专利名称：与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法
技术领域：
本发明属于生物技术育种领域，具体涉及与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法。
背景技术：
马蔺又名马莲、马兰花，拉丁文名/rishctea/ Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz，系鸢尾科鸢尾属多年生草本宿根植物，在我国北方野生分布广泛，抗旱抗寒性强、耐盐碱、耐粗放管理。叶片色泽青绿、花淡雅美丽、修剪频率少、病虫害少，是优良的观叶赏花地被植物。近年来，在我国逐渐被用作水保护坡、园林绿化观赏地的优良材料。同时，还属极具开发潜力的药用、饲用和经济植物资源，优异的耐盐和抗旱基因也有待开发。传统育种方法是对马蔺种质在苗期模拟盐分生境和大田生长形态、生理指标耐盐性鉴定，以筛选耐盐种质材料。这种方法研究时间长，工作量大，有时还常出现因抽样错误导致评价的失真。随着现代分子生物学的快速发展，随机扩增多态性DNA标记(random amplification of polymorphic DNA、RAPD)、扩增片段长度多态性标记(amplified fragments length polymorphism、AFLP)、简单重复序列标记(simple sequence repeat、 SSR)、相关序列扩增多态性标记(sequence-related amplified polymorphism、SRAP)、简单重复序列区间标记(inter-simple sequence r印eat、ISSR)等分子标记技术被广泛应用于植物优异抗性种质材料筛选与鉴定、遗传特性分析、目标基因标定、新品种选育等方面。 其中ISSR标记为显性标记，操作简单快速，覆盖整个基因组，揭示的多态性高、重复性好， 具有多等位基因的特性，被广泛应用于植物抗逆性鉴定和遗传图谱构建等的研究中。有报道关于“野生马蔺中和抗性有关基因片段的分离与初步分析”(《吉林农业科学》2005. 2，蔡玉珍等)，另外在马蔺抗旱种质鉴定及分子标记辅助筛选方面也有一些报道，但在马蔺耐盐基因的分子标记筛选和分子标记辅助育种方面，尚未见研究报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服马蔺传统育种方法中耐盐种质筛选困难的问题，本发明提供一种与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法。本发明提供的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，所述方法为用标记引物ISSR841扩增马蔺材料DNA，如果能扩增出220 bp,300 bp和320 bp的扩增片段，则标志马蔺耐盐基因的存在，所述标记引物ISSR841序列为GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中 Y= (C，T)。进一步，筛选所述分子标记引物的方法包括(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选； (2)耐盐基因池和敏盐基因池构建；(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得。所述(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选方法为对盐胁迫处理的马蔺种质材料定期测定生长形态指标及生理指标，利用组间平均法进行综合聚类分析，筛选强耐盐及敏盐种质材料。所述(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建将筛选的强耐盐及敏盐种质材料分别提取叶片DNA，将各强耐盐种质材料DNA等量混合构建耐盐基因池，将各敏盐种质材料DNA等量混合构建敏盐基因池。所述(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得选用已公布的 100条ISSR引物对耐盐基因池和敏盐基因池进行多态性筛选，经扩增谱带的比较分析，获得多态性分子标记引物。进一步，所述(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选方法为16份马蔺种质材料出苗3-4 真叶期时移苗于花盆中，移栽成活后5-6叶期，进行NaCl盐胁迫(利用化学试剂NaCl，根据设计浓度配成不同浓度溶液加入花盆中)，设置NaCl盐浓度分别为0. 4%、0. 8%、1. 2% (W/ V),并设对照水(不加NaCl盐)，均3次重复，每个材料12盆(每盐浓度设置3盆，并对照设置3盆)，每隔7天，分别对3个NaCl盐浓度胁迫处理和对照的马蔺种质材料的绿叶数、叶宽和株高的生长形态指标以及叶片丙二醛、脯氨酸、叶绿素和电导率的生理指标测定1次， 共测定4次，对0. 