为实验式C20H37NaO7S或C18H29NO3S的化合物，其以0.001到5％w/v的浓度使用，优选0.1到3％w/v。
权利要求48对于本发明也是必不可少的，因此，需要单独的保护。其公开了使用包括至少一个工作电极和至少一个参比电极的装置检测和测定至少一种溶于液体介质的被分析物浓度的方法。根据本发明，在装置的施样区域进样可确定量的液体介质。然后允许经过可指定的一段时间，以允许被分析物与配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质发生相互作用。然后，将包含至少一种对催化活性蛋白质或对多种催化活性蛋白质为反应特异性的底物的溶液进样到施样区域，并将装置连接于电测量仪器。在培养期之后，在连接于装置的测量仪器上读取待测定的每种被分析物的电信号，并在校正曲线的帮助下确认各个被分析物的相应浓度。测量只需要两种溶液，因此能够简单而迅速地进行被分析物的测定。因为不需要洗液，该方法为用户非常满意的。
权利要求49证实本发明的方法多么地迅速的和需要多么少的液体介质。因此，其限定的量为0.01到20μl，优选1到10μl。预定时间为5到600秒，优选10到120秒，更优选20到60秒。还通过在权利要求50中定义的特异性底物的量表现低的液体消耗量。只需要将0.1μl到500μl、优选1μl到100μl、更优选10μl到30μl的量的这种溶液用移液管吸取到施样区域。根据权利要求51，其后的培养期为2到100秒，优选5到30秒，更优选20秒，因此，同样很短。
可以通过权利要求52的方法显著地改善被分析物测定的准确性，特别是在包含多种电活性粒子的溶液中。为此，将读取的电信号与来源于第二非特异性的工作电极的另一个电信号相比，该第二工作电极只有反应非特异性配体或结合分子。
根据独立权利要求53，该装置用于检测和测定来自体液例如全血、血浆、血清、尿、分泌物、脑脊髓液；来自身体组织的提取物和来自涂抹或擦拭材料的至少一种被分析物的浓度。
参考附图，通过权利要求和以下说明的示例性实施方案得到本发明另外的特征、细节和优点，其中图1为包括参比电极和工作电极的测量装置的俯视图，图2为图1的测量装置沿线A-A的侧视图，图3为具有两个工作电极的测量装置的俯视图，和图4为具有三个工作电极的测量装置的俯视图。
具体实施例方式
通常用参考数字10指定的图1中的测量装置用于定性和定量测定溶解的被分析物。在基本设计中，其包括载体20，并对其施用了包括工作电极40和参比电极30的电极组。电极30，40布置在反应和检测箱50中。反应和检测箱包括载体20的一部分、伸长支柱52、和覆盖物54。其在两端开口。覆盖物54在这些开口端之一上具有凹口56，其在载体20上提供施样区域22。在覆盖物54的另一端，存在由液体吸收件60限定的空隙70。
在反应和检测箱50中存在生物活性特异性结合分子，其可以与寻找的被分析物相互作用，并有时携带至少一种催化活性蛋白质。
为了测定被分析物的浓度，将测量试样进样到施样区域22中。通过毛细管作用，试样向下游移动进入反应和检测箱50中。在那里被分析物与携带有催化活性蛋白质的生物活性特异性结合分子反应，形成复合物，其进一步向下游移动到达电极30，40，在那里其与固定的生物活性特异性结合分子相互作用。这样，寻找的被分析物分子在至少一个电极40附近或其上面浓集。
其余的测量试样进一步向下游分散进入空隙70中并部分地被邻近的液体吸收件60吸收。在第二步中，将溶液进样到施样区域22中，该溶液包含至少一种对至少一种催化活性蛋白质为反应特异性的底物。其同样渗透进入反应和检测箱50中并将测量试样的未结合组分置换到空隙70和液体吸收件60中。底物与催化活性蛋白质反应。如果与催化活性蛋白质结合的生物活性特异性结合分子与被分析物通过结合相互作用并且随后被固定的生物活性特异性结合分子捕获，则催化活性蛋白质只保留在反应和检测箱50中。因此，转换的反应特异性底物的量与反应和检测箱50中的催化活性蛋白质的浓度成正比，因此是测量试样中寻找的被分析物的量的量度。
在任何情况下，催化活性蛋白质将结合的反应特异性底物转化为氧化或还原的电活性底物形式。其与工作电极40相互作用，从而产生电流变化和/或电压变化形式的电信号。其与产生的电活性底物形式的量成正比，因此是测量溶液中被分析物的量的定量量度。为了得到具有重现性的读数，在反应和检测箱50中总是存在恒定的测量容积是必要的。这通过在液体吸收件60和反应和检测箱50之间提供空隙70而得到保证或至少得到帮助。
测量装置10的载体20包括挠性的、优选自撑式的和不导电的塑料材料层。其为单片的，由下述的聚合物或两种或多种聚合物材料的共聚物产生。在具体的实施方案中，其具有用显镜可见的表面结构，通过该表面结构也可容易地扩散除液体和小的抗原之外的溶解的生物高分子，诸如例如酶、球状蛋白质、核酸、传染剂和抗体。优选为箔形式和矩形设计的载体20具有两个纵向边缘24，并且其厚度为使得其可以被结合到测量装置10中而无需另外的支持层，例如其厚度为0.1mm到5mm。然而，其也可在纵向上为不规则的设计并具有更宽的尺寸范围。此外，塑料层可为减缩的和/或在一个方向上为圆的。
为了能够在某些位点如反应和检测箱50选择性地使生物活性特异性结合分子结合于低活性塑料层，对载体20预先施用涂层。为此，用作为底漆的溶液处理载体20，溶液的组分静电结合或利用范德华力结合于载体表面。例如，聚氨基羧酸使聚乙烯箔化学改性，使其能够共价结合生物活性特异性结合分子。
然而，对于表面活化，除了上述酸之外，还使用动物或人清蛋白、球蛋白或糖蛋白的蛋白质溶液，和来自细菌蛋白质的制剂。清蛋白的例子为乳清蛋白和人血清清蛋白、和得自牛、兔、绵羊、马、猪、和山羊的血清清蛋白。使用的糖蛋白为例如卵类粘蛋白，使用的细菌蛋白质优选分离自阿维丁氏链霉菌。然而，除蛋白质之外，使用蛋白(proteide)，也就是说，具有其它基团如碳水化合物、核酸、或脂质基团的蛋白质。
另外，使用聚氨基酸或多肽，优选后者为支持组织和结缔组织的蛋白质的降解产物，诸如例如得自凝胶的Gelafusal。
如果将使用的蛋白质、蛋白、聚氨基酸、或多肽以作为变性结果的“无规卷曲”构型布置在载体20上，则将实现特别好的粘合基础。为此，在使用之前，将这些物质的溶液在50℃到80℃加热，或向溶液中加入离液剂(chaotropic agent)如尿素或胍盐。其也可通过改变pH、使用超声波、与有机溶剂混合、或用电离辐射处理而实现。
在基本设计中，位于载体20上游端的施样区域22只包括开口的半圆形载体子区域。其设计为使得可以轻松地将测量试样用移液管吸取或滴在其上面。然而，在一个实施方案(未表示)中，其由多个彼此分离的区域组成，其外观具体为覆盖物54中的凹口56的形状或为进一步切割出的区域(未表示)。
为了使测量试样尽快地流入反应和检测箱50，用表面活性化合物诸如例如洗涤剂处理施样区域22。如果施用了这些，使得它们朝下游方向的亲水性特征增加，则实现特别高的流入速度。在另一个实施方案中，将用洗涤剂处理的筛状材料(未表示)例如尼龙织物置于施样区域22上并使要研究的测量液滴分裂。多个这种网状织物彼此重叠放置，则进一步促进了施样区域22上的测量试样的均匀分布，并从而产生迅速的流入。这种效果在单独的织物具有不同尺寸的网格宽度并从最小的网格宽度开始彼此叠加时特别显著。
