一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术检测领域，具体地说是一种特异识别链霉素的核酸适配子的 筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 链霉素（Str印tomycin)是一种广谱氨基糖苷类抗生素，可抑制革兰氏阴性杆菌和 部分革兰氏阳性杆菌的，广泛应用于医药、农业及畜牧业中。但是，在实际使用中，由于使用 不合理或非法使用，导致其在肉类、肝脏、肾脏、牛奶和蜂蜜等动物源性食品中的大量残留， 严重地危害了人类健康，可使人产生一系列过敏反应和肾毒性、耳毒性等病症，甚至会导致 失聪。因此，FDA、欧盟和我国等许多国家和地区均对链霉素的最大残留限量做了严格的规 定，可见，检测链霉素在食品中是否有残留以及残留量多少具有重要的意义。
[0003]目前，链霉素残留的检测方法主要有以下三种。第一，微生物法。微生物法依赖 于抗生素对微生物的生理机能、代谢过程的抑制作用，主要有琼脂扩散法、纸片法、杯碟法、 TTC法等。此类方法检测链霉素所需设备简单、花费低廉，适用于大批量样品的检测，但是此 方法耗时长、稳定性差、灵敏度低，不能满足链霉素的准确高效测定的要求。第二，仪器分析 法。主要有气相色谱、液相色谱、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等。仪器分析法是一种可 靠灵敏的方法，具有高效率、高速度分离，操作自动化的特点，但是也存在如下缺陷。如液相 色谱法在应用中由于链霉素为非挥发性化合物，且在紫外可见光区无吸收，所以采用气相 色谱的方法时，样品脱蛋白后，检测需要用三甲基咪唑、七氟丁酰咪唑进行柱后衍生或者荧 光标记，这就导致实验操作繁琐；而且液相色谱都需要进行样品前处理，昂贵的仪器还有专 业的人员操作，因此其应用受到一定限制。如毛细管电泳法相对于液相色谱法具有样品用 量少的优点，常见的分离模式是毛细管区带和胶束电动，但是因为其检测器是传统的分光 光度检测器，检测的灵敏度很低，所以用其检测氨基糖苷类的报道很少。如薄层色谱法是一 种微量、操作简单的色谱分离方法，且链霉素具有伯氨基，显色剂中的茚三酮可与伯氨基发 生显色反应，因此能够实现链霉素的检测，但是该方法灵敏度和准确性不高，不适合定量检 测。第三，免疫法检测。许多基于抗原抗体反应的免疫反应也能检测链霉素：如酶联免疫、 化学发光免疫、荧光免疫以及免疫胶体金等。这些方法在食品检测方面与液相色谱相比，具 有简单、高特异性、高灵敏性、适于大批量检测的优点。但是，制备单克隆抗体花费大量的时 间和金钱，而且不同批次间性能也不稳定，尤其是小分子的抗体不能直接筛选，小分子属于 半抗原，只有修饰后小分子才能产生抗体。可见，当前这些检测小分子链霉素的方法并不十 分完善，所以建立一种新的快速、精确、灵敏、经济的检测链霉素残留的方法是行业内积极 探索的课题。
[0004] 适配子是用SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸序列库中人工筛选出的与靶 标有高亲和力和特异性的寡核苷酸序列，它可特异性识别并结合蛋白、小分子、离子、细胞 等靶物质。由于链霉素等小分子抗体制备较为困难，所以适配子作为检测小分子物质的分 析工具，将具有广阔的应用前景。SELEX技术利用大容量的随机寡核甘酸文库与靶分子的相 互作用，从中筛选出与靶分子特异性结合的寡核苷酸并结合体外PCR扩增技术，使其得到 指数级富集，如此循环数轮最终进化成为高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。到目前为 止，人们已筛选了许多小分子物质的特异性适配子，并以适配子为基础开发了一系列小分 子物质的检测系统。但是，目前在国内外的研宄中，还没有发现关于特异性识别链霉素的适 配子以及利用筛选到的适配子对链霉素进行快速、准确定性及定量检测的相关报道。宄其 原因，主要是由于采用现有通用的SELEX技术筛选适配子不仅存在方法步骤繁杂，更主要 的是筛选到的适配子假阳性高、亲和性和特异性差，根本达不到应用的需求。因此，开发一 种用于筛选亲和性高、特异识别小分子链霉素的适配子的方法，并将筛选到的适配子应用 于链霉素的检测中具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种特异性识别链霉素的核酸适配子的筛选方法，以解 决现有普通适配子的筛选方法步骤复杂，所筛选的适配子假阳性高、亲和性和特异性差的 问题。
