专利名称：用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌njl-14的制作方法
技术领域：
本发明涉及能防除连作烟草青枯病的拮抗菌及用其制成的微生物有机肥料，属于 农业集约化生产技术领域，专用于克服和消除连作烟草青枯病问题。
背景技术：
烟草是我国主要的经济作物，其质量的优劣关系着国计民生。烟草青枯病是烟草 的主要病害之一，危害严重，谓之“烟癌”。1880年首次发现于美国，目前，在我国西南烟区 普遍发生，在疫区常呈暴发流行，造成毁灭性损失，发病严重时产量损失80%左右。烟草 青枯病是一种发病严重的土传性细菌性病害，该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一 些温暖的地区。在中国，此病在河南、山东、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东、福建等地普 遍发生，成为影响我国烟草产量及质量的罪魁祸首之一。烟草青枯病致病菌(Ralstonia solanacearum)能通过土壤、流水(灌溉等)、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。 青枯菌侵染土壤初期，由于病原菌数量少，植株表现为生长受限，矮小，畸形，易感病，农民 往往认为是养分问题而加大氮肥投入，导致土壤中微生物群落进一步失衡，病原菌在根际 占据优势地位，烟草青枯病发生。在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发 病率达100%，造成绝收。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便 随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原 料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了 我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还 到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥，再施入土壤。如果将 这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成 的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。
发明内容
1.技术问题本发明的目的在于研制一种能防除烟草青枯病的拮抗微生物有机肥料，防治效率 达到80%以上，使大量的连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。2.技术方案用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌，包括菌株NJL-25和菌株NJL-14，其中，菌株NJL-25属于短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，2009年7月9日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 3175，主要生 物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢，菌落平滑，严格好氧生长，接触酶阴性、V. P.反应阴性，甲基红试验阴性，发酵蔗糖、果糖、甘露醇、山梨 醇等产酸不产气，硝酸还原酶阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，不产生 硫化氢，产生吲哚，最适生长温度30°C，最适pH为7. 0 ；菌株NJL-14属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，2009年7月10日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 3174，主要生物学特 性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，孢囊无明显膨大，芽孢圆形或柱形，中生或近中 生。表面粗糙，扁平，不规则，兼性好氧生长，接触酶阳性、V. P.反应阳性，甲基红试验阳性， 发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨醇等产酸不产气，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明 胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，不产生硫化氢和吲哚，最适生长温度30°C，最适pH为7. 0。用上述拮抗菌所生产的防除连作烟草青枯病的微生物有机肥料，其特征在于该 肥料中分别含有1 X IO10个/g以上的拮抗菌NJL-25和NJL-14、全氮质量比含量为4 5%， 全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%、有机质质量比含量为 30 35%。所述防除连作烟草青枯病的微生物有机肥料的生产方法，包括1)将菌株NJL-25和菌株NJL-14分别接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发 酵生产的条件为初始PH范围为7. 0-7.2，培养温度301，溶氧通气量范围为30 100%， 170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> 1 X IO10个/ml ；所用 PDA培养液配制方法为(以配置IL培养基为例)用200g 土豆削皮后切成小块放到水里 煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7. 2-7. 4， 121 °C 灭菌 20min。2)将NJL-25和NJL-14液体菌剂按50L/吨的量分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜 粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵中每天翻堆1次，发酵5-7 天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8个/g以上，分别获得拮抗菌N几-25和N几-14的固 体菌剂；所用腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量>35%，有机氮含量为 1. 2-2%，含水量 25-30% ο3)按堆肥和菜粕的微生物分解混合物两类分别将拮抗菌N几-25固体菌剂和 N几-14固体菌剂以体积比1 1混合，获得堆肥的固体混合菌剂和菜粕微生物分解混合物 的固体混合菌剂。