在涂层载体20的下游区域中，布置了用于产生电信号的机构，在一个实施方案(未表示)中，该机构彼此绝缘。它们包括电极30，40，这些电极各自通过其自己的导电轨迹42连接于布置在载体20下游端的接点44。
各个电极30，40比细长的导电轨迹42宽，使得可以得到最大的表面积用于与测量溶液中的溶解物质相互作用。根据图1，所有的电极30，40具有矩形的形状。然而，在一个实施方案中，它们可为正方形、圆形、半圆形(半圆闭合或在其上游侧开口)、或多边形。通常，各个电极30，40具有0.2到20mm2的表面积，优选1到5mm2，按照惯例，工作电极40比参比电极30占据更大的面积。在图1中，可以看见工作电极40需要大约三倍的更大空间。
优选用于传导电流和/或电压的所有部件30，40、42、44由碳(优选石墨)或银、铂、金、钯、钛、镍、或铜组成。如果起始物质作为粉末或糊存在，如有可能，它们可以通过丝网印刷以一个步骤施用于载体20。在另一个实施方案中，包括电极30，40、以及相关的导电轨迹42及其接点44的扁平金属材料组件被生产并通过粘合固定。
参比电极30没有粒子选择性基团或化合物。其构造为Ag/AgCl电极。然而，对于某些应用，其包括至少一个碳变体(carbon modification)和/或上述件，其都可以单独使用或彼此结合使用。所有的导电轨迹42和接点44都使用含碳石墨糊(如Ercon E0455-125石墨油墨)生产。
优选工作电极40由石墨糊制成并在其表面上具有固定配体或结合了生物活性特异性结合分子的固定配体。在一个实施方案中，其另外携带固定的催化活性蛋白质，该蛋白质直接存在于其表面上和/或结合于配体或结合于生物活性特异性结合分子。多个组成工作电极40、配体、生物活性特异性结合分子、和催化活性蛋白质，通过氢键或范德华力彼此共价、静电结合。
在精选的实施方案中，将两种特异性不同的催化活性蛋白质永久结合于工作电极40的表面。在该实施方案的一个形式中，第一蛋白质结合于配体或结合于生物活性特异性结合分子，而第二蛋白质直接固定在工作电极40的表面上。如果要测定的被分析物为反应特异性底物，则这两种蛋白质布置都是适当的。到达工作电极40的各个底物被第一催化活性蛋白质转化为中间体，该中间体与第二催化活性蛋白质反应(反应级联)。在这种方法的过程中，产生电活性底物形式，其量由工作电极40上产生的电信号的大小表示，并且表示测量试样中被分析物的量。
在另一个实施方案中，工作电极40携带配体或具有生物活性特异性结合分子的配体，此外专门地携带第二催化活性蛋白质。第二催化活性蛋白质直接结合于工作电极40或配体或生物活性特异性结合分子上，并且其又在反应级联中起到形成电活性底物形式的作用，第一催化活性蛋白质位于载体20上。
对于单个被分析物的测定，即，对于图1的单一被分析物传感器的形成，需要至少一个工作电极40和至少一个参比电极30。
可以将粒子选择性基团或化合物，即配体、生物活性特异性结合分子、和/或催化活性蛋白质分别地连接在一起，不仅结合于工作电极40，而且布置在载体20的多个区域中。这种布置基于与塑料层的共价相互作用、静电相互作用、由氢桥产生的相互作用或范德华力引起的相互作用。其保证粒子选择性基团或化合物在载体20上干燥并从而以湿润状态流动，和/或永久地固定于载体上并因此以湿润状态保持不动。
配体具有两种功能。要么它们自身直接结合被分析物，要么它们在载体表面或工作电极表面和生物活性特异性结合分子之间起到桥件的作用。
在本发明的一个实施方案中，测量装置10用包含浓度为0.0007到0.7mol/l的配体的溶液处理，优选浓度为0.035到0.35mol/l。涉及的化合物为选自氨基羧酸，特别是二氨基羧酸中的一种。
非单体的同型(只通过肽键)或异型(不只通过肽键)连接的聚氨基羧酸同样适合。它们具有R-CH(NH2)-(CH2)n-COOH的通用结构式，其中R包括质子和氨基、亚氨基、羟基、硫醇、羟烷基、氨基烷基或羧基烷基基团，n为0到6的数值，优选为0。
以类似肽的方式连接的相对高分子量化合物的来源为动物结缔组织的纤丝状硬蛋白的解聚水解产物。其例子为Gelafusal，得自氧化/热降解方法的胶原蛋白。如果使用蛋白质作为配体，它们特别得自细菌阿维丁氏链霉菌。
此外，可使用核糖核酸或脱氧核糖核酸和多种硼酸诸如例如苯基硼酸作为配体。
可使用碳水化合物系化合物，诸如例如伴刀豆球蛋白A、多种外源凝集素或凝集素如红血球凝集素和抗生蛋白链菌素作为配体。
测量装置的一个实施方案提出聚合物型氨基羧酸作为整个载体20上的固定配体。在紧靠工作电极40的附近或在其上面，生物活性特异性结合分子共价结合于配体并从而固定。在施样区域22的范围内或较远处，即电极30，40的上游，设置了在湿润状态下可移动并携带催化活性蛋白质的生物活性特异性结合分子。来自测量试样的要寻找的被分析物结合于可移动结合分子之一上，由此形成的可移动复合物通过毛细管作用扩散到反应和检测箱50中，在那里其将结合于共价结合的结合分子之一上。
在另一个实施方案中，载体20不含配体，或只在不同区域中包含配体。可移动复合物由生物活性特异性结合分子和催化活性蛋白质、和选择性的可移动配体组成。在被分析物被吸收之后，这种复合物通过毛细管作用在载体20上移动到反应和检测箱50中，在那里其结合于固定配体上或结合于固定的生物活性特异性结合分子上。其同样可以连接于配体。
为了保持生物活性特异性结合分子和催化活性蛋白质的生物活性和免疫活性，在载体20上将这些埋藏在多羟基化合物或聚合物型氨基羧酸或最好其混合物中。从而实现市售制品所需要的长期稳定性。
生物活性特异性结合分子自身能够选择性地结合被分析物。取决于其用法，它们连接于催化活性蛋白质和/或配体。它们可以永久地固定于载体20或施用为使得它们在干燥状态不可移动并在润湿后沿着载体20前进。它们也可以不可分离地结合于已经固定在载体20上的配体上。
通常使用两种生物活性特异性结合分子，其一在载体20的上游移动并共价连接于催化活性蛋白质，得到共轭物，而第二种永久地附着于工作电极40附近的下游区域或固定于工作电极上。从而保证被分析物和共轭物以适当的比例扩散到工作电极40附近或其上面，在那里它们被永久地保持。形成了共轭物、被分析物和固定的生物活性特异性结合分子的夹层结构。
生物活性特异性结合分子可以包括选择性地结合被分析物或抗原或它们的半抗原组分而不与它们化学反应的所有化合物。这其中，具体地包括单克隆和多克隆抗体和抗原。
使用的催化活性蛋白质通常为酶或抗体和酶的重组体。因此，优选使用氧化还原酶，特别是葡糖脱氢酶、葡糖氧化酶和过氧化物酶，但其它酶同样适合。
为了以天然构象保存载体20上的所述化合物，可以加入溶解的多羟基化合物如单糖、低聚糖或多糖。也可使用蛋白质和羟基化合物的溶液保存天然结构。然而，这也用于活化载体20。