8%NaCl盐浓度连续胁迫到第28天时测得的3个生长形态指标和4个生理指标的数据，利用组间平均法进行综合聚类分析，将16份马蔺种质材料的耐盐性划分为 3个耐盐级别，筛选出2份强耐盐的种质材料和4份敏盐种质材料。所述16份马蔺种质材料分别为北京四季青镇1份，山西太原1份，内蒙古赤峰1 份、鄂尔多斯1份、临河3份、呼和浩特2份、科尔沁左翼中旗1份、科左后旗1份，新疆巩留县1份、特克斯县1份、察布查尔县1份和伊宁县2份。进一步，所述步骤(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建为取马蔺种质苗期的新鲜幼叶1克，于液氮中研磨成粉末，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法，使用植物基因组提取试剂盒进行马蔺基因组DNA的提取，用1% (w/v )琼脂糖凝胶电泳检测其质量，将所有材料DNA分别用超纯水稀释至10 ng/ μ L以供ISSR标记分析，将筛选出的2份强耐盐马蔺种质材料提取的叶片DNA等量混合构建耐盐基因池，将筛选出的4份敏盐种质材料提取的叶片DNA等量混合构建敏盐基因池。进一步，所述步骤(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得对耐盐基因池和敏盐基因池，选用已公布的100条ISSR引物进行多态性筛选，经过耐盐池和敏盐池扩增谱带的比较分析，获得多态性分子标记引物ISSR841和3个与马蔺耐盐基因相关或连锁的ISSR标记，分别为ISSR841-220、ISSR841-300和ISSR841-320，所述的扩增分子量分别为220 bp、300 bp和320bp。本发明利用温室苗期模拟盐分胁迫的技术方法结合ISSR分子标记，对马蔺种质资源进行耐盐性的鉴定评价，通过耐盐池和敏盐池DNA谱带的比对分析，优选出与马蔺种质耐盐基因相关或连锁的ISSR标记，提出一种与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，以及获得此马蔺耐盐基因相关或连锁ISSR标记的方法，以克服马蔺传统育种方法中耐盐种质筛选困难的问题，结果可重复性好。本发明具有以下突出优点
(1)本发明提供的一种与马蔺耐盐基因相关或连锁ISSR标记的方法，操作方法简单易行，结果可信，效率高，可快速预测来自不同生境条件下的马蔺种质材料的耐盐性能，利于马蔺耐盐亲本的筛选和马蔺耐盐新品系的确定，可加速马蔺耐盐新品种的育种。
(2)本发明筛选了 1个与马蔺耐盐基因相关或连锁ISSR标记的特异性引物，通过其获得了 3个ISSR分子标记，有利于马蔺耐盐基因的进一步挖掘。
附图1为利用本发明方法筛选得到的与马蔺耐盐基因相关或连锁的ISSR标记聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中第3、4泳道为引物ISSR841分别在耐盐和敏盐基因池扩增出的ISSR标记谱带，共扩增出三条耐盐基因池特有的多态性标记，分别为ISSR841-220、ISSR841-300、 ISSR841-320，扩增分子量分别为220 bp,300 bp,320 bp。第1、2泳道，第5、6泳道和第7、 8泳道分别为引物ISSR840、ISSR842及ISSR843扩增结果，这三条引物在耐盐和敏盐基因池间均无多态性。M为Marker D2000。附图2为利用引物ISSR841对4个马蔺材料的ISSR分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中第1泳道为材料BC-ML01，第2、3、4泳道分别为马蔺材料BC-ML02、BC-ML03、 BC-ML04，M为Marker D2000。在第1泳道中出现了扩增分子量分别为220 bp,300 bp,320 bp三条多态性标记，其他3个材料均没有。
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实施例1 与马蔺耐盐基因相关或连锁的ISSR标记获得方法
一、耐盐和敏盐种质材料的筛选 (1)选用北京草业与环境研究发展中心的科研团队于2009年从我国北方不同地区采集的16份野生马蔺种质材料，包括北京四季青镇1份(BJCY-ML001)，山西太原1份 (BJCY-ML006),内蒙古赤峰1份(BJCY-ML005)、鄂尔多斯1份(BJCY-ML007)、临河3份 (BJCY-MLO11、BJCY-MLO12、BJCY-MLO13 )、呼和浩特 2 份(BJCY-ML-16、BJCY-MLO18 )、科尔沁左翼中旗1份(BJCY-ML(^9)、科左后旗1份(BJCY-ML031)，新疆巩留县1份(BJCY-ML020)、 特克斯县1份(BJCY-ML021)、察布查尔县1份(BJCY-ML023 )、伊宁县2份(BJCY-ML022、 BJCY-ML035)。