[0006]本发明的目的之二是利用所述筛选方法获得的特异性识别链霉素的适配子在检 测链霉素中的应用，以解决现有技术检测链霉素存在要么检测工序繁琐、费时费力、成本较 高，要么精确度和灵敏性相对较差的问题。
[0007] 本发明是这样实现的：一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法，包括以下 步骤： (A) 将环氧基活化凝胶与链霉素偶联缓冲液按体积比为3:10混合，35-37°C孵育 15_18h，用PBS溶液洗涤，加入乙醇胺进行封闭，室温孵育1-2h;洗涤，抽滤干燥，得链霉 素-环氧基凝胶偶联复合物；所述链霉素偶联缓冲液为每毫升含20mg链霉素的0.lmol/L 的Na2C03-NaHC03缓冲液； (B) 将所述链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入层析柱内，洗脱，得阳极柱；同时将没 有偶联链霉素的环氧基活化凝胶洗涤，装入层析柱内，得阴极柱； (C) 构建ssDNA随机文库，设计80bp的单链寡核苷酸随机文库，中间为40bp随机序 列，两端分别为20bp固定序列，序列全长为： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3' ； (D) 将500pmol所述ssDNA随机文库溶解于lml结合缓冲液中，95-100°C预变性5min， 4°C冷却10min，得ssDNA随机文库结合缓冲液；将所述ssDNA随机文库结合缓冲液加入到 阴极柱内，36-37°C孵育10-15min，收集未与阴极柱内物质结合的ssDNA随机文库结合缓 冲液，加入到阳极柱内，36-37°C孵育1-1. 5h后，用淋洗缓冲液淋洗，再加入洗脱缓冲液进 行洗脱，收集洗脱缓冲液，除杂质，使洗脱缓冲液中的ssDNA沉淀，得ssDNA沉淀； (E) 将所述ssDNA沉淀溶解，以溶解后的ssDNA为模板，加入生物素标记的上游引物和 荧光标记的下游引物进行对称PCR扩增，将扩增产物纯化，得纯化产物； (F) 在纯化产物中加入等体积的链霉亲和素磁珠，37°C孵育30min，磁分离已结合纯化 产物的链霉亲和素磁珠，洗涤，解链，得荧光标记的ssDNA，将所述荧光标记的ssDNA作为第 二轮筛选的次级文库，以次级文库为模板溶解于结合缓冲液中，加入阳极柱内，37 °C孵育1 h，淋洗，洗脱，沉淀，溶解，对称PCR扩增，纯化，磁珠分离，解链，得到的ssDNA作为第三轮筛 选的次级文库，如此循环筛选10轮，以最后一轮筛选到的荧光标记的ssDNA作为模板，加入 上游引物和下游引物进行对称PCR扩增，得扩增产物；将所述扩增产物连接pUCM-T载体，转 入大肠杆菌，挑取含ssDNA单克隆质粒进行测序，得到与链霉素亲和性较高的ssDNA核苷酸 序列； (G) 取步骤（F)中含有与链霉素亲和性较高的ssDNA所述对应的转化菌进行培养，提取 质粒，以所述质粒为模板，加入生物素标记的上游引物和荧光标记的下游引物进行对称PCR 扩增，纯化，将纯化产物用所述链霉亲和素磁珠37°C孵育30min，磁分离，洗涤，解链，获得 不同核苷酸序列的焚光标记的ssDNA; (H) 将每种荧光标记的ssDNA分别溶解于结合缓冲液中，加入到阳极柱内，37°C孵育30 min，用淋洗缓冲液淋洗，加入洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱缓冲液，检测洗脱缓冲液的荧 光强度，将洗脱缓冲液所测得的荧光强度与加入阳极柱最初的荧光标记的ssDNA的荧光强 度相比较，其荧光强度最大的所对应的ssDNA即为特异识别链霉素的最高亲和力核酸适配 子，其核苷酸序列为：CCCGITTAAAGTAGITGAGAGTAITCCGmCTTTGTGTC(见SEQIDNO:l)。
[0008] 本发明所述核苷酸适配子加上固定序列后其核苷酸序列为： 5 '-ACCGACCGTGCTGGACTCTGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCCAGTATGAGCGAGCGITGCG-3'，其二级结构特征如图1所示。
[0009] 本发明步骤（D)和步骤（H)所述的结合缓冲液包括20mmol/LTris_HCl，50mmol/ LNaCl，5mmol/LKC1 和 5mmol/LMgCl2，其pH值为 8.0。
[0010] 本发明步骤（D)和步骤（H)所述的淋洗缓冲液包括20mmol/LTris_HCl、50mmol/ LNaCl