专利名称：一种植物抗热基因JAZ5a及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗热基因 JAZ5a及其应用。
背景技术：
白菜类蔬菜主要包括结球类大白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis) 禾口不结球类小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis)。小白菜简称青菜，北方称油菜，其适应性强，生长快，产量高，营养好，消费量居各类蔬菜之首，是我国长江流域各省普遍栽培的一种大众化蔬菜。小白菜种类和品种繁多，生长期短，适应性广，高产，省工，易种，可周年生产供应。产品鲜嫩、营养丰富，为广大消费者所喜爱。其年产量占蔬菜总产量的30-40%，对补充蔬菜淡季、实现周年均衡供应贡献很大。大白菜和小白菜特性都为喜凉性，一年四季均可生产，生长最适温度为15 20°C。近年来，为了适应市场的需要，集约栽培是白菜类蔬菜生产的主要特点。为了保证白菜类蔬菜一年四季的均衡生产和供应，小白菜常需一年四季采用不同的方式进行生产。以往主要在春冬季生产小白菜，开始在较炎热的夏秋季采取各种栽培方式种植小白菜，无疑在其生育期内，尤其是春末、夏季和早秋往往会受到高温逆境的胁迫。高温季节栽培小白菜在20天以后即可分批上市，但高温障碍往往使小白菜植株节间拉长、生长缓慢、味苦、纤维含量明显增加等，常常导致产量低、品质差， 市场价格上扬，供不应求，不能满足居民的消费需求。大白菜对炎热的高温忍耐力不强，特别在莲座期和结球期对温度要求严格，平均温度过高心叶就不能抱合，不能结球，即使勉强结球，也比较松散。夏季田间自然条件下，形成正常的叶球是耐热大白菜生产的先决条件， 田间自然高温条件下的结球性是鉴定大白菜耐热性的标准。大白菜和小白菜原产我国，国外对白菜类蔬菜的育种研究较少，从日本、韩国及我国台湾地区引进的品种耐热性差，不适宜在我国夏季生长和推广。国内所选育的品种主要为秋季抗病品种，白菜类蔬菜耐热基因库窄，耐热白菜品种选育仅局限于白菜材料之间的筛选，选出的品种耐热性、抗逆性不够理想。鉴于上述情况，我国育种家采用传统的育种方法广泛开展耐热白菜类蔬菜品种的选育工作，引进耐热基因，扩大资源来源途径，一定程度提高了白菜类蔬菜耐热能力，在生产上已经发挥了作用。然而，目前推出的是适合当地气候条件的为主要依据的评价耐热性的方法，且其依据主要是植物在高温胁迫下表现出形态结构的变化。这一方法在温带地区很难创造选择压力适宜的田间环境，即使选出耐热性单株，要将耐热性状保存到第二年春采种，需要采用一系列的较为繁杂的方法和措施，筛选周期长，且有地域性限制，不能将耐热品种广泛推广到其他地区。因此对白菜类蔬菜苗期热害症状的发生发展变化规律进行深入的研究，建立易于操作，结果稳定，效率较高的具有广泛推广性的苗期抗热性筛选方法和技术是白菜类蔬菜抗热育种工作亟需解决任务。与白菜抗热密切相关的性状属于数量性状，对其数量性状的基因型进行选择是非常困难的。针对分子育种，这种难度不仅表现在可利用于辅助选择的DNA标记不多，且QTUQuantitative Traits Loci，数量性状位点)在数目和作用上变化较大。因此，在白菜基因组测序工作尚未完成，功能基因组研究方兴未艾的情况下，遗传育种学家需要寻找一种快速、敏感、高效的， 在植株水平上各性状和DNA定性分析技术，以及植株水平上表型和基因表达变化的定量分析技术，用以白菜类蔬菜抗热育种研究。近年来分子生物学研究发展迅速，尤其是基因芯片技术在作物分子育种上的应用也越来越广泛。基因芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。基因芯片是将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成DNA微阵列。样品DNA或RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后探针再与已经标记过的样品分子进行杂交，最后通过荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，通过检测到的每个探针分子的杂交信号强弱，进而快速的获取样品分子在数量和序列方面的信息。目前，基因芯片技术已广泛应用于药物筛选、农业、疾病诊断和治疗、中药物种鉴定、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。关于基因芯片技术在植物中应用的报道并不多，主要集中在拟南芥、 草莓、牵牛花等方面。在基因芯片应用上，基因表达水平的分析与检测是目前研究最多、最为成熟的领域。由于芯片上可以固定成千上万的探针，使众多基因同时检测成为可能，不仅可以比较在不同条件一个基因组大量基因的转录水平差异，而且可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差异，从根本上突破了以前研究中一次只能关注1个或几个基因的瓶颈。因此，本领域需要探索利用芯片技术来开发植物抗热相关的基因的方法，以期获得一些有用的植物抗热相关基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物抗热基因JAZ5a。本发明的另一目的在于提供所述基因的应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的植物抗热蛋白，该蛋白是(a) SEQ ID NO 4氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO 4氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个，较佳地1_10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(C)与SEQ ID NO 4氨基酸序列有至少90%相同性，且具有与SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。 在一个优选例中，所述的植物是十字花科植物。在另一优选例中，所述的十字花科植物选自芸苔属植物；鼠耳芥属植物。在另一优选例中，所述的芸苔属植物是白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)。在另一优选例中，所述的鼠耳芥属植物是拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.)。在另一优选例中，所述的植物抗热蛋白来源于芸苔属植物。较佳地，来源于小白菜。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组
(i)编码所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种植物，其包含前面任一项所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种所述的蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的蛋白。在本发明的另一方面，提供所述的蛋白或其编码基因的用途，用于提高植物的抗热能力。在一个优选例中，用于提高植物在抽薹期的抗热能力。在本发明的另一方面，提供一种提高植物的抗热能力的方法，该方法包括提高植物中所述的蛋白的表达或活性。在一个优选例中，所述方法包括将编码所述的蛋白的多核苷酸转入到植物基因组中。在另一优选例中，所述方法包括(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的蛋白的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上。在另一优选例中，所述方法还包括(3)选择出转入所述蛋白的编码序列的植物细胞、组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。在本发明的另一方面，提供一种由前述方法制备获得的转基因植物。在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗热能力的分子标记物，所述的分子标记物是引物对，具有SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.青菜抗热和感热品种中BccL0X3和BccJAZ5的cDNA_AFLP结果。