在图2中，可以看见，具有产生电信号的机构的载体20受到保护以避开外部影响。为此，为其纵向边缘24连接二条彼此相对形式的伸长支柱52。它们中每一个由熔融粘合剂或聚合物材料的层组成。它们只在载体24的两个纵向边缘的部分延伸，一直延伸到达空隙70。然而，在一个变体(未表示)中，它们可以沿着载体24的整个长度延伸并甚至有时沿着载体20的短边延伸。一方面，这使得施样区域22变小，另一方面其支持和保护接点44。在这一变体的实施方案中，如果期望测量装置10的良好的通风，支柱52在空隙70区域内中断。
覆盖物54永久地粘附连接于伸长支柱52，使得在作为空气缝的空隙70的上游形成反应和检测箱50。在图2的实施方案设计覆盖物54，使得其突出超过空隙70并靠在液体吸收件60上。然而，在两个变体(未表示)中，只有反应和检测箱50或反应和检测箱50与空隙70被覆盖。最后，起到防护罩作用的覆盖物54也可专门位于伸长支柱52上或甚至与其成为一体。
通常优选单片覆盖物54由下述的聚合物材料中的一种组成，如有可能，由于构成的原因，覆盖物54的材料与载体20的材料一样。其具有至少一个缝状或半圆形的开口56，通过其将至少一种测量试样或至少一种反应特异性底物进样到载体20。可以选择任何所需形状的开口，取决于要进样的溶液的量和组成。
反应和检测箱50位于施样区域22和空隙70之间。作为刚性结构，其具有规定的尺寸并具有恒定的用于液体的容积。因为其在下游和上游方向开口，测量试样可以流过反应和检测箱50。在其下游部分布置了参比电极30和至少一个工作电极40，和选择性的导电轨迹42部分。如果要测量大的测量试样体积，可将反应和检测箱50作得大些。这通过使伸长支柱52的条更宽而实现。
如果用表面活性物质诸如例如洗涤剂处理由载体20、伸长支柱52和覆盖物54形成的反应和检测箱50的内表面，则包含反应特异性底物的测量试样或溶液迅速而均匀地渗透到反应和检测箱50中。在这一特征的有利的实施方案中，疏水性表面活性物质位于施样区域22区域中的内表面上。所述物质的量连续降低以有利于亲水性洗涤剂层，与下游的距离越大，越是这样。最后，在电极30，40的区域中，在内表面上只存在亲水性洗涤剂。反应和检测箱50中表面活性物质的这种布置使得含水试样迅速地到达位于下游的电极30，40附近。
空隙70的上游邻接反应和检测箱50，下游邻接液体吸收件60。从图1可以看出，其位于载体上的电极30，40的下游。这是本发明的重要特征，因为其在保证反应和检测箱50中始终存在的精确限定的测量试样体积中是影响因素或测定因素。对于空隙，所述空隙另外影响载体20上的测量试样的流动特性。空隙70为长度可变的，调节其长度以适合使用的液体试样的量。更大量的试样需要反应和检测箱50和液体吸收件60之间有更大的距离，从而产生更大的空隙70，而较小量的测量试样需要较小的空隙。
在一个实施方案(未表示)中，空隙70由伸长支柱52侧向限定。在其中结合狭缝，优选在反应和检测箱50和液体吸收件60之间结合狭缝，以保证精确控制的通气并从而改变测量试样的流动特性。
如果要另外影响其流动特性，可以用所选表面活性物质涂覆空隙70区域内的载体表面。为此，优选疏水化合物，使得包含亲水性物质的反应和检测箱50的区域由疏水性的施样区域22限定上游和由疏水性空隙70限定下游。
液体吸收件60在空隙70的下游方向，其包括吸湿性和多孔性材料。其吸收已经通过反应和检测箱50和空隙70的液体测量试样。如图2所示，其在下游端形成与覆盖物54齐平的完成边，使得露出布置在其下游的接点44。
对于吸收件60，能够迅速地吸收液体的所有材料都是适合的。其例子为纤丝状的非织造布或织物，如纸、纸浆、玻璃纤维、纤维素材料或泡沫塑料如聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。在液体吸收件60的另一个实施方案中，纤维平行于测量试样的流向布置，以专门实现纤丝状材料如纸的单向作用，即向下游的吸取行为。
通过使用已经预先用表面活性物质处理的液体吸收件60实现特别好的液体吸收。为此，在将其安装到载体20上之前用例如溶解的洗涤剂润湿或浸渍。如果测量溶液为亲水性的，则这种洗涤剂为亲水性化合物，在相应的疏水性测量试样情况中，这种洗涤剂为疏水性物质。
用于测量装置10的多个部件的表面活性物质包括至少一个亲水基团和至少一个疏水基团。疏水基团包括具有10到18个碳原子的烷基链。表面活性物质的亲水性特性来自于为上述烷基结构提供的至少极性基团之一，-COOMe、-OSO3Me、-SO3Me、-NH2、＝NH、-N+(R)3。如果表面活性物质(也称为洗涤剂)具有实验式C20H37NaO7S或实验式C18H29NO3S，则实现特别好的润湿结果。
聚合物材料用于载体20、伸长支柱52和覆盖物54，即形成测量装置10的箱状部分的所有部件。这些支持装置10在一定程度上经过加固。聚合物涉及选自聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、和聚酯如聚对苯二甲酸乙二酯的那些。还使用选自环氧树脂、甲基丙烯酸聚合物、聚碳酸酯、和氯化聚氯烯化合物(例如聚氯乙烯)的聚合物。还使用两种或多种上述化合物的共聚物。此外，在载体20上使用硝化纤维素层和/或纤维素层或作为载体本身，用于例如在测量装置10中产生具有不同流动特性的多个区域。
本发明的测量装置10的另一个实施方案包括箔形式的载体20，在其上面印刷三个电极30，40、40。由两个工作电极40、40包围通常布置在载体中心的参比电极30。这些工作电极40、40中的每一个都具有多种配体和/或生物活性特异性结合分子，其又可结合于催化活性蛋白质。可以将这种测量装置10构建为两种不同的设计，即一种(未表示)具有两个特异性工作电极40′、40′，另一个具有特异性和非特异性的工作电极40′、40″，如图3中说明的。
在第一种设计中，每个工作电极40′、40′都具有配体和/或生物活性特异性结合分子，其在各自的情况下可选择性地结合并检测测量试样中的被分析物。因此，这使得单一试样中的两种不同的被分析物彼此独立地被联合检测。
第二种设计中的非特异性工作电极40″具有非特异性生物活性结合分子，优选具有蛋白原性质，例如具有免疫球蛋白类物质。其结合测量试样中可以导致特异性工作电极40′产生不可靠信号的多种组分。这种布置适合于检测或滤出由电活性组分的非特异性结合产生的信号，并从而增加测试的灵敏性。
本发明的测量装置10的另一种形式具有三个工作电极40、40、40。这些可为对被分析物为特异性和/或非特异性的。按照惯例，根据图4，提供了一个非特异性工作电极40″和两个特异性工作电极40′、40′。它们在载体上可具有任何所需的布置，但是应该注意保证参比电极30处于中心位置。
对于本发明的测量装置10的生产，使用包括上述聚合物材料之一的载体20作为基底。对于某些应用，对其进行涂覆，使得可能存在的活性基团钝化或为其用于结合其它分子的表面作准备。为此，通常在载体20上施用包含涂层所需组分的底漆溶液，随后将其干燥。
此后，施用用于产生电信号的机构，即，电极30，40；导电轨迹42和接点44。这通过将包括这些组件的布置置于载体表面上而完成，或使用上述电导糊对载体表面进行丝网印刷加工而完成。如果将这些与介体如二茂铁二羧酸混合，则它们能够特别充分地传输化学电信号。另外它们可已经具有配体、生物活性特异性或非特异性结合分子和/或催化活性蛋白质。然而，这种方法只有在所述的粒子选择性化合物在随后的糊在高温干燥过程中是稳定的条件下才是可能的。
