调节植物中ω酰胺酶表达以增加植物生长的制作方法
【专利说明】调节植物中《酰胺酶表达以增加植物生长
[0001] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2011/026552,国际申请日为2011年2月 28日，进入中国国家阶段的申请号为"201180021352.X"，发明名称为"调节植物中《酰胺 酶表达以增加植物生长"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2010年2月28日提交的美国临时专利申请第61/308, 971号的权益， 其公开通过引用全文纳入本文。
[0004] 联邦资助的研宄或开发下完成发明的权利声明
[0005] 本发明是在美国能源部授予洛斯阿拉莫斯国家安全有限公司（LosAlamos NationalSecurity,LLC)的第DE-AC52-06NA25396合同号的政府资助下进行的。政府享有 本发明的某些权利。
[0006] 以ASCII文本文件提交序列表
[0007] 下面以ASCII文本文件提交的内容通过引入全文纳入本文：序列表的计算机可读 形式（CRF)(文件名：686522000440SEQLISTING.txt，记录日期：2011 年 2 月 28 日，大小： 158KB)〇 技术背景
[0008]因为世界范围内人口增加并且可用耕地持续被毁坏或者被损坏，对更有效和可持 续农业系统的需求是人类的重要利益。提高农作物产量，蛋白含量和植物生长速率代表了 能应对现有挑战的更有效农业系统发展的主要目标。
[0009] 近些年，由于很多发展良好的农作物的产量已经达到平台期，仅增加了改善作物 生产技术的重要性。很多农业活动对时间敏感，成本和利润依赖于农作物的快速周转或上 市时间。因此，快速农作物生长对很多涉及高价值作物（例如谷物、植物、衆果和其他水果） 的农业企业是经济上重要的目标。
[0010] 遗传工程改造在发展可持续农业技术上已经并且继续发挥越来越重要但是有 争议的作用。近年来已经开发出很多遗传改良植物和相关技术，其中很多目前已广泛使 用，（Factsheet:GeneticallyModifiedCropsintheUnitedStates(情况说明书：美 国的遗传改良农作物），皮氏食品与生物科技资讯基金会（PewInitiativeonFoodand Biotechnology)，2004 年 8 月，http://pewagbiotech.org/resources/factsheets)〇米用 转基因植物变种目前非常重要并且呈上升趋势，2006年约2. 5亿英亩种植转基因植物。
[0011] 尽管接受转基因植物技术特别在美国、加拿大和澳大利亚逐渐增加，世界上很多 地区特别是欧洲在接受农业遗传改良植物上仍然缓慢。因此，与遵循负责的和可持续农业 的目标一致，对发展不向植物和/或环境引入毒素或其他潜在问题物质的遗传工程改造植 物有强烈兴趣。对实现如提高除草剂耐受性、虫害和疾病抗性和整体农作物产量等目标的 成本最小化也有强烈兴趣。因此，仍需要能符合这些目标的转基因植物。
[0012]通过对多个植物调节系统的很多研宄寻求快速植物生长的目标，其中很多调节系 统尚未完全理解。特别地，没有完全阐明协调碳和氮代谢的植物调节机制。假定这些调节 机制对植物生长和发育有根本性影响。
[0013] 光合生物中碳和氮的代谢必须以协调的方式调节以确保有效利用植物资源和能 量。目前对碳和氮代谢的理解包含作为更大系统的子系统的一些步骤和代谢通路的细节。 在光合生物中，碳代谢开始于C02固定，其通过两个主要过程完成，名为C-3和C-4代谢。 C-3代谢的植物中，酶核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCo)催化C02和核酮糖二磷酸的组合以生 成3-磷酸甘油酸，其是植物用于合成含碳化合物的三碳化合物（C-3)。C-4代谢的植物中， 〇)2和磷酸烯醇丙酮酸结合，在由酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反应中形成含4碳的酸 (C-4)。所述酸转移到维管束鞘细胞，脱羧释放C02，然后在与C-3植物使用的相同反应中结 合核酮糖二磷酸。
[0014] 许多研宄发现多个代谢物在植物调节氮代谢中重要。这些化合物包含有机酸苹果 酸和氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺。通过光合生物经酶谷氨酰胺合成酶（GS)作用来进行氮同 化，所述谷氨酰胺合成酶催化氨和谷氨酸结合形成谷氨酰胺。
[0015] 通过催化添加氨到谷氨酸以在ATP依赖性反应中形成谷氨酰胺，GS对植物中氮同 化起重要作用（Miflin和Habash，2002,JournalofExperimentalBotany，第 53 卷第 370 期，第979-987页）。GS也再同化作为光呼吸和蛋白及氮运转化合物降解的结果而释放出 的氨。GS酶可以分成两大类，一个代表胞质形式（GS1)而另一个代表质体（即叶绿体）形 式（GS2)。