于2010年9月9日于北京草业与环境研究发展中心日光温室对16份野生马蔺种质材料在营养盘中育苗，种子利用98%(w/v )浓硫酸试剂预处理20-30 s，然后用清水冲洗5-8次至水清澈无酸味，以活化种子，提高出苗率。育苗基质采用草炭壤土 =2:1比例混合。出苗3-4真叶期时移苗于花盆(盆口内径22cm，高18cm)中，盆栽基质采用草炭 壤土 =1 1比例进行混合，每盆装基质1. 6 kg，定植10株。(2)移栽成活后于5-6叶期，进行NaCl盐胁迫(利用化学试剂NaCl，根据设计浓度配成不同浓度溶液加入花盆中)，设置NaCl盐浓度分别为0. 4%、0. 8%、1. 2%(w/v )，并设对照(不加NaCl盐的水)，均3次重复，每个材料12盆(每盐浓度设置3盆，并对照设置3盆)。 盐胁迫期间，每隔7天，分别对3个NaCl盐胁迫处理和对照的16份马蔺种质材料的生长形态指标(绿叶数、叶宽、株高)和叶片生理指标(丙二醛、脯氨酸、叶绿素、电导率)测定1次， 共测定4次。其中叶片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法测定；叶绿素含量采用分光光度计比色法测定；电导率采用电导仪法测定；绿叶数为测定时叶片的2/3以上为绿色的具有光合作用的叶片数目；株高为植株生长的自然垂直高度；叶宽为最长叶片中部的宽度。(3)对0. 8% NaCl盐浓度连续胁迫到第28天时测得的3个生长形态指标和4个生理指标的数据，利用SPSS16. 0软件以组间平均法进行综合聚类分析，将16份马蔺种质材料的耐盐性划分为3个耐盐级别，筛选出2份强耐盐的种质材料(BJCY-ML007、BJCY-ML-Ol 1) 和 4 份敏盐种质材料(BJCY-MLO18、BJCY-ML020、BJCY-ML021, BJCY-ML035 ) 二、耐盐基因池和敏盐基因池构建
(I)DNA提取取上述耐盐及敏盐马蔺种质材料苗期的新鲜幼叶Ig左右，于液氮中研磨成粉末，采用CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide)法，使用植物基因组提取试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司)进行马蔺基因组DNA的提取。TE (Tris-EDTA)溶解后于4°C冰箱内过夜，用1% (w/v )琼脂糖凝胶电泳检测其质量。将所有材料DNA分别用超纯水稀释至10 ng/ μ L，以供ISSR标记分析备用。(2)将筛选出的2份强耐盐的马蔺种质材料提取的叶片DNA等量混合和4份敏盐种质材料提取的叶片DNA等量混合，分别构建耐盐基因池和敏盐基因池。三、多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得
(1)对耐盐基因池和敏盐基因池，用“加拿大哥伦比亚大学(UBC)”公布的100条ISSR 引物进行多态性分析与筛选，获得特异性引物ISSR841，其序列为GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y= (C，T)。扩增反应在BIO-RAD C-100 PCR仪中进行。PCR反应体系为25 μ L 反应体系中含有 50 ng 模板 DNA，2. 5 mM MgCl2, 0.32 mM dNTPs, 0.4 μ M 引物，1. 5 U Taq酶以及IXPCR buffer。PCR反应程序为94°C预变性5min ； 94°C变性45s，53°C退火30s，72°C延伸1 min，进行44个循环；72°C延伸5 min ；然后置于10°C保存。(2)扩增产物在6% (w/v )聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电泳仪和电泳槽分别为DYY-10C型和DYCZ-28D (北京市六一仪器厂)，电泳时间3 h。凝胶银染方法参照^iang et al. (2002)的方法并稍作改进为取下凝胶板上的凝胶，放入已配置好固定液(340 ml, 0. 5%( v/v )乙酸+10% (v/v )乙醇)的保鲜盒中，置于摇床上，固定5-6 min;然后，倒掉固定液，用清水冲洗1次，倒入渗透液(300 ml，0. 2% (w/v) AgNO3),于摇床上渗透12 min ； 回收渗透液，凝胶用清水冲洗2次，倒入显色液(400 ml, 1.5% (w/v) Na0H+0. 6% (v/v )甲醛+0.002% (w/v)硫代硫酸钠)于摇床上至条带清晰地显出；倒掉显色液，凝胶用清水冲洗 2次，倒入终止液(400 ml，0. 75% (w/v) Na2CO3),暂时保存。于X线胶片观察灯上观察和记录电泳结果。(3)比对耐盐池和敏盐池的DNA扩增谱带，以耐盐池获得的特有条带为耐盐标记， 从而获得了 3个与马蔺耐盐相关或连锁的ISSR标记，分别为ISSR841-220、ISSR841-300、 ISSR841-320，扩增分子量分别为220 bp,300 bp,320 bp。(参见附图1)
实施例2 采用本发明的分子标记方法筛选耐盐材料的实例