如果在干燥工艺过程中没有或只有一些配体、生物活性结合分子或催化活性蛋白质是稳定的，则它们必须随后作为层施用于(若干个)工作电极40。为了使它们共价结合于电极表面，使用了多种结合试剂。其例子为戊二醛、酰基氯、酸酐、活性酯、叠氮化物、重氮化合物、琥珀酰亚胺、和碳二亚胺(Wong，S.S.，Chemistry of Protein Conjugationand Cross-Linking.，FloridaCRC Press，1991)。该物质可为同双官能化合物或异双官能化合物(交联剂)。在本文中“双官能”是指该化合物具有通过烃链连接的两个活性基团，而“同”表示这些基团为相同的，而“异”表示这些基团为不同的。
还使用结合试剂用于将配体和生物活性结合分子和/或催化活性蛋白质连接于覆层或未覆层的载体表面。此外，需要它们使得所述分子彼此以化学上所有可能的结合连接。
在本发明的一个实施方案中，至少一个工作电极40不携带粒子选择性化合物。代之以使用上述结合试剂将配体和/或生物活性结合分子和/或催化活性蛋白质永久地固定在紧靠电极30，40附近的载体20上。
在已经将粒子选择性化合物不可分离地施用于载体20和/或电极30，40之后，可与催化活性蛋白质结合的其它配体和/或生物活性特异性结合分子在施样区域22中或在紧接其下游处干燥，使得它们在湿润状态下为可移动的。为了保持它们为天然形式或容易地使其可再移动，通常将它们以包含助剂如多羟基化合物和/或多羟基羰基化合物或球状蛋白质的溶液形式施用。
现在使用所述表面活性物质之一浸渍液体吸收件60，干燥，并用粘合方法固定于载体20上。根据图1到4中说明的实施方案，其连接为使得大部分导电轨迹42被覆盖，而电极30，40和接点44仍然是露出的。正常地，液体吸收件60直接与具有导电轨迹42的载体表面20接合，但是也可只通过其纵向侧使其固定于载体20，使得在其与载体20之间留有空间。
下面，将伸长支柱52固定于载体20的纵向边缘24，然后连接覆盖物54。将覆盖物54牢固地连接到伸长支柱52上，在改进中，其还连接到液体吸收件60上。将其组装为使得施样区域22位于其一个开口56下方。从而得到具有反应和检测箱50、空隙70、和液体吸收件60的测量装置10。
在优选实施方案中，在组装之前用表面活性物质的溶液处理伸长支柱52和覆盖物54并干燥。在该实施方案的特别有效的变体中，将形成所述反应和检测箱50的覆盖物54、支柱52和选择性的载体20的区域用亲水性物质涂覆，布置在反应和检测箱50下游和上游的区域用疏水化合物涂覆。
在本发明的测量装置10的一个实施方案(未表示)中，有两条相对的伸长支柱52作为两个部件各自连接于载体20，也就是说，总计有四个条连接于载体20。第一个条在载体20的上游端伸出直到空隙70，第二个条从空隙70伸出直到接点44。第三个和第四个在载体20的相对的纵向边缘24上与前两个条平行。使用这种设计，可以将覆盖物54完全固定于伸长支柱52，并能够覆盖液体吸收件60，使得在液体吸收件与覆盖物54之间保留间隙。这对于当液体吸收件60被测量试样和底物溶液浸渍而因此膨胀时为其提供足够的空间是适当的。
为了测定试样液体中被分析物的量，将测量装置10连接于电测量仪器并进样测量试样。如果其包含被分析物，其将在施样区域22中或在紧接其下游处结合其中所存在的可移动生物活性特异性结合分子。这些中的每一个都携带催化活性蛋白质并与被分析物形成复合物。
由于毛细管作用，这种复合物随试样溶液移动，并且由于测量装置10涂覆有洗涤剂，复合物自动地进入尺寸稳定的反应和检测箱50中。在那里复合物结合于布置在至少一个工作电极40上或紧接其附近的固定的配体或固定的生物活性特异性结合分子上。由此形成的夹层布置包括可移动的粒子选择性化合物、被分析物、和固定的粒子选择性化合物。
过量的试样溶液向下游流动到空隙70中并由此进入液体吸收件60。然而，这不是连续进行的，一方面因为在液体吸收件60的吸取行为之间建立了平衡，另一方面因为反应和检测箱50中的保留行为。当在施样区域22上不再存在向下游流动的测量溶液时，吸取行为连续直到作为空气缝设计的空隙70区域中测量溶液的流动发生中断。因此，一些试样溶液被液体吸收件60吸收，而另一些限定体积的部分保留在反应和检测箱50中。总是恒定的这一部分取决于空隙70的尺寸。如果当设计测量装置10时有意规定了空隙的尺寸，则反应和检测箱50中总是存在恒定测量体积得到了保证。这种设计测量显著地增加了定量的被分析物测定的精确度，并且是本发明的重要特征。这也适用于将空隙70设计为非常小，也就是说，为肉眼不可见的。
在已经在反应和检测部分50中保留恒定体积的测量溶液5到600秒之后，但是理想地为20到60秒，从而有可能使被分析物以上述方式形成夹层，在第二个步骤中向施样区域22进样液体，该液体包含用于至少一种催化活性蛋白质的反应特异性底物。其通常为体积至少为测量试样体积的三倍的缓冲溶液。通过这种方法清洗掉仍然存在于反应和检测箱50中的任何测量溶液，它们流入空隙70并被液体吸收件60吸收。同时，反应特异性底物与已经保持在反应和检测箱50的夹层化合物中的所述量的催化活性蛋白质反应。在任何情况的电化学反应中，在工作电极40上形成氧化或还原形式的电活性底物形式。在这种方法中，发生可以由恒电位器读取的电流/电压变化。电信号改变的大小为反应的反应特异性底物的量的量度，并从而是结合的催化活性蛋白质的量的量度。因此，其为工作电极40上或其附近的夹层化合物的量的量度，因此表明了测量溶液中被分析物的量。
在测量装置10的一种形式中，第一催化活性蛋白质将反应特异性底物转化为反应特异性底物2，其与第二催化活性蛋白质反应，以产生电活性底物形式，如上所述，其由至少一个工作电极40上的反应引起。第二催化活性蛋白质通常固定在工作电极40上或紧接其附近处。然而，在本发明的改进中，将其加入到反应特异性底物的缓冲溶液中。
使用图3中所示的测量装置测定被分析物的量，并且如果使用特异性和非特异性的工作电极40′、40″，则得到两个电信号。然后必须从特异性电极40′的信号减去非特异性工作电极40″的信号，以得到各自的被分析物的相关值。
参考以下示例性实施方案说明本发明，然而，其只是说明本发明包括的所有组合的一部分。
实施例1a图1的双电极测量装置10的生产用于装置10的工作电极40的起始物质为水性石墨组合物(Deltaforge GP-157，Acheson，US)，每1g的石墨组合物包含3.56mg的二茂钛二羧酸。向该混合物中加入其中溶解了25％(w/v)的苯基硼酸和9g/l的NaCl的0.01摩尔的pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液，并全部混合，得到石墨糊。对于所有的导电轨迹42和接点44，使用不含添加剂的石墨糊(C2000802D2，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)。使用常规的银/氯化银糊(C61003D7，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)生产参比电极30。对于绝缘层的材料，使用介电聚合物(D2000222D2，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)。