[0016] 尽管报道不一致，前面的工作已经显示GS1表达水平增加造成GS活性和植物生长 的水平增加。例如，Fuentes等报道CaMVS35启动子驱动的烟草中苜蓿（Alfalfa)GSl过 表达（胞质形式）造成叶组织中GS表达和GS活性水平的增加，氮饥饿下的生长增加，但 是对最优氮施肥条件下的生长没有影响（Fuentes等，2001，J.Exp.Botany52:1071-81)。 Temple等报道过量表达全长苜蓿GS1编码序列的转基因烟草植物包含水平大幅提高 的GS转录物，和组装成活性酶的GS多肽，但是没有报道生长的表型效果（Temple等， 1993，MolecularandGeneralGenetics236:315-325)。Corruzi等已经报道在CaMVS35 启动子控制下过量表达豌豆胞质GS1转基因的转基因烟草显示GS活性增加，胞质GS蛋白 增加和生长特性提高（美国专利号6, 107, 547)。Unkefer等更近期报道叶部组织中过量表 达苜蓿GS1的转基因烟草植物按照通过自花授精实现GS1转基因拷贝数目增加的遗传分离 就叶-根（leaf-t〇-r〇〇t)GS活性增加进行筛选，发现所述转基因烟草植物在其叶部生成 2-羟基-5-氧脯氨酸水平增加，发现引起生长率显著高于野生型烟草植物（见美国专利号 6, 555, 500 ;6, 593, 275 和 6, 831，040)。
[0017]Unkefer等进一步描述了使用2-羟基-5-氧脯氨酸（也称为2-氧代缩环戊酸单酰 胺（2-oxoglutaramate))提高植物生长（美国专利号 6, 555, 500 ;6, 593, 275 ;6, 831，040)。
[0018] 特别地，Unkefer等公开了叶部组织中2-羟基-5-氧脯氨酸浓度的增加（相对于 根组织）产生造成植物生长特性增加的级联事件。Unkefer等描述某些方法，所述方法可以 增加2-羟基-5-氧脯氨酸的叶部浓度以引起植物生长特性的增加，特定通过向植物的叶部 直接应用2-羟基-5-氧脯氨酸和优先在叶组织中过量表达谷氨酰胺合成酶。
【发明内容】
[0019] 本发明是基于增加植物根组织中《酰胺酶（Q酰胺酶）表达造成植物的信号代 谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺和相关脯氨酸分子的叶-根比率增加的惊人发现。另外，植物 根组织中《酰胺酶表达的增加造成叶组织中《酰胺酶表达的下降。有利地，调节植物中 ?酰胺酶的表达产生氮利用效率提高的植物，进而造成生长和其他农艺学特性的提高，包 含更快的生长速率，更多的种子和果实/荚产量，更早和更多产的开花，对高盐条件的耐受 性增加和提高的生物量产量。
[0020] 因此，本发明一方面涉及包含《酰胺酶转基因的转基因植物，其中所述《酰胺酶 转基因与根优先性启动子操作性连接。
[0021] 本发明的另一方面提供叶组织中内源性W酰胺酶表达被抑制的转基因植物。
[0022] 本发明的另一方面涉及使某一植物相对于相同种的野生型或未转化植物的氮利 用效率提高的方法，通过：(a)向植物中引入《酰胺酶，其中所述《酰胺酶转基因与根优 先性启动子操作性连接；(b)在所述植物根组织或所述植物后代中表达《酰胺酶转基因； 和（c)选择相对于不含《酰胺酶转基因的相同种植物中2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根 比率增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提 尚。
[0023] 本发明的另一方面涉及使某一植物相对于相同种的野生型或未转化植物的氮利 用效率提高的方法，通过：(a)抑制植物的叶组织中内源性《酰胺酶的表达；和（b)选择 相对于不抑制叶组织中内源性《酰胺酶表达的相同种植物内2-氧代缩环戊酸单酰胺的 叶-根比率增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效 率提尚。
[0024] 附图简要说明
[0025] 图1显示氮同化和2-氧代缩环戊酸单酰胺生物合成的代谢通路的示意图。
[0026] 图2显示拟南芥（Arabidopsisthaliana) ?酰胺酶与其他推定的植物《酰胺酶 的氨基酸序列比对。
[0027] 图3显示拟南芥（Arabidopsisthaliana) ?酰胺酶与其他推定的动物《酰胺酶 的氨基酸序列比对。
[0028] 图4图示植物鲜重值对2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度的作图。
[0029] 图5显示比较《酰胺酶转基因和对照苜蓿植物的照片。
[0030] 发明详述
[0031] 定义
[0032] 除非另外定义，本文使用的所有术语、符号和其它科学术语旨在具有与本发明所 属领域的技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引 用对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域 常规理解的显著差异。本文所述或所引用的技术和过程通常已充分了解并常采用本领 域技术人员的常规方法，例如，广泛应用的分子克隆方法描述在Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册）第三版（2001)纽约冷泉港的冷 泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress);CurrentProtocolsin MolecularBiology(新编分子生物学实验指南）（Ausbel等编，约翰韦利森公司（John Wiley&Sons，Inc)2001;TransgenicPlants