2011年5月收集来自内蒙古不同生境4份马蔺种质材料，分别来自巴彦淖尔市 (BC-MLO1)，赤峰市(BC-ML02 )，兴安盟(BC-ML03 )和锡林郭勒盟(BC-ML04 )，其中 BC-MLO1 采自中度盐渍化低地草甸，其余3个材料采自温性草原(马蔺零星分布)。4个材料的种子用 98%浓硫酸试剂进行预处理20-30s，用清水冲洗掉种子上剩余浓硫酸，利用Ilcm培养皿发芽，每皿播种30粒种子。待马蔺种子叶片生长到4cm左右时开始利用。
(I)DNA提取取马蔺叶片Ig左右，于液氮中研磨成粉末，采用CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide)法，使用植物基因组提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行马蔺基因组DNA的提取。TE (Tris-EDTA)溶解后于4°C冰箱内过夜，用1% (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测其质量。将所有材料DNA分别用超纯水稀释至10 ng/yL，以供ISSR 标记分析备用。(2)PCR扩增扩增反应在BIO-RAD C-100 PCR仪中进行。引物为ISSR841，序列 GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y=(C，T)。反应体系为25 μ L反应体系中含有50 ng模板DNA，2.5 mM MgCl2, 0. 32 mM dNTPs, 0. 4 μ M 引物，1· 5 U Taq酶以及 IXPCR buffer。 PCR反应程序为94°C预变性5 min ； 94°C变性45 s，53°C退火30 s，72°C延伸1 min，进行44个循环；72°C延伸5 min ；然后置于10°C保存。(3)电泳扩增产物在6% (w/v)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电泳仪和电泳槽分别为DYY-10C型和DYCZ-28D (北京市六一仪器厂)，电泳时间3 h。(4)银染显色取下凝胶板上的凝胶，放入已配置好固定液(340 ml,0. 5% (ν/ν) 乙酸+10% (ν/ν)乙醇)的保鲜盒中，置于摇床上，固定5-6 min;然后倒掉固定液，用清水冲洗1次，倒入渗透液(300 ml,0. 2% (w/v) AgNO3),于摇床上渗透12 min;回收渗透液，凝胶用清水冲洗 2 次，倒入显色液(400 ml，1.5% (w/v) Na0H+0. 6% (ν/ν)甲醛+0. 002%(w/v) 硫代硫酸钠)于摇床上至条带清晰地显出；倒掉显色液，凝胶用清水冲洗2次，倒入终止液 (400 ml，0. 75% (w/v) NaCO3),暂时保存。(5)观片拍照于X线胶片观察灯上观察和记录电泳结果，同时拍照。(6)结果分析通过读带，在胶片上来自巴彦浩特市的材料BC-MLOl电泳谱带上在 220 bp,300 bp,320 bp处出现了明显的特有的多态性标记，另外3个材料则没有出现，通过结果可知4个材料中BC-MLOl耐盐性最强。(参见附图2)
尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。SEQUENCE LISTING <110>北京市农林科学院
<120>与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法
<130> "野生马蔺中和抗性有关基因片段的分离与初步分析"(《吉林农业科学》 2005. 2，蔡玉珍等 <160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Iris ensata
<400> 1
gagagagagagagagacc 18<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>Iris ensata
<400>2
gagagagagagagagatc
权利要求
1.与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于，所述方法为用标记引物ISSR841扩增马蔺材料DNA，如果能扩增出220 bp,300 bp和320 bp的扩增片段，则标志马蔺耐盐基因的存在，所述标记引物ISSR841序列为GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y 为C或T。
2.根据权利要求1所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 筛选所述分子标记引物的方法包括(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选；(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建；(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得。