首先，如图1所示，通过丝网印刷技术将导电轨迹42和接点44印刷到PVC膜(10×50mm)上，并将其在100℃下干燥5分钟。随后，使用相同的技术施用介电聚合物的绝缘层用于电极表面的界定并在80℃下干燥30分钟。然后同样地，连续地施用用于工作电极40和参比电极30的糊，前者在100℃干燥5分钟，后者在80℃干燥10分钟。
然后在上游将包含浓度为1mg/ml的抗血红蛋白A1c(单克隆)-葡糖脱氢酶共轭物(抗-HbA1c-GDH共轭物)的0.3摩尔的5μl甘露糖醇溶液应用于载体20。此外，该溶液包含0.3mmol/l的得自马血清的蛋白质，其通过80％硫酸铵溶液沉淀并可溶解于纯水中。将如此涂覆的载体20在40℃下真空干燥。
作为液体吸附件60，使用纤维无纺织物(Schleicher & Schüll0966，8×25mm)。将其用3g的C20H37NaO7S在100ml净化水中的溶液浸渍，在暖空气流中干燥并固定于载体20上。将其施用于电极30，40的下游，使得不直接与电极30，40连接，而是保留小的间隙或空隙70。
将伸长支柱52连接于载体20的纵向边缘24，并且将尺寸为10×22mm的由聚酯组成的覆盖物54固定于其上。从图1可以看出，其连接方式为使覆盖物的半圆形开口56露出施样区域22。
实施例1b血红蛋白A1c(HbA1c)的测定制备底物溶液，其包括6.5ml的磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS溶液)、3.25ml的磷酸盐缓冲的盐水-葡萄糖溶液(PBS-葡萄糖溶液)、和0.25ml的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)溶液。PBS溶液包含0.12mol/l的磷酸盐、0.15mol/l的NaCl，并且其pH为7.6。PBS-葡萄糖溶液另外包括浓度为0.1g/ml的葡萄糖。Die NAD溶液的浓度为80mg/ml。
将实施例1a中描述的测量装置10连接于恒电位器上并将10μl的HbA1c对照血液(Biocon)进样到施样区域22中。在20秒的培养期之后，通过移液管进样30μl的底物溶液并将混合物再培养20秒。然后在恒电位器上读出得到的电流或电压变化。
实施例1c对照实验中血红蛋白A1c(HbA1c)的测定在平行试验中，将使用的对照血液的另一个试样(Biocon)经历HbA1c微型柱试验(Biocon 11044)。
实施例1d使用Pt电极测定血红蛋白的总量在另一个平行试验中，以已知方式将铂电极插入到上述对照血溶液的试样中，其中在溶液中已经预先溶解了六氰基亚铁(II)酸盐(亚铁氰化物)。其被存在的血红蛋白氧化形成六氰基铁(III)酸盐(铁氰化物)并在铂电极上被还原回到亚铁氰化物。由此产生的电信号表明对照血液试样中血红蛋白的总量。
实施例1e血红蛋白总量中血红蛋白A1c(HbA1c)的比的测定为了测定在存在的所有血红蛋白中血红蛋白A1c(HbA1c)的比，将实施例1d中测定的血红蛋白的总量与实施例1b和1c中得到的读数相关。得到以下百分比使用本发明的测量装置10测定的HbA1c的比4.90％在微型柱(Biocon 11044)上测定的HbA1c的比 4.40％实施例2a另一个图1的双电极测量装置10的生产装置10的工作电极40的起始材料为水性石墨组合物(DeltaforgeGP-157，Acheson，US)，每1g石墨组合物包含3.56mg的二茂钛二羧酸。将250μl的Gelafusal(含氮量为0.9g/100ml)的市售溶液加入到该混合物中并将全部混合以得到石墨糊。对于所有的导电轨迹42和接点44，使用不含添加剂的石墨糊(C2000802D2，Gwent Electronic MaterialsLtd.，UK)。使用常规的银/氯化银糊(C61003D7，Gwent ElectronicMaterials Ltd.，UK)生产参比电极30。作为绝缘层的材料，使用介电聚合物(D2000222D2，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)。
首先，如图1所示，通过丝网印刷技术将导电轨迹42和接点44印刷到PVC膜(10×50mm)上，并将其在100℃干燥5分钟。随后，使用相同的技术施用介电聚合物的绝缘层用于电极表面的界定并在80℃干燥30分钟。然后同样地，连续地施用用于工作电极40和参比电极30的糊，前者在100℃干燥5分钟，后者在80℃干燥10分钟。
然后将生物活性特异性结合分子和催化活性蛋白质施用于工作电极40上。两种化合物都以固定形式存在，两者彼此结合并且还分别结合于工作电极40。
首先制备0.1摩尔的2-(N-吗啉基乙烷磺酸)缓冲溶液(MES缓冲溶液)，其包含0.15mol/l的NaCl并且pH为4.7。然后制备新鲜的10％(w/v)的(乙基二甲氨基丙基)碳二亚胺的水溶液(EDC溶液)和14％(w/v)的N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸钠的溶液。此外，制备pH为7.5的结合缓冲液。其包含0.1mol/l的磷酸二氢钠、0.1mol/l的磷酸氢二钠和0.15mol/l的氯化钠。最后，制备蛋白质/己糖醇溶液，其包括5g/l的来自牛血清的清蛋白和0.50mol/l的山梨糖醇。
将5mg的抗链球菌-A抗体和5mg的葡糖氧化酶溶解于1ml的MES缓冲溶液中。向该溶液加入1ml的EDC溶液和1ml的琥珀酰亚胺溶液，并用MES缓冲溶液补足为5ml。在旋转装置上培养所得溶液15分钟，其引起抗链球菌-A和葡糖氧化酶变为化学活性形式。
将5μl的该溶液和5μl的结合缓冲液用移液管吸取到工作电极40上并使其作用30分钟。然后将其吸走，将5μl的蛋白质/己糖醇溶液施用于工作电极40，并将载体20在30℃到50℃下与电极30，40一起真空干燥1小时。
然后在上游向载体20加入包含浓度为1mg/ml的兔抗链球菌-A-过氧化物酶共轭物(抗Strep-A-POD-共轭物)的5μl的0.3摩尔α-D-吡喃葡糖苷基-β-D-呋喃果糖苷溶液。此外，该溶液包含0.3mmol/l的得自马血清的蛋白质，其用80％硫酸铵溶液沉淀并可溶解于纯水中。将如此涂覆的载体20在真空中在40℃干燥。
作为液体吸附件60，使用纤维无纺织物(Schleicher & Schüll0966，8×25mm)。将其用3g的C20H37NaO7S在100ml净化水中的溶液浸渍，在暖空气流中干燥并固定于载体20上。将其施用于电极30，40的下游，使得不直接与电极30，40连接，而是保留小的间隙或空隙70。
