,在砂芯漏斗中抽干，转移至10mL的亲和层析柱中，得阴极柱。
[0036] (3)构建ssDNA随机文库： 利用01igo6.0和primerpremier5.0设计80bp的随机单链寡核苷酸（single strandDNA，ssDNA)文库，中间为40bp随机序列，两端分别为20bp固定序列，具体序列 全长为： 5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3'。
[0037] 设计PCR扩增引物如下： 上游引物PI:5' -ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3'， 生物素标记的上游引物P2 :5' -Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3' ； 下游引物P3 :5'-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3'， 荧光标记的下游引物P4:5' -FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3'。
[0038] 所述ssDNA随机文库序列及上、下游引物及标记引物均由上海生工生物工程股份 有限公司合成。
[0039] (4)适配子筛选与鉴定： a、 偶联：取步骤（3)合成的ssDNA随机文库500pmol溶解于lml结合缓冲液(包括20 mmol/LTris_HCl、50mmol/T,NaCl、5mmol/T,KC1 和 5mmol/T,MgCl2,pH值为8. 0)中，10CTC 变性5min，4°C冷却10min后，将其加入到阴极柱内，37培养箱中孵育10min，收集未与阴 极柱内环氧基活化凝胶相结合的ssDNA随机文库加入到阳极柱内，37°C孵育1h;然后用淋 洗缓冲液(包括20mmol/LTris-HCl，50mmol/LNaCl，5mmol/LKC1，5mmol/LMgCl2和质 量比浓度为0. 01%的Tween20，pH值为8. 0)淋洗200个柱体积，流出速度1mL/min，最后加 入 1mL洗脱缓冲液(包括 20mmol/LTris-HCl, 50mmol/LNaCl，5mmol/LKC1，5mmol/L MgCl# 10mmol/L的链霉素，pH值为8. 0)，洗脱五次，收集每次洗脱缓冲液，在收集的洗脱 缓冲液中加入洗脱液1/10体积的3mol/LNaAc，使其最终浓度为0.3mol/L，充分混匀后 加入等体积的预冷异丙醇，-20°C静置过夜，在4°C下，12000rpm离心15min，弃上清，用质 量比浓度为70%的乙醇溶液洗两次（12000rpm离心15min)，小心移出上清液，滤纸吸去管 壁上所有的液滴，于室温下以使残留的液体挥发至干，得ssDNA沉淀，记为（1，目）； b、 对称PCR扩增：将ssDNA沉淀用60°C预热的100yLddH20溶解，以0. 5yL溶解后 的ssDNA为模板，用生物素标记的上游引物P2 (5'-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3,）、荧 光标记的下游引物P4 (5 ' -FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3 '）进行对称PCR扩增，其所述对 称PCR扩增的体系为：取浓度均为10ymol/L的生物素标记的上游引物P2、荧光标记的下 游引物P4 各 0.5yL，ddNTPlyL，PCRbuffer2yL，Taq酶 0.1yL，灭菌水 15.4yL〇 扩增程序为：94°C预变性3min，94°C变性45s，68°C退火45s，72°C延伸45s，6轮热循环。 平行做5管，得到第一轮筛选扩增产物，记为（1，d); c、PCR纯化：PCR产物用纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司）进行纯化，将 PCR产物加入到平衡好的吸附柱中，12000rpm离心，筛掉50bp以下的DNA序列，回收50 bp以上序列，去除杂带，得纯化对称PCR产物，记为（1，c); d、 次级文库的制备：先制备链霉亲和素磁珠，取5mg(1mL)氨基磁珠超声混匀，装入 10mL的EP管中，用5mL的PB(0.1mol/LpH7. 4)混悬，磁分离，吸弃上清液，用PB洗 三次；加入质量百分比浓度12%的新配的戊二醛5mL，37°C摇床孵育4h，PB洗三次；加入 1mL100yg/mL的链霉亲和素(链霉亲和素溶于双蒸水中)，37°C摇床孵育4h，得链霉亲 和素磁珠，磁分离链霉亲和素磁珠，清洗干净备用；将氨基磁珠和链霉亲和素磁珠进行红外 检测，验证其偶联结果，结果见图3 ;其中图中a为氨基磁珠，b为链霉亲和素磁珠。