3.根据权利要求2所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选方法为对盐胁迫处理的马蔺种质材料定期测定生长形态指标及生理指标，利用组间平均法进行综合聚类分析，筛选强耐盐及敏盐种质材料。
4.根据权利要求2所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建将筛选的强耐盐及敏盐种质材料分别提取叶片 DNA,将各强耐盐种质材料DNA等量混合构建耐盐基因池，将各敏盐种质材料DNA等量混合构建敏盐基因池。
5.根据权利要求2所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得选用已公布的100条ISSR 引物对耐盐基因池和敏盐基因池进行多态性筛选，经扩增谱带的比较分析，获得多态性分子标记引物。
6.根据权利要求3所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述步骤(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选方法为16份马蔺种质材料出苗3-4真叶期时移苗于花盆中，移栽成活后5-6叶期，进行NaCl盐胁迫，设置NaCl盐浓度分别为0. 4%、0. 8%、 1. 2%，并设对照，均3次重复，每个材料12盆，每隔7天，分别对3个NaCl盐胁迫处理和对照的马蔺种质材料的绿叶数、叶宽和株高的生长形态指标以及叶片丙二醛、脯氨酸、叶绿素和电导率的生理指标测定1次，共测定4次，对0. 8%NaCl盐浓度连续胁迫到第28天时测得的3个生长形态指标和4个生理指标的数据，利用组间平均法进行综合聚类分析，将16份马蔺种质材料的耐盐性划分为3个耐盐级别，筛选出2份强耐盐的种质材料和4份敏盐种质材料。
7.根据权利要求3所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述16份马蔺种质材料分别为北京四季青镇1份，山西太原1份，内蒙古赤峰1份、鄂尔多斯1份、临河3份、呼和浩特2份、科尔沁左翼中旗1份、科左后旗1份，新疆巩留县1份、特克斯县1份、察布查尔县1份和伊宁县2份。
8.根据权利要求4所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于， 所述步骤(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建为取马蔺种质苗期的新鲜幼叶1克，于液氮中研磨成粉末，采用十六烷基三甲基溴化铵法CTAB法，使用植物基因组提取试剂盒进行马蔺基因组DNA的提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，将所有材料DNA分别用超纯水稀释至10 ng/ μ L以供ISSR标记分析，将筛选出的2份强耐盐马蔺种质材料提取的叶片DNA等量混合构建耐盐基因池，将筛选出的4份敏盐种质材料提取的叶片DNA等量混合构建敏盐基因池。
9.根据权利要求5所述的与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，其特征在于，所述步骤(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得对耐盐基因池和敏盐基因池，选用已公布的100条ISSR引物进行多态性筛选，经过耐盐池和敏盐池扩增谱带的比较分析，获得多态性分子标记引物ISSR841和3个与马蔺耐盐基因相关或连锁的ISSR标记，分别为ISSR841-220、ISSR841-300和ISSR841-320，所述的ISSR标记扩增分子量分别为 220 bp,300 bp 和 320bp。
全文摘要
本发明提供一种与马蔺耐盐基因相关或连锁的分子标记方法，所述方法为用标记引物ISSR841扩增马蔺材料DNA，如果能扩增出220bp、300bp和320bp的扩增片段，则标志马蔺耐盐基因的存在，所述标记引物ISSR841序列为GAGAGAGAGAGAGAGAYC，其中Y=(C，T)。筛选所述分子标记引物的方法包括(1)耐盐和敏盐种质材料的筛选；(2)耐盐基因池和敏盐基因池构建；(3)多态性好且可重复的ISSR引物筛选及分子标记的获得。本发明提供的与马蔺耐盐基因相关或连锁ISSR标记的方法，操作简单易行，结果可信，效率高，可快速预测来自不同生境条件下的马蔺种质材料的耐盐性能，利于马蔺耐盐亲本的筛选和马蔺耐盐新品系的确定，可加速马蔺耐盐新品种的育种。
文档编号C12N15/10GK102260741SQ20111018664
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者孙福鼎, 孟林, 毛培春, 田小霞 申请人:北京市农林科学院