4)再将堆肥的固体混合菌剂按体积比50-70%与菜粕微生物酶解混合物的固体 混合菌剂按体积比30-50 %的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温 度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除连 作烟草青枯病的微生物有机肥料。所述微生物有机肥料可专用于防除连作烟草青枯病。3.有益效果本发明一种能克服或消除连作烟草青枯病的微生物有机肥料及其生产方法，利用 猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料， 其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点1)该肥料产品中含有两种抑制烟草青枯病病原细菌生长的专一性高效菌株(短 短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌)，其抑制效果非常显著。试验结果表明，在连作烟草青枯病的土壤上施用本产品后，烟草青枯病的生物防治率达80%以上，连续三年施用本肥料的土壤， 青枯病的生物防治率更高。2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(含量30-35%)，有机氮含量为4%，而且 大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总磷含量为4%，而且生物有效性特别高，使用本产 品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差。 有机肥料中含有的丰富营养也为其中的拮抗菌提供了生长繁殖的条件，使在土壤中存活下 来并形成优势群，从而发挥防病作用。3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而 有利于烟草的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治青枯病化学农药的用量，这不仅 可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农 民增加收入。
四
图1 拮抗菌NJL-25和NJL-14的抑菌圈A :NJL-25的抑菌圈 B =NJL-14的抑菌圈图2 温室盆栽试验防治效果
五具体实施例方式(一 )菌株的分离和鉴定采集已经发生连作障碍并出现严重青枯病病症的植株和周围土壤，样品低温 保存，采用Kelman ‘s TTC Agar选择性培养基分离病原菌——茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。然后以青枯病病原菌为指示菌，从来自于连作烟草青枯病发病田块中的健 康烟草植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验和大田试验最终复筛出高效拮抗菌株 NJL-25和NJL-14，鉴定到属种，菌种于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌NJL-25和NJL-14 的抑菌圈直径分别为24mm、29mm(图1)。菌株NJL-25属于短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，主要生物学特性为革 兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢，菌落平滑，严格好氧生长， 接触酶阴性、V. P.反应阴性，甲基红试验阴性，发酵蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇等产酸不产 气，硝酸还原酶阴性，淀粉水解阴性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，不产生硫化氢，产生 吲哚，最适生长温度30°C，最适pH为7. 0 ；菌株NJL-14属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，主要生物学特性为革兰氏 染色阳性G+，细胞形状为杆状，孢囊无明显膨大，芽孢圆形或柱形，中生或近中生。表面粗 糙，扁平，不规则，兼性好氧生长，接触酶阳性、V. P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄 糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨醇等产酸不产气，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳 性，分解酪蛋白阳性，不产生硫化氢和吲哚，最适生长温度30°C，最适pH为7. 0。( 二 )菌剂生产1)将菌株NJL-25和菌株NJL-14分别接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产， 其发酵生产的条件为初始PH范围为7. 0-7. 2，培养温度30°C，溶氧通气量范围为30 100%，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> 1 X IO10个/ml ；所用PDA培养液配制方法为(以配置IL培养基为例)用200g 土豆削皮后切成 小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C灭菌 20min。2)将NHL-25和NJL-14拮抗菌液按50L/吨的接种量接种到腐熟的猪粪堆肥 和菜粕的微生物酶解混合物进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度 30-500C，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8个/g以上，获得拮抗菌N几-25固 体菌剂和N几-14固体菌剂。所用腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量 ^ 35%,有机氮含量为1.2-2%，含水量25-30%。。其中菜粕的微生物分解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利 ZL200610086126. 0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株37_1发酵液加 入到菜粕原料中，调节含水量55-65%和pH6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上 升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开 始后，堆物的PH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在 55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5. 0左右，再进 行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。