[0040] 由图3中b可见，红外图谱显示链霉亲和素磁珠在544cnT1和1606cnT1处有吸收 峰，而席夫碱的特征峰在1650~1590cnT1范围，说明有C=N缩振动峰产生；红外图谱区别 于氨基磁珠，证明链霉亲和素磁珠成功偶联； 取6~7X107 (1mg)链霉亲和素磁珠，用2倍B&W缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH 7.5，lmmol/LEDTA，2.0mol/LNaCl)洗涤磁珠一次；上磁力架1-2min，吸弃洗涤液；取100yL1倍B&W缓冲液混悬；加入100yL等体积的纯化对称PCR产物（1，c)，37°C摇床结合 30min;上磁力架1~2min，分离已结合对称PCR产物dsDNA的链霉亲和素磁珠，用1倍B&W 缓冲液洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠2~3次，对链霉亲和素磁珠结合的dsDNA进行解 链，具体为：加入200yL的150mmol/LNaOH，37°C孵育15min，使dsDNA解链；上磁力架， 含生物素的一条ssDNA留在链霉亲和素磁珠上并吸附在管壁，而另一条与其互补的荧光标 记的ssDNA存在于上清中，记为目标产物，记为（1，s)。测量链霉亲和素磁珠制备的（1，s) 产物以及纯化后（1，c)的荧光强度，计算其回收效率。计算结果为：将荧光强度为112. 67 荧光标记的PCR产物加入链霉亲和素磁珠解链后得到的上清液中荧光强度为38. 67,回收 率为34. 32%。并可根据荧光强度，计算其每一轮的亲和力。
[0041] e、每一轮筛选：取目标产物（1，s) 500pmol结合缓冲液定容至1mL，95°C变性2 min后，立即放置4°C水浴10min，加入阳极柱，孵育1h，通过淋洗，洗脱得到（2,目），（2，d)，（2，c)，（2，s)。第三轮同第二轮类似，取（2，s) 500pmol与阳极柱孵育得到（3，s)，用 于第四轮的筛选。第四轮相比于第三轮，需要进行反筛，取（3,s) 300pmoL，用结合缓冲液 定容至1mL，95°C变性2min后，立即放置4°C水浴10min，加入阴极柱，孵育10min，转 入阳极柱孵育1h，通过淋洗，洗脱，进行第四轮筛选得到（4,目），（4,d)，（4,c)，（4,s)。 [0042] 第五轮到第十轮重复第一轮的筛选，每三轮筛选进行一次反筛，用于除去非特异 性结合的序列。将第十轮筛选到的ssDNA(10,目）作为模板加入上述上游引物P1和下游 引物P3进行PCR扩增，扩增程序同上，将每轮的对称PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 得到图4,图中1、2、3、4分别为第3轮、5轮、7轮、9轮筛选的PCR产物，M表示Marker;从图 中可以看出条带清晰，无杂带；以每一轮的次级文库测量其荧光强度，作为评价每一轮亲和 力的标准，洗脱收集的次级文库荧光强度越高，亲和力越高，结果见图5,图中1~10分别表 示SELEX筛选每轮PCR产物的荧光值。
[0043] 将第十轮筛选得到的ssDNA为模板对称PCR扩增得到的产物纯化后，连接pUCM-T 载体，转入大肠杆菌，挑取含ssDNA单克隆进行测序，共测序31个阳性克隆，经测序后获得 13个不同序列的适配子，即为与链霉素亲和性较高的ssDNA ;通过Mfold program软件分 析ssDNA二级结构，根据一级序列同源性及二级结构的相似性对所获适配子进行分类，见 表1。
[0044] 表1ssDNA随机区的一级序列
【主权项】
1. 一种特异识别链霉素的核酸适配子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (A) 将环氧基活化凝胶与链霉素偶联缓冲液按体积比为3:10混合，35-37°C孵育 15-18h，用PBS溶液洗涤，加入乙醇胺进行封闭，室温孵育1-2 h ;洗涤，抽滤干燥，得链霉 素-环氧基凝胶偶联复合物；所述链霉素偶联缓冲液为每毫升含20 mg链霉素的0. lmol/L 的 Na2CO3-NaHCO3缓冲液； (B) 将所述链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入层析柱内，洗脱，得阳极柱；同时将没 有偶联链霉素的环氧基活化凝胶洗涤，装入层析柱内，得阴极柱； (C) 构建ssDNA随机文库，设计80 b