一种特异识别链霉素的核酸适配子及其在链霉素检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术检测领域，具体地说是一种特异识别链霉素的核酸适配子及 其应用。
【背景技术】
[0002] 链霉素（streptomycin)是一种广谱氨基糖苷类抗生素，可抑制革兰氏阴性杆菌和 部分革兰氏阳性杆菌的，广泛应用于医药、农业及畜牧业中。但是，在实际使用中，由于使用 不合理或非法使用，导致其在肉类、肝脏、肾脏、牛奶和蜂蜜等动物源性食品中的大量残留， 严重地危害了人类健康，可使人产生一系列过敏反应和肾毒性、耳毒性等病症，甚至会导致 失聪。因此，FDA、欧盟和我国等许多国家和地区均对链霉素的最大残留限量做了严格的规 定，可见，检测链霉素在食品中是否残留以及残留量多少具有重要的意义。
[0003] 目前，链霉素残留的检测方法主要有以下三种：1、液相色谱-质谱联用检测法，该 方法将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定 性分析，是一种灵敏可靠的检测链霉素残留的方法，其在牛奶中的检测线可低至10yg/ kg，准确性和精确度都相对较高；但是，由于链霉素没有紫外吸收，采用色谱检测时需要进 行柱后衍生或荧光标记，进样前需对样品进行前处理，操作复杂，而且所用设备昂贵，操作 技术性强，费事费力；2、免疫检测法，如CN103645322A公开了一种检测链霉素的化学发光 试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有包 被抗原；所述试剂包括：链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系 列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；酶标板选择乳白色不透明聚苯 乙烯96孔化学发光酶标板，酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗 原；该方法操作简单，其特异和灵敏度也较高，但是，该方法存在筛选小分子链霉素抗体过 程较为繁琐，不同批次性能不同，消耗时间，费用相对较高；3、微生物检测法，该方法费用较 低，但其灵敏度和特异性较差，耗费时间较长，所以实际应用相对较少。可见，当前这些检测 小分子链霉素的方法并不十分完善，所以建立一种新的快速、精确、灵敏、经济的检测链霉 素残留的方法是行业内积极探索的课题。
[0004] 适配子是利用指数富集配体系统进化（SELEX)技术从核酸文库中筛选获得的与靶 物质发生特异性结合的寡核苷酸序列，它可特异性识别并结合蛋白、小分子、离子、细胞等 靶物质。由于链霉素等小分子抗体制备较为困难，所以适配子作为检测小分子物质的分析 工具，将具有广阔的应用前景。在实践应用中，适配子在诸多方面均优于抗体，如化学稳定 性好、易于合成，不易变性、较低的免疫原性等；另外，适配子在基因治疗，抗传染及癌症治 疗中的安全性也得到了证实。到目前为止，人们已筛选了许多小分子物质的特异性适配子， 并以适配子为基础开发了一系列小分子物质的检测系统。但是，到目前为止，在国内外的研 宄中还没有发现关于特异性识别链霉素的适配子以及利用适配子对链霉素进行快速、准确 定性及定量检测的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种特异性识别链霉素的核酸适配子，并将其应用于定 性或定量检测链霉素中，以解决现有链霉素检测过程繁琐，检测精准性较差的问题。
[0006] 本发明的目的之二是提供一种定性及定量检测链霉素的方法，以解决现有技术检 测链霉素存在要么检测工序繁琐、费时费力、成本较高，要么精确度和灵敏性相对较差的问 题。
[0007] 本发明是这样实现的：一种特异识别链霉素的核酸适配子，所述适配子的核苷酸 序列为：CCCGITTAAAGTAGITGAGAGTAITCCGITTCTTTGTGTC(见SEQIDN0 : 1)。
[0008] 所述核苷酸适配子加上固定序列后其核苷酸序列为： 5 '-ACCGACCGTGCTGGACTCTGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3'，划线部分即为固定序列。其二级结构特征如图1所示。
[0009] 本发明不局限于SEQIDN0 : 1所示的序列，将所述核酸适配子进行修饰或改造 得到的核酸适配子衍生物也属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明所述核酸适配子衍生物可为如下任意一种：删除或增加部分核苷酸，得到 与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物；进行核苷酸取代或部分修饰，得到与所述 核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物；以此核酸适配子为骨架进行改造，得到与所述核 酸适配子具有相同功能的核酸衍生物；将所述核酸适配子改为肽核酸，得到与所述核酸适 配子具有相同功能的核酸衍生物；将所述核酸适配子进行标记荧光类物质、酶类物质或其 它标记物质，得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物。
[0011] 本研宄以链霉素为靶物质，利用SELEX技术筛选获得了特异性识别链霉素的核酸 适配子，并测定了其核苷酸序列；该核酸适配子通过荧光法鉴定得知，其对链霉素具有很 高的亲和力和高度的特异性，这为进一步开发利用适配子检测链霉素奠定了基础。本发明 提供的核酸适配子与蛋白类的抗体相比具有分子量较小，可以化学合成，成本较低，稳定性 好，且易于保存；可直接体外合成，便于标记且可以在不同部位进行选择性的标记；将其用 于检测链霉素方法灵活，易于优化；实际应用中，可以以该苷酸适配子为基础，来设计开发 多种链霉素实验室检测方法，可在食品、卫生及进出口检测等领域得到广泛应用。
[0012] 本发明所述的核酸适配子结合胶体金比色法用于定性或/和定量检测食品中链 霉素的应用。