3)按堆肥和菜粕的微生物分解混合物两类分别将拮抗菌N几-25固体菌剂和 N几-14固体菌剂以1 1混合，获得堆肥的固体混合菌剂和菜粕微生物分解混合物的固体 混合菌剂；4)再将堆肥的固体单菌菌剂、混合菌剂按体积比70%与菜粕微生物酶解混合物 的固体混合菌剂按体积比30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后 在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，获得防除连作烟 草青枯病的的单菌微生物有机肥(分别含菌株N几-25、菌株N几-14)、混合微生物有机肥 (含菌 NJL-25 和菌 NJL-14)。用上述拮抗菌所生产的混合微生物有机肥(防除连作烟草青枯病的专用微生物 有机肥料)，该肥料中含有1 X IO10个/g以上的拮抗菌NJL-25和NJL-14、全氮质量比含量 为4 5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%、有机质质 量比含量为30 35%。(三)温室盆栽试验供试土壤为烟草连作土，青枯病发病严重。烟草种子采用烟草青枯病敏感型的“云 烟97”。处理如下CK1 健康水稻土 ；CK2 烟草连作土 ；Tl :CK2+氨基酸有机肥；T2 :CK2+NJL_25液体 发酵液；T3 :CK2+NJL-14液体发酵液；T4 :CK2+NJL-14和NJL-25发酵液混合物(1 1) ；T5 CK2+NJL-25微生物有机肥；T6 :CK2+NJL_14微生物有机肥；T7 :CK2+NJL_14和NJL-25混合 微生物有机肥。 每处理采用4个重复，每重复23kg病土 /盆，接种拮抗菌，使拮抗菌在土壤中的浓 度达到108cfu/g干土，T5-T7每盆施115g微生物有机肥，其他处理用化肥补齐肥料差异。 烟苗移苗前，在菌悬液中浸泡30min。接种拮抗菌后10天开始记录发病情况，25天后，CK2 发病率达100%，而接种拮抗菌液或微生物有机肥都能有效降低青枯病的发病率，其中使用NJL-14和NJL-25生产的混合微生物有机肥表现出最好的防治效果(图2)，发病率为0%。拮抗菌的施入，不但可以起到防治烟草青枯病，大大减少土壤中青枯病原菌 (R. solanacearum)数量的作用，促进烟草根际微生物群落的变化，有益细菌群落显著增加， 有害真菌及病原菌群落显著减少(表1，还能使烟草的生物量显著增加(表2)，施入拮抗菌 尤其是施入微生物有机肥处理的生物量与CKl和CK2都呈显著差异。用微生物有机肥比直 接使用液体菌剂的生防效果更好(生物量增加到1. 65倍)。施入拮抗菌后，烟草的系统抗病性也有所增强，相关酶的酶活也显著提高。可能是 拮抗菌的加入引起了烟草植株系统抗性的产生。(表3)(四)田间试验2009年在安徽省宣城市黄渡乡柏枧村烟草青枯病发病严重的大田施用微生物有 机肥。大田试验处理1、施用当地烟草专用复合肥；2、施用由NJL-14和NJL-25生产的 混合微生物有机肥。将青枯病发病严重一块田以随机的方式布置成四个重复，每重复2个 处理，共8个小区。烟草品种为当地惯用品种云烟97，烟苗和肥料都采用穴施，生物有机肥 施入量按30kg/亩田，用化肥补齐处理1、2间的肥料差异。定期到田间采集数据，统计发病率、病情指数和微生物区系，最后采收后计算其不 同处理间生物量的差异。施入由混合拮抗菌微生物有机肥可以显著地减少青枯病害的发 生，防治率达97. 6%以上，烟叶产量增加2. 27倍(表4)。本发明专利从微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著消除连作烟草青 枯病发生的微生物有机肥料产品，防治率达97. 6%以上(安徽大田试验)。本肥料产品的 作用机制在于本肥料产品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源给连作障碍土壤有益微生 物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速恢复和建立外源有益功能菌微生物的生态及其 食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障 碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了烟草作物的立苗率和抗逆能力。表1 不同盆栽处理根表微生物的含量差异 表2 不同盆栽处理鲜重、干重差异 表3 不同处理间地上部系统抗性酶和与次生代谢物有关的各种酶的变化 表4 安徽大田试验效果 注防病率=100X (对照感病指数_处理感病指数)/对照感病指数烟草病情分级行业标准0级全株无病。1级茎部偶有退绿斑，或在有条斑一侧 有少数叶片凋萎。2级茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎。3 级。4级病株基本枯死。
权利要求
用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌NJL-14，属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，2009年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3174，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，孢囊无明显膨大，芽孢圆形或柱形，中生或近中生。表面粗糙，扁平，不规则，兼性好氧生长，接触酶阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨醇等产酸不产气，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性，不产生硫化氢和吲哚，最适生长温度30℃，最适pH为7.0。
全文摘要
本发明涉及用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌NJL-14，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对烟草青枯病病原细菌有显著拮抗作用的两种拮抗菌(短短芽孢杆菌NJL-25和蜡状芽孢杆菌NJL-14)，利用该拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中分别含有1×1010个/g以上的NJL-25和NJL-14、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在已经有烟草青枯病的土壤中青枯病的生物防治率达97.6％以上。在还没有形成连作障碍的土壤上长期施用本微生物有机肥料能在很大程度上防止连作烟草青枯病的发生。
文档编号C05F11/08GK101886055SQ20101022233
公开日2010年11月17日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者刘艳霞, 徐阳春, 杨兴明, 沈其荣, 沈标 申请人:南京农业大学