专利名称：RNaseIII的突变基因在植物抗病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNaseIII的突变基因在植物抗病中的应用。
背景技术：
玉米作为我国三大粮食作物之一，其常年种植面积约2000万公顷，总产量达1200 亿公斤。然而，近些年来，由于玉米病毒病逐渐加重，已成为玉米生产上的重要病害，尤其是玉米粗缩病。玉米粗缩病是由灰飞虱传毒的一种病毒病害，广泛分布于除非洲、北美外的热带、亚热带和温带的玉米产区。最早在意大利发现，之后在以色列、法国、瑞士、西班牙、德国、挪威、前捷克斯洛伐克、前南斯拉夫和阿根廷等国发生。在我国，50年代玉米粗缩病在新疆南部、甘肃西部曾严重发生，70年代流行于华北，近年来在我国东北、华北、西北、华中及长江以南部分地区大面积暴发、流行，具明显的上升趋势，成为我国玉米上的重要病害之一。据不完全统计，1996年全国玉米粗缩病发病面积233万公顷，占玉米总种植面积的10% 以上，毁种绝收约4万公顷，一般病田病株率达10-40%，平均减产10-30%。2007年山东省大面积爆发玉米粗缩病，全省发生面积约340万亩，比往年都有所增加，严重时造成部分地块近绝收。以上数据表明，玉米粗缩病已成为我国玉米上的重要病毒病害之一。RNaseIII家族是一类依赖于dsRNA的特异性的内切核酸酶，在真核生物或原核生物中都有发现，如细菌、酵母、线虫、果蝇和人类等。此类酶在生物转录后调控中发挥着重要的作用在原核生物中，与rRNA前体的剪接，mRNA的代谢等生命过程密切相关；真核生物中，在性的发育或花的形成等生命活动起调控作用外，其缺失可造成生命的死亡。利用其切割dsRNA的特性，在生物体免疫，RNA干扰和植物抗病毒策略(PTR)等方面越来越发挥着重要功能。植物病毒多为单链正义RNA(ssRNA)，当病毒侵入植物体繁殖自身时，ssRNA复制形成dsRNA中间体，这正好是依赖dsRNA的内切核酸酶的靶向底物，RNaseIII结合到此结构，进行切割，形成小的RNA碎片。Court等于1993年提出因为植株基因组RNA很多都形成茎环状的二级结构，导入野生型的RNaseIII将会对植物的正常生长有很大危害。他们将大肠杆菌中的RNaseIII基因(rnc)中的第117个氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸后，这种突变体(rnC70)就只能结合双链RNA，而不能切割。目前还未有抗RBSDV的玉米品种，一旦感染玉米粗缩病，目前还没有好的根治办法，且抗性种质资源匮乏，因此开发转基因玉米抗病新品种来从根本上控制玉米粗缩病的爆发显得尤为重要和迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因植物方法。本发明提供的方法，为将RNaseIII突变体的编码基因导入目的植物，获得抗粗缩病的转基因植物；所述RNaseIII突变体的氨基酸序列为序列表中的序列4。所述RNaseIII突变体的编码基因(rnc70)为序列表中的序列1。所述目的植物为双子 叶植物或者单子叶植物。所述双子叶植物为玉米。所述粗缩病由下述致病菌引起水稻黑条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus, RBSDV)。所述RNaseIII突变体的编码基因(rnc70)通过表达载体导入所述目的植物，所述植物表达载体具体为PAM2025。本发明的实验证明，本发明将RNaseIII突变体的编码基因(rnc70)导入玉米中， 得到转基因玉米新品种，该新品种对于常见玉米病毒病具有较强抗性，在大田栽培过程中， 在相同的病毒病危害情况下，本发明培育的转基因玉米新品种与非转基因或感病对照组相比具有明显的抗病效果，从而对于减少病毒病危害，保障玉米稳产具有重要意义。
图1为转rnc70玉米植株的获得图2为转rnc70玉米植株基因组PCR检测结果图3为转rnc70玉米植株的PCR-Southern检测
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、转rnc70玉米的获得一、重组农杆菌的获得1、植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化取200 μ 1感受态农杆菌LBA4404(张荣，王国英，张晓红，赵虎基.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立.农业生物技术学报，2001，9(1) :45-48，公众可从中国农业大学和河北省农林科学院植物保护研究所获得)，加入lygpAM2025质粒(Mitra，Α.