沉默人的RAN基因的siRNA、重组载体及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物制药技术领域，具体涉及沉默人的RAN基因的 siRNA、重组载体及用途。
【背景技术】
[0002] RNAi是一种转录后基因沉默机制，它通过双链RNA(dsRNA)弓丨起序列同源的mRNA 降解，来降低目标基因的表达，这个现象在进化过程中保守而且广泛。目前RNAi技术已经 进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，为分析基因功能和 信号传导通路以及基因治疗提供了一种新的研究手段，于2006年获得诺贝尔奖。RNAi具 有以下特征优势：1.作用的特异性，只对与其同源的mRNA产生抑制作用，碱基错配会大大 降低抑制效率；2.RNAi具有高度有效性，相对少量的siRNA就可以几乎完全抑制靶基因的 表达。在活体细胞中输送"小干扰RNA(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为"短发夹" 克隆入质粒载体。当送入细胞体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个双链RNA(shRNA)， 并被RNAi通道处理，之后结合到RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex, RISC)，这种复合物能够结合并切割与siRNA序列匹配的mRNA，导致mRNA无法翻译成相应 蛋白质，最终沉默细胞中相应蛋白的表达。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间为茎环 (loop)序列，反向重复序列与茎环序列形成一发夹结构。
[0003]RAN是Ras家族一员，作为G蛋白家族的一类，具有GTP酶水解功能，在细胞内行 使"分子开关"的作用，其参与细胞周期的核质运输、细胞分裂前期的纺锤体组装和细胞分 裂末期的核膜重建等过程。
[0004] 对RAN蛋白功能及RAN结合蛋白的进一步研究将更深入了解细胞运输、细胞周期 及分裂等重要生命活动。
【发明内容】
[0005] 针对基因研究的需要，本发明的一个目的是提供一种沉默人的RAN基因的siRNA。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述沉默人的RAN基因的siRNA的用途。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体。
[0008] 本发明的第四个目的是提供上述沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体的用途。
[0009] 为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：沉默人的RAN基因的SiRNA，具有如 SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2、SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4 或SEQIDN0. 5 的任一序列。
[0010] 本发明提供的沉默人的RAN基因的SiRNA的重组载体，含有所述的沉默人的RAN 基因的siRNA。
[0011]进一步，采用两步法构建所述重组载体，具体方法是：第一步，体外化学合成RAN 基因的siRNA表达模板单链，在退火缓冲液中退火形成双链DNA;第二步，将双链DNA克隆 入表达载体，从而构建成重组载体。
[0012] 进一步，所述表达载体为siRNA真核表达载体Psilencer2. 1-U6、pGCsi_U6/Neo/ GFP、pGenesil_l. 1 等，或慢病毒载体pGC-LV。
[0013] 本发明所提供的能有效沉默人的RAN基因表达的siRNA及含有该siRNA的重组载 体，为人的RAN基因功能的研究提供有效技术工具。
【附图说明】
[0014] 图1表示RAN基因mRNA水平的表达情况，其中纵坐标表示RAN基因mRNA水平的 相对表达量，横坐标7702-NC表示对照组(其中的肝细胞HL-7702转染了含随机对照序列的 重组质粒LV-NC-RNAi)，7702-RNA/n(n:1、2、3、4、5)表示实验组(其中的肝细胞转染了重组 质粒LV-RAN-RNAi/n(n:l、2、3、4、5))。
【具体实施方式】
[0015] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0016] 优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实 验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或 按照制造厂商所建议的条件。
[0017] 实施例1
[0018] 本实施例用于说明本发明提供的沉默人的RAN基因的siRNA的构建方法。
[0019] 根据Genbank中报道的RAN基因的核苷酸序列，参考siRNA设计原则设计出5条 抑制RAN基因表达的siRNA靶点序列，分别为SEQIDN0 :1-5,同时设计随机对照序列SEQ IDN0. 6,如下所示：
[0020] SEQIDNO. 1 ：TAAGTCGTGCTCATACTGT；
[0021] SEQIDNO. 2 ：GTCATTTGACTGGTGAATT；
[0022]SEQIDNO. 3 ：GTTCAAACTTGTATTGGTT；
[0023]SEQIDNO. 4 ：CCCTAACTTGGAATTTGTT；
[0024]SEQIDNO. 5 ：GGATATTAAGGACAGGAAA；
[0025]SEQIDNO. 6 ：TTCTCCGAACGTGTCACGT〇
[0026] 经Blast基因同源性分析，序列SEQIDNO. 1-5不与任何人类非RAN基因序列同 源，以确保基因抑制的特异性。
[0027] 针对上述祀点序列，参考siRNA的设计策略，分别设计5对shRNA(shorthairpin RNA，shRNA)序列表达框架DNA(SEQIDNO.1'-5，）和一对随机对照序列（SEQIDNO.6'）， 如下所示：
[0028]SEQIDNO.1，：
[0029]正义链（RNAi-lF):
[0030] 5'-ccggGCACAGTATGAGCACGACTTACTCGAGTAAGTCGTGCTCATACTGTGCTTTTTg-3'
[0031]反义链（RNAi-lR):
[0032] 5,-aattcaaaaaGCACAGTATGAGCACGACTTACTCGAGTAAGTCGTGCTCATACTGTGC-3，
[0033]SEQIDNO. 2，：
[0034]正义链（RNAi_2F):
[0035] 5,-ccggACGTCATTTGACTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCAGTCAAATGACGTTTTTTg-3，
[0036]反义链（RNAi_2R):
[0037] 5,-aattcaaaaaACGTCATTTGACTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCAGTCAAATGACGT-3，
[0038]SEQIDN0.3，：
[0039]正义链（RNAi_3F):
[0040] 5'-ccggCAGTTCAAACTTGTATTGGTTCTCGAGAACCAATACAAGTTTGAACTGTTTTTg-3'
[0041]反义链（RNAi-3R):
[0042] 5'-aattcaaaaaCAGTTCAAACTTGTATTGGTTCTCGAGAACCAATACAAGTTTGAACTG-3'
[0043]SEQ ID NO.4'：
[0044]正义链（RANRNAi_4F):
[0045] 5'-ccggGACCCTAACTTGGAATTTGTTCTCGAGAACAAATTCCAAGTTAGGGTCTTTTTg-3'
[0046]反义链（RNAi_4R):
[0047] 5'-aattcaaaaaGACCCTAACTTGGAATTTGTTCTCGAGAACAAATTCCAAGTTAGGGTC-3'
[0048]SEQIDNO. 5，：
[0049]正义链（RNAi_5F):
[0050] 5,-ccggGTGGATATTAAGGACAGGAAACTCGAGTTTCCTGTCCTTAATATCCACTTTTTg-3，
[0051]反义链（RNAi-5R):
[0052] 5 ' -aattcaaaaaGTGGATATTAAGGACAGGAAACTCGAGTTTCCTGTCCTTAATATCCAC-3 '
[0053] SEQ ID NO. 6'：
[0054]正义链（control-F) :5,-ccggCATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGA GAATGTTTTTg-3'
[0055]反义链（control-R) :5,-aattcaaaaaCAITCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACG TTCGGAGAATG-3，
[0056] 采用化学方法合成siRNA序列表达框SEQIDNO. 1' -6'的正义链及反义链，其序 列中CTCGAG为loop环序列，TTTTT为转录终止子。
[0057]SEQIDN0. 1'-6'在体内转录后形成以CTCGAG为loop茎环的包含SEQIDN0. 1-6 的siRNA发夹结构，在体内切割分别产生序列为SEQIDNO. 1-5的RAN的siR