HSO、 HSl. . . HS5中数字0、1. . . 5分别表示处理编号，对应于上面的热处理后取样时间。m表示分钟，h表示小时。图2. RT-PCR分析抗热和热敏青菜品种中BccJAZfe和BccJAZ5b转录水平。46°C 热处理1个小时，提取植株总RNA。UBQ5作为对照。CK表示未进行热处理的对照，就是正常生长温度。0-1，0-2表示对照的两个重复，1-1，1-2表示热处理的两个重复。图3.转基因株系35S: :BccJAZ5a的T2代幼苗的热忍受表型。A. RT-PCR分析转基因植株(gBccJAZ5a)及野生型植株(Col)的BccJAZfe和内源AtJAZ5表达水平。gBccJAZ5A HR/Col T2表示将BccJAZ5A基因组DNA转入拟南芥中的转基因植株繁殖第二代的杂合株(g代表基因组DNA)。1-1，1-2，2-1，2-2，3-1，3-2中“-”之前数字分别表示转基因株系1，2和3，“-”后面数字分别表示转基因株系的两个重复。Col-I 与Col-2表示野生型拟南芥的两个重复。B.热处理转基因植株及野生型植株。7天苗龄的幼苗生长在22°C，热处理从40°C 到46°C 1个小时，然后恢复到22°C，7天后拍照。C. 3个转基因株系苗期生长状态。在正常生长条件下，与其它两个转基因株系(1# 和3#)相比，2号(2#)转基因株系植株变小。图4. 35s: =BccJAZfeR基因株系在抽薹期抗热能力增强。植株生长在22°C到抽薹，然后45°C热处理3小时或46°C热处理2. 5小时，再恢复到22°C生长5天后拍照。每个株系重复两个。图中1-1-1，1-1-2分别表示转基因株系1的两个T2代株系，2-1-8等分别表示转基因株系2的一个T2代株系，2-1-7是转基因株系2的T2代又一个株系。同样，3-1-1 和3-1-3是转基因株系3的T2代的两个株系。图5.分析BccJAZfe蛋白(SEQ ID NO 4)的结构域的示意图。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，利用芯片技术来开发植物抗热相关的基因，首次在芸苔属植物中分离到一种新的植物抗热基因，其可使得植物具有更好的热耐受能力。本发明人将该基因命名为“BccJAZ5a”。基于该基因，可制备抗热能力增强的转基因植物。本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)小麦、大麦、 黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝
卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的植物抗热蛋白(多肽)”、“分离的提高植物抗热能力的多肽”、 “分离的BccJAZfe蛋白”或“分离的BccJAZfe多肽”是指BccJAZfe蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BccJAZ5a蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主 (例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括BccJAZfe蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的BccJAZ5a蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或 (iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“BccJAZfe蛋白”指具有提高植物抗热能力的功能的SEQID NO 4序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗热能力的、SEQ ID NO :4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个， 最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5 个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括BccJAZ5a蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与BccJAZ5a蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BccJAZfe蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含 BccJAZfe蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 BccJAZfe蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有BccJAZfe蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。本发明还提供BccJAZfe蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BccJAZfe蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“BccJAZ5a蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 4的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种分离的植物抗热蛋白，其特征在于，该蛋白是(a)SEQ ID NO :4氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQID NO :4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与SEQID NO :4氨基酸序列有至少90%相同性，且具有与SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸；或( )与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO :1 或 SEQ ID NO 2 所示。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种权利要求1所述的蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出权利要求1所述的蛋白。
7.权利要求1所述的蛋白或其编码基因的用途，用于提高植物的抗热能力。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，用于提高植物在抽薹期的抗热能力。
9.一种提高植物的抗热能力的方法，其特征在于，该方法包括提高植物中权利要求1 所述的蛋白的表达或活性。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸转入到植物基因组中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的蛋白的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上。
12.一种鉴定植物的抗热能力的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物是引物对，具有SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种植物抗热基因JAZ5a及其应用。本发明人首次在芸苔属植物中分离到一种新的植物抗热基因，其可显著提高植物(特别是抽薹期植物)的热耐受能力。本发明还提供了所述基因编码的蛋白及其制备方法，含有所述基因的载体和宿主细胞，制备携带所述基因的转基因植物的方法。
文档编号A01H5/00GK102311490SQ20101022284
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者何玉科, 孙传宝 申请人:中国科学院上海生命科学研究院