， Higgins, D. W. , Langenberg, W. G. , Nie, H. , Sengupta, D. N. , and Silverman, R. H. (1996). A mammalian 2—5A system functions as an antiviral pathway in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences93 (13)，6780-6785，公众可从中国农业大学和河北省农林科学院植物保护研究所获得，该质粒含有RNaseIII突变体的编码基因rnCC70，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列1，也可以人工合成序列1，RNaseIII突变体的氨基酸序列为序列表中的序列4.)，冰浴30min，液氮中速冻lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培养基(含有125mg/L链霉素)，28°C慢速振荡培养4h ；IOOOrpm离心30 秒，弃上清，加入0. Iml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有适当浓度的抗生素的YEB平板上，28°C培养约48h，得到重组农杆菌。2、阳性克隆的鉴定和保存挑取上述获得的重组农杆菌在含有相应抗生素的YEB平板上划线，28°C过夜培养，挑少许菌于含有2-3ml YEB液体培养基的指形管中，28°C过夜摇菌。用碱裂解法提质粒， 利用BamH I对提取的质粒进行单酶切鉴定，酶切后得到约681 bp大小的条带对应的质粒为酶切鉴定阳性质粒；同样，利用引物PRN3-3 :5，-CAACGGAAGCTGGGCTACAC-3，(序列2)禾口 PRN3-4 5 ‘ -TTGAACCTGTGCCAACCACC-3 ‘(序列 3)对质粒进行 PCR 鉴定，扩增得到约 592 bp 的片段的为PCR鉴定阳性质粒，将PCR鉴定结果与酶切鉴定结果均为阳性质粒即为阳性质粒。将含有该阳性质粒的重组农杆菌菌液加入甘油至终浓度为15%，混勻后保存于_70°C，或者将划线的平板4°C保存，每隔一个月继代一次，并命名为LBA4404/pAM2025。二、转rnc70玉米的获得1、农杆菌菌液的制备挑取继代3天后LBA4404/pAM2025单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，以250rpm进行振荡培养，在28°C培养至对数生长期后，将菌液置于离心管中，在 5000rpm下离心5min并收集菌体，将收集的菌体用含ΙΟΟμπιοΙ/L As (乙酰丁香酮)的 D-inf液体培养基洗1-2次，最后将菌体重悬浮于添加100 μ mol/L As的D-inf液体培养基中，OD值约0. 35-0. 45，放置0. 5h可用于转化，得到农杆菌菌液。D-inf液体培养基配方
权利要求
1.一种培育转基因植物方法，为将RNaseIII突变体的编码基因导入目的植物，获得抗粗缩病的转基因植物；所述RNaseIII突变体的氨基酸序列为序列表中的序列4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突变体的编码基因为序列表中的序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为玉米。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述粗缩病由下述致病菌引起水禾S漂条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus)。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突变体的编码基因通过表达载体导入所述目的植物。
全文摘要
本发明公开了一种RNaseIII的突变基因在植物抗病中的应用。本发明提供一种培育转基因植物方法，为将RNaseIII突变体的编码基因导入目的植物，获得抗粗缩病的转基因植物；所述RNaseIII突变体的氨基酸序列为序列表中的序列4。本发明的实验证明，本发明培育的转基因玉米新品种对于常见玉米病毒病具有较强抗性，在大田栽培过程中，在相同的病毒病危害情况下，本发明培育的转基因玉米新品种与对照组相比具有明显的抗病效果，从而对于减少病毒病危害，保障玉米稳产具有重要意义。
文档编号C12N15/84GK102250945SQ20111018729
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者于嘉林, 刘贺, 张志燕, 张永亮, 徐佳凌, 曹修岭, 李大伟, 田兰芝, 苗洪芹, 路银贵, 邸垫平, 韩成贵 申请人:中国农业大学, 河北省农林科学院植物保护研究所