[0013] 一种定性检测链霉素的方法，包括以下步骤： (a) 将质量比浓度为0. 01%的HAuC14溶液加热煮沸，边搅拌边加入质量比浓度为1%的 柠檬酸钠，溶液变色后，煮沸并持续l〇_15min，冷却至室温，得胶体金； (b) 以45-60ML的胶体金中加入100nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将 两者混合，室温孵育1-2h，制得了适配子标记的胶体金；其中所述特异识别链霉素的核酸 适配子的核苷酸序列如SEQIDN0 : 1所示； (c) 在适配子标记的胶体金中加入待测样品，若溶液颜色为酒红色，则待测样品中链 霉素浓度小于200nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为紫色，则待测样品中链霉素的浓度为 200~800nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为蓝色，则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L〇
[0014] 一种定量检测链霉素的方法，包括以下步骤： (A) 将质量比浓度为0. 01%的HAuC14溶液加热煮沸，边搅拌边加入质量比浓度为1%的 柠檬酸钠，溶液变色后，煮沸并持续l〇_15min，冷却至室温，得胶体金； (B) 以45-60ML的胶体金中加入100nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将 两者混合，室温孵育1-2h，制得了适配子标记的胶体金；其中所述特异识别链霉素的核酸 适配子的核苷酸序列如SEQIDN0 : 1所示； (C) 在步骤（B)制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25nmol/L、50nmol/L、 100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、800nmol/L、1600nmol/L的链霉素，室温孵育 1h， 加入50yL浓度为200mmol/L的NaCl，在波长为A520和A620分别测定其吸光值，以链霉 素的浓度为横坐标，以同一浓度链霉素所述测得的A620和A520的比值为纵坐标，作链霉素 浓度与A620/520比值的曲线图，拟合其标准曲线；测定样品时，将待测样品加入到适配子 标记的胶体金中，测定其在波长为A520和A620的吸光值，求A620/520比值，将其带入标准 曲线中得到所对应的链霉素含量值，即为待测样品中所含链霉素的含量。
[0015] 本发明以将上述筛选的高特异性和高亲和性的与链霉素相结合的核酸适配子与 胶体金比色法相结合，建立了基于寡核苷酸适配子的链霉素新型检测方法，可简单、快速、 准确、经济、特异地对链霉素进行定量或定性检测，为开发新型链霉素分析方法或检测工具 奠定良好基础，同时也为其他小分子物质的检测提供思路，可以在食品、卫生及进出口检测 等领域得到广泛应用。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明核酸适配子的二级结构特征图。
[0017] 图2环氧基活化凝胶与链霉素-环氧基凝胶偶联复合物的红外图谱。其中图中a 为链霉素-环氧基凝胶偶联复合物，b为环氧基活化凝胶。
[0018] 图3氨基磁珠与链霉亲和素磁珠的红外图谱。其中图中a为氨基磁珠，b为链霉 亲和素磁珠。
[0019] 图4每轮筛选PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[0020] 图5每轮筛选PCR产物的荧光值。
[0021] 图6为荧光标记法测定的适配子亲和力结果图。
[0022] 图7为本发明实施例1中适配子A17、A25以及A15的二级结构特征图。
[0023] 图8为不同浓度的链霉素与适配子标记胶体金聚沉状态图。
[0024] 图9为不同浓度的链霉素加入标记适配子的胶体金的光谱图。
[0025] 图10为A62Q/A52Q比值与链霉素浓度关系曲线图。
[0026] 图11为A62Q/A52Q比值与链霉素浓度的标准曲线图。
[0027] 图12为链霉素及对比例的定性检测图。
【具体实施方式】
[0028] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均 可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0029] 实施例1特异识别链霉素的核酸适配子的获得 (1)环氧基凝胶与链霉素的偶联：取3ml环氧基活化凝胶用双蒸水洗五次，然后抽 滤干燥；将干燥后的环氧基活化凝胶中加入到10ml含20mg/ml链霉素的0.lmol/L的 Na2C03-NaHC03偶联缓冲液（pH值为10. 5)中，37°C孵育16h;反应结束后，将孵育产物用 0?lmol/L的PBS溶液冲洗三次，再加入1mol/L的乙醇胺进行封闭，室温孵育1h;封闭后 的凝胶偶合物依次用5倍的去离子水、0? 1mol/L含0? 5mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液 (pH值为4.0)、去离子水、0.1mol/L含0.5mol/LNaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液（pH值为 8. 0)和去离子水充分洗涤，抽滤干燥，去除了未反应的配基，得链霉素-环氧基凝胶偶联复 合物；将链霉素-环氧基凝胶偶联复合物重悬于4°C的质量比浓度为20%的乙醇溶液中备 用；将所得的链霉素-环氧基凝胶偶联复合物与环氧基活化凝胶进行红外检测，验证其偶 联结果，结果见图2所示。环氧基开环形成C-0键和C-N键，从图2中可以看出链霉素-环 氧基凝胶偶联复合物在1180cnT1处有一特征峰，环氧基活化凝胶在此处无特征峰，而此峰 就是由C-N伸缩震动产生的，这说明链霉素已通过化学反应固定在环氧基凝胶上。
[0030] (2 )阳极柱和阴极柱的制备： 阳极柱的制备：将3mL链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入亲和层析柱空柱中，用1mol/LNaCl溶液分5洗进行洗脱，每次10mL，洗脱总体积50mL(每次洗脱必须保证凝胶 浸于液体中)再用去离子水洗10个柱体积，得阳极柱，最后保存于10mL质量百分比为20% 的乙醇溶液中； 阴极柱的制备：将3mL未与链霉