将伸长支柱52连接于载体20的纵向边缘24，并且将尺寸为10×22mm的由聚酯组成的覆盖物54固定于其上。从图1可以看出，其连接方式为使其半圆形开口56露出施样区域22。
实施例2b链球菌A抗原的测定制备包含1mol/l亚硝酸钠的亚硝酸盐溶液。然后制备0.1摩尔的甘氨酸溶液，用氯化氢将其调节为pH 2.5。此外，制备pH为9的0.2摩尔的tris缓冲液和包含20mmol/l的β-D-葡萄糖和3mmol/l碘化钾的底物水溶液。
从两名患者分别取得喉刮片患者1年龄7岁，性别男，就医原因为感冒症状、呼吸道感染；患者2年龄5岁，性别女，就医原因为咽喉痛。
将200μl的甘氨酸溶液与200μl的亚硝酸盐溶液在提取容器中混合。将得自患者的第一个刮片浸在其中并提取二分钟。然后加入200μl的tris缓冲液。将10μl的这种提取溶液用移液管吸取到与恒电位器连接的测量装置10的施样区域22上，并培养20秒。然后加入30μl的底物溶液并再培养20秒。使用恒电位器测量的电流表明在患者1的刮片中没有链球菌A抗原，但是在患者2的刮片中存在链球菌A抗原。在这种情况下，得到的电信号相当于约4×105CFU/ml(＝菌落形成单元/ml)。
实施例2c对照实验中链球菌A抗原的测定将得自两名患者的刮片2转移到包含转运介质的管中，以培养链球菌A菌株的生长。在37℃下在Schaedler血琼脂上厌氧培养菌株24小时。与实施例2b一样的定性评价表明，在患者1的刮片中没有链球菌A抗原，但是患者2的刮片中包含链球菌A抗原。该结果基于使用用于检测这些细菌的链球菌鉴别试验(Oxoid)对β-溶血链球菌的血清学基团A的确认。根据S.Isaac、D.JenningsKultur von Mikroorganismen[Culture of Microorganisms]，Spektrum Akademischer VerlagHeidelberg，Berlin，Oxford 87进行链球菌菌落的计数，其表明有2×105个菌落形成单元/毫升(CFU/ml)。
实施例3a图3的三电极测量装置10的生产装置10的工作电极40的起始材料为水性石墨组合物(DeltaforgeGP-157，Acheson，US)，每1g石墨组合物包含3.56mg的二茂钛二羧酸。将125μl的20％(w/v)的聚氨基戊二酸的水溶液加入到该混合物中并将全部混合以得到石墨糊。对于所有的导电轨迹42和接点44，使用不含添加剂的石墨糊(C2000802D2，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)。使用常规的银/氯化银糊(C61003D7，Gwent Electronic MaterialsLtd.，UK)生产参比电极30。作为绝缘层的材料，使用介电聚合物(D2000222D2，Gwent Electronic Materials Ltd.，UK)。
首先，如图3所示，通过丝网印刷技术将导电轨迹42和接点44印刷到PVC膜(10×50mm)上，并将其在100℃干燥5分钟。随后，使用相同的技术施用介电聚合物的绝缘层用于电极表面的界定并在80℃干燥30分钟。然后同样地，连续地施用用于工作电极40和参比电极30的糊，前者在100℃干燥5分钟，后者在80℃干燥10分钟。
制备0.1摩尔的2-(N-吗啉基乙烷磺酸)缓冲溶液(MES缓冲溶液)，其包含0.15mol/l的NaCl并且pH为4.7。然后制备新鲜的10％(w/v)的(乙基二甲氨基丙基)碳二亚胺的水溶液(EDC溶液)和14％(w/v)的N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸钠的溶液。此外，制备pH为7.5的结合缓冲液。其包含0.1mol/l的磷酸二氢钠、0.1mol/l的磷酸氢二钠和0.15mol/l的氯化钠。
将单克隆小鼠抗沙眼衣原体抗体和葡糖氧化酶溶解于足够的结合缓冲液中，以产生2mg/ml的抗体浓度，和150U/ml(结合溶液)的葡糖氧化酶活性。此外，在结合缓冲液(小鼠IgG溶液)中制备2mg/ml的非特异性小鼠免疫球蛋白G和活性为150U/ml的葡糖氧化酶溶液。最后制备包含5g/l得自牛血清的清蛋白和0.50mol/l的山梨糖醇的蛋白质/己糖醇溶液。
将4ml的MES缓冲溶液与1ml的EDC溶液和1ml的羟基琥珀酰亚胺磺酸钠溶液混合。将5μl如此得到的溶液混合物用移液管吸取到特异性和非特异性工作电极40上并培养15分钟，以活化其表面。
将5μl的包含单克隆小鼠抗沙眼衣原体抗体和葡糖氧化酶的结合溶液加入到活化的特异性工作电极40′。对活化的非特异性工作电极40″施用5μl的IgG溶液。在30分钟的培养期之后，吸走溶液，用移液管吸取5μl的蛋白质/己糖醇溶液到工作电极40′、40″上，然后将其在30℃到50℃真空干燥一小时。
然后在上游将5μl的包含浓度为1mg/ml抗沙眼衣原体-过氧化物酶共轭物的0.5摩尔的山梨糖醇溶液施用于载体20。另外，这种溶液包含浓度为5g/l的得自牛血清的清蛋白。然后使如此涂覆的载体20在40℃真空干燥。
作为液体吸附件60，使用纤维无纺织物(Schleicher & Schüll 0966，10×25mm)。将其用3g的C20H37NaO7S在100ml净化水中的溶液浸渍，在暖空气流中干燥并固定于载体20上。其连接于电极30，40的下游，使得不直接与电极30，40邻接，而是保留小的间隙或空隙70。
将伸长支柱52连接于载体20的纵向边缘24，并且将尺寸为10×22mm的由聚酯组成的覆盖物54固定于其上。从图3可以看出，其连接方式为使其半圆形开口56露出施样区域22。
实施例3b沙眼衣原体抗原的测定在培养瓶(25cm2)中的包含10％胎牛血清的Eagle培养基中培养得自猴肾成纤维细胞株的BGM细胞(106个细胞)，得到密集的细胞菌苔。在吸走培养基之后，用1ml的沙眼衣原体悬浮液浸渍。沙眼衣原体病原体为L2菌株，其得自the Institute for Medicinal Microbiology ofthe Friedrich-Schiller University Jena，并调节含量为1×106IFU/ml(＝感染单位/ml)。为了完成感染，将悬浮液在37℃保持2小时，然后在相同的温度在5％CO2气氛下培养3天。通过超声波处理使得到的细胞分散并将其用作阳性对照。
制备包含20mmol/l的β-D-葡萄糖和3mmol/l碘化钾的底物水溶液。
将10μl的沙眼衣原体阳性对照用移液管吸取到与恒电位器连接的测量装置10的施样区域22上并培养20秒。然后施用30μl的底物溶液并再培养20秒。恒电位器表示根据校正曲线相应于1∶256的沙眼衣原体抗原滴定度的电信号。滴定度理解为其中仍然表现出阳性反应的几何稀释系列的最终稀释的平均数。
实施例3c对照实验中沙眼衣原体抗原含量的测定使用衣原体抗原ELISA，Chlamidia“Celisa“，Cellabs DiagnosticsPTY，Australia，测定1∶256的滴定度。
本发明不限于预先描述的实施方案，而是可以以多种方式改进的。
因此，载体20和覆盖物54也可由无机材料如玻璃、陶瓷或石制成。
此外，也可以根据竞争性结合分析的原理设计测量装置10。为此，不将可移动的生物活性特异性结合分子施用于载体20，所述结合分子在湿润状态中是可移动的，但载体20用在湿润状态为可移动的被分析物和催化活性蛋白质的共轭物涂覆。只要在测量试样中不存在寻找的被分析物，共轭物向下游流动并完全结合于在至少一个工作电极40上或其附近处固定的生物活性特异性结合分子。然而，如果测量试样株存在被分析物，其与共轭物竞争固定的生物活性特异性结合分子的结合位点。因此，共轭物的未结合部分进一步流动到空隙70中并由此到液体吸收件60中。因为在工作电极40的区域内固定了较少的共轭物，只有较少的底物可以反应，导致工作电极40产生较小的电信号。信号水平降低为测量试样中被分析物的量的定量量度。
很显然，用于检测和测定液体介质中至少一种被分析物的浓度的测量装置10由在其上游部分干燥的具有生物活性特异性结合分子的聚合物载体20组成。由至少一个参比电极30和至少一个工作电极40组成的多电极组位于下游区域。所述工作电极40具有生物活性特异性结合分子。载体20具有施样区域22，下游连接有通流式不变形的反应和检测箱50、尺寸可变的空隙70、和液体吸收件60。对于被分析物的定性和定量测定，将两种液体介质，即试样溶液和底物溶液，连续进样到施样区域22。试样溶液可得到想要的被分析物，底物溶液用于形成电信号。通过反应和检测箱50和空隙70的设计，该设计为几何学规则的，并且不因流体介质而变形，因此可以进行精密的测量。
得自权利要求、说明书、附图的所有特征和优点，包括构成细节、空间排列和工艺步骤，对于本发明本身是必要的并具有多种组合。
参考符号列表10测量装置20载体22施样区域24纵向边缘30参比电极40，40′，40″工作电极42导电轨迹44接点50反应和检测箱52伸长支柱54覆盖物56凹口/开口60液体吸收件70空隙
权利要求
1.用于检测和/或测定至少一种存在于液体介质中的被分析物浓度的装置，其包括a)具有两个纵向边缘(24)的条形载体(20)，对该载体(20)施用印刷的多电极组，多电极组包括至少一个参比电极(30)和至少一个工作电极(40)，和b)配体，其适合于结合生物活性特异性结合分子或被分析物，其中该装置a)包括适合于介质沿着所述条形载体(20)连续流动的刚性的反应和检测箱(50)，所述反应和检测箱由施用于所述载体(20)的所述纵向边缘(24)的伸长支柱(52)形成，伸长支柱(52)具有布置在所述支柱(52)上的覆盖物(54)，和b)布置在所述反应和检测箱(50)下游的液体吸收件(60)。
2.权利要求1的装置，其中所述载体(20)设计为自撑式的液体介质流动表面。
3.权利要求1或2的装置，其中所述载体(20)为整体的并由聚合物型不导电的、优选矩形的材料组成。
4.权利要求1到3中任一项的装置，其中将所述配体和/或生物活性特异性结合分子施用于所述载体(20)。
5.权利要求4的装置，其中将所述配体和/或所述生物活性特异性结合分子固定在所述载体(20)上。
6.权利要求1到5中任一项的装置，其中所述载体(20)具有由选自动物或人清蛋白和/或选自球蛋白和/或选自糖蛋白的蛋白质组成的基底涂层。
7.权利要求1到6中任一项的装置，其中所述载体(20)具有由多肽如聚氨基酸和/或蛋白质优选支持组织和结缔组织的蛋白质的降解产物组成的基底涂层。
8.权利要求1到7中任一项的装置，其中在所述载体(20)的一端上形成施样区域(22)。
9.权利要求8的装置，其中所述施样区域(22)或其至少一部分用表面活性物质处理并具有吸收液体介质的能力。
10.权利要求8或9的装置，其中在所述施样区域(22)上提供优选用表面活性物质处理过的筛状或多孔性材料。
11.权利要求1到10中任一项的装置，其中各个工作电极(40)和各个参比电极(30)导电连接于对其给定的导电轨迹(42)，并且各个导电轨迹(42)导电连接于给定的接点(44)，给定的接点(44)可与电测量仪器连接。
12.权利要求11的装置，其中所述电极(30，40)中的至少一个及其给定的导电轨迹(42)及其给定的接点(44)由金、银、铂、镍、钯、钛、铜、或碳组成。
13.权利要求1到12中任一项的装置，其中所述电极(30，40)中的至少一个由干燥的石墨糊组成或者为从金属糊和/或金属盐糊通过干燥制备的电极。
14.权利要求1到13中任一项的装置，其中所述工作电极(40)中的至少一个在例如其表面上携带配体和/或生物活性特异性结合分子。
15.权利要求1到14中任一项的装置，其中在至少一个另外的工作电极(40)上布置和/或固定反应非特异性结合分子。
16.权利要求1到15中任一项的装置，其中所述配体作为浓度为0.0007到0.7mol/l，优选0.035到0.35mol/l的溶液施用。
17.权利要求1到16中任一项的装置，其中所述配体由核糖核酸或脱氧核糖核酸组成。
18.权利要求1到17中任一项的装置，其中所述配体包括氨基羧酸，优选二氨基羧酸。
19.权利要求18的装置，其中所述配体包括以肽样方式连接的组成为R-CH(NH2)-(CH2)n-COOH的非单体同型或异型氨基羧酸如聚氨基羧酸，其中R表示质子或优选表示氨基、亚氨基、羟基、硫醇、羟基烷基、氨基烷基、或羧基烷基，n为0到6的数，优选为0。
20.权利要求1到19中任一项的装置，其中所述配体包括优选来源于细菌阿维丁氏链霉菌(Streptomyces avidinii)的蛋白或蛋白质。
21.权利要求1到20中任一项的装置，其中例如对于HbA1c的检测，至少一个配体为苯基硼酸。
22.权利要求1到21中任一项的装置，其中所述生物活性特异性结合分子具有用于至少一个配体的结合部位点或与配体结合。
23.权利要求1到22中任一项的装置，其中所述生物活性特异性结合分子具有至少一个用于结合被分析物的特异性结合区域。
24.权利要求1到23中任一项的装置，其中催化活性蛋白质优选与所述生物活性特异性结合分子和/或所述配体共价结合，或多个催化活性蛋白质优选与所述生物活性特异性结合分子和/或所述配体共价结合。
25.权利要求1到24中任一项的装置，其中伸长支柱(52)分为两个条，并以两个条的形式永久地粘附连接于所述载体(20)的两个纵向边缘(24)。
26.权利要求25的装置，其中所述条由聚合物材料和/或熔融粘合剂组成，并具有与液体吸收件(60)相同的厚度。
27.权利要求25或26的装置，其中所述条仅位于所述载体(20)的所述两个纵向边缘(24)的一部分上，在所述条和所述液体吸收件(60)之间具有空隙(70)，所述条在所述纵向边缘(24)上从该空隙(70)向上游延伸。
28.权利要求1到27中任一项的装置，其中所述覆盖物(54)由聚合物型、优选矩形的材料组成，并且以其覆盖所述载体(20)以及所述多电极组和所述液体吸收件(60)的方式连接于所述伸长支柱(52)。
29.权利要求1到28中任一项的装置，其中所述覆盖物(54)仅覆盖所述载体(20)的一个或多个部分。
30.权利要求8到29中任一项的装置，其中所述覆盖物(54)在其上游侧具有至少一个缝状和/或半圆形或多边形的凹口(56)和/或开口(56)，其以所述载体(20)的所述施样区域(22)可以被液体介质装载的方式布置。
31.权利要求1到30中任一项的装置，其中所述液体吸收件(60)粘附固定于所述覆盖物(54)的面向所述载体(20)的那一侧。
32.权利要求1到31中任一项的装置，其中所述覆盖物(54)或其至少一部分用表面活性物质处理。
33.权利要求8到32中任一项的装置，其中所述覆盖物(54)面向所述载体(20)的那一侧在所述多电极组区域中，特别是在所述工作电极(40)上面和所述参比电极(30)上面具有亲水性质，并且在所述施样区域(22)的区域内至少部分地具有疏水性表面。
34.权利要求27到33中任一项的装置，其中所述反应和检测箱(50)朝下游和上游方向开口，并且所述空隙(70)与反应和检测箱的下游端邻接。
35.权利要求11到34中任一项的装置，其中所述液体吸收件(60)在距离所述施样区域(22)为一定下游长度的地方布置在载体(20)上，并且覆盖所述导电轨迹(42)，例如直接位于导电轨迹上。
36.权利要求1到35中任一项的装置，其中所述液体吸收件(60)由吸收性多孔性纤丝状材料组成并粘附固定于所述载体(20)。
37.权利要求36的装置，其中所述多孔性材料由至少一个纤维层或至少一种织物构成，所述纤维层或织物由纤维素纤维或玻璃纤维或其混合物组成或由有机聚合物组成。
38.权利要求1到37中任一项的装置，其中所述液体吸收件(60)用表面活性物质处理，优选用具有亲水性质的表面活性物质处理。
39.权利要求9到38中任一项的装置，其中所述表面活性物质包含亲水基团如-COOMe、-OSO3Me、-SO3Me、-NH2、＝NH、-NR3+和具有10到18个碳或烷芳基基团的疏水性烷基链。
40.权利要求9到39中任一项的装置，其中使用的表面活性物质优选是实验式为C20H37NaO7S或C18H29NO3S的物质。
41.权利要求3到40中任一项的装置，其中所述聚合物材料为聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯、环氧树脂、甲基丙烯酸聚合物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、或所述化合物的共聚物。
42.权利要求3到41中任一项的装置，其中所述聚合物材料为箔，优选由聚酯、聚碳酸酯、或聚氯乙烯制成。
43.生产用于检测和测定至少一种溶于液体介质中的被分析物浓度的装置(10)，特别是权利要求1到42中任一项的装置的方法，其中a)将电极材料加工成糊，并将该糊施用于载体(20)，使得形成包括至少一个工作电极(40)和至少一个参比电极(30)和邻接的导电轨迹(42)以及接点(44)的多电极组，b)在高温下干燥具有所述多电极组的所述载体(20)，c)对所述载体(20)施用，即，在所述多电极组的所述区域内或布置在所述多电极组上游的区域内，对所述载体(20)施用配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质，和d)将伸长支柱(52)、覆盖物(54)、和液体吸收件(60)固定于如此得到的载体(20)，使得所述覆盖物(54)和所述载体(20)彼此留有间隔。
44.权利要求43的方法，其中所述糊包含配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质，并且其通过丝网印刷技术施用。
45.权利要求43或44的方法，其中所述干燥后的电极(40)中的至少一个优选在交联分子或结合试剂的帮助下用配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质涂覆。
46.权利要求43到45中任一项的方法，其中所述干燥后的电极(40)中的至少一个优选在交联分子或结合试剂的帮助下用配体和/或反应非特异性结合分子涂覆。
47.权利要求43到46中任一项的方法，其中液体吸收件(60)用表面活性物质的溶液处理并干燥，在优选实施方案中，该物质是实验式为C20H37NaO7S或C18H29NO3S的化合物，其使用浓度为0.001到5％w/v，优选0.1到3％w/v。
48.使用包括至少一个工作电极(40)和至少一个参比电极(30)的装置(10)、特别是权利要求1到47中任一项的装置(10)检测和测定至少一种溶于液体介质中的被分析物浓度的方法，其中a)对所述装置(10)的施样区域(22)施用可确定量的所述液体介质，b)经过可指定的时间段，使得所述被分析物与配体和/或生物活性特异性结合分子和/或催化活性蛋白质发生相互作用，c)对施样区域(22)施用溶液，该溶液包含至少一种对催化活性蛋白质或对多种催化活性蛋白质为反应特异性的底物，d)将所述装置(10)连接于电测量仪器，和e)在培养期之后，在与所述装置(10)连接的所述测量仪器上读取待测定的每种被分析物的电信号，并借助于校正曲线规定该信号为各个被分析物的相应浓度。
49.权利要求48的方法，其中所述可确定量为0.01到20μl，优选1到10μl，并且所述可指定的时间段为5到600秒，优选10到120秒，更优选20到60秒。
50.权利要求48或49的方法，其中0.1μl到500μl，优选1μl到100μl，更优选10μl到30μl量的包含反应特异性底物的所述溶液通过移液管施用。
51.权利要求48到50中任一项的方法，其中培养期为2到100秒，优选5到30秒，更优选20秒。
52.权利要求48到51中任一项的方法，其中将读取的所述电信号与来源于第二个非特异性工作电极(40″)的另一个电信号相比，该第二个工作电极(40″)只具有反应非特异性的配体或结合分子。
53.使用装置(10)，特别是权利要求1到42中任一项的装置(10)的方法，以及一种方法，特别是权利要求43到52中任一项的方法，上述方法用于检测和测定体液如全血、血浆、血清、尿、分泌物、脑脊髓液，和来自身体组织的提取物，和来自擦拭材料中的至少一种被分析物的浓度。
全文摘要
本发明提供了用于检测和测定液体介质中至少一种被分析物浓度的测量装置10，该装置包括聚合物载体20，聚合物载体20具有在其上游部分干燥的生物活性特异性结合分子，在下游区域中的载体上设有包括至少一个参比电极30和至少一个工作电极40的多电极组。工作电极40具有生物活性特异性结合分子。载体20具有施样区域22，其在下游方向与不变形的通流式反应和检测箱50、尺寸可变的空隙70、和液体吸收件60邻接。对于被分析物的定性和定量测定，将两种液体介质，即试样溶液和底物溶液，连续进样到施样区域22。试样溶液可包含想要的被分析物，底物溶液用于形成电信号。通过反应和检测箱50和空隙70的设计，该设计为几何规则并且不因流体介质而变形，因此可以进行精密的测量。
文档编号G01N27/403GK1789995SQ200510103760
公开日2006年6月21日 申请日期2005年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者伯恩哈德·迈泽盖尔, 于尔根·奥伯斯特拉斯, 德特勒夫·茨温曼, 赖因哈德·沙佩尔 申请人:阿纳里蒂科生物技术公开股份有限公司