NAs和NO. 6 的对照siRNA。
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例用于说明本发明提供的沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体的构建方 法。
[0060] 载体采用慢病毒载体PGC-LV(购自上海吉凯基因化学技术有限公司）。其框架结 构为：
[0061]hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin〇
[0062] 重组载体的构建方法如下：
[0063] 分别将实施例1中siRNA的5对shRNA表达框架DNA序列SEQIDNO. 1'-5'的正 义链及反义链在退火缓冲液（10mMTris-HCl，lmMEDTA，0.lmMNaCl)90°C水浴15min，然后 自然冷却至室温，反应合成双链DNA(dsDNA)序列，将双链DNA序列用EcoRI和AgeI酶 切，同时利用EcoRI和AgeI酶切慢病毒载体pGC-LV，使其产生与双链DNA序列相同的粘 性末端，利用T4DNA连接酶将双酶切线性化的慢病毒载体和DNA片段于16°C连接过夜。连 接产物转化感受态细胞DH5a，挑取转化子重悬于LB培养基中，取1iiL作为模板，通过PCR鉴定阳性克隆。将PCR筛选鉴定的阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴 定，测序结果进一步筛选重组载体。构建的重组载体可直接转染真核细胞，也可以用于慢病 毒的包装。构建获得的重组载体表述为LV-RAN-RNAi/n(n:l、2、3、4、5)。
[0064] 按同样方法得到含有随机对照序列的慢病毒LV-NC-RNAi，作为对照。
[0065] 实施例3
[0066] 本实施例用于说明本发明提供的沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体对人的肝 细胞HL-7702的RAN基因表达的抑制作用。
[0067] 1、细胞培养
[0068] 将状态良好的人正常肝细胞HL-7702接种于6孔细胞培养板中，在含20%(v/v) 小牛血清、l〇〇U/ml青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养基中（美国，Invitrogen公 司），于37°C、5%(v/v)C02条件下培养，待细胞融合度达到约80%。同时，将所培养的细胞分 成6组，分别为5组实验组和1组对照组。
[0069] 2、基因转染
[0070] 根据InvitrogenLipofectamine2000转染试剂说明书进行转染操作：将培养 液更换成2ml不含血清的1640培养基，取4. 0ug质粒和10ulLipofectamine2000分 别溶解于250ill无血清的1640培养基中，混匀，室温静置5min，然后将质粒-培养基、 Lipofectamine2000-培养基混合液混合均匀，室温放置20min，然后将混合液加入HL-7702 细胞中，37°C、5%(v/v)C02条件下培养12h后，换成含有新鲜20%(v/v)血清的完全培养基， 转染24h后观察荧光标记基因的表达情况来判断转染效率，转染48h后收集细胞进行荧光 定量PCR检测。
[0071] 3、总RAN提取
[0072] 对应实验组和对照组的肝细胞，胰酶消化后，lOOOrpm离心5min，去上清，细胞 沉淀中加入lmlTriol(Invitrogen公司），迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的 1. 5mleppendorf管中，每管加入200y1氯仿，用手上下颠倒15sec，室温静置10min，4°C, 12000rpm,离心15min,吸取上清至新的eppendorf管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后 4°C沉淀10min，然后4°C，12000rpm离心10min后，去上清，加入至少lml75%(v/v)乙醇，洗 漆沉淀，4°C，lOOOOrpm离心10min，弃去上清，室温干燥，然后加入20y1RNase-free水溶 解。
[0073] 4、反转录和PCR
[0074] 反转录获得cDNA的方法：利用TaKaRa公司PrimeScriptRTMasterMix试剂盒 进行cDNA的制备，反应体系为 10ii1 :5XPrimeScriptRTMasterMix2ii1，RNA500ng，用 RNaseFree水补足体系。反应条件为：37°C15min(反转录反应)，85°C15sec((反转录酶 的失活反应)，4°C保存。
[0075]突光定量PCR:利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqIIreal-time试齐 盒，实时荧光定量PCR检测RAN基因mRNA水平的表达。RAN基因PCR引物为：Forward Primer(5,-GAAAGTGAAGGCGAAATCCAT-3'），ReversePrimer(5,-AAGTCGTGCTCATACTGTGC TG-3'），所选内参基因为人beta-actin基因，beta-actin基因引物为：ForwardPrimer (5,-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3, ），ReversePrimer(5,-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3' )。反应体系为25ul:SYBRPremixExTaqII(2X)12.5iil，ForwardPrimer(lOuM) 1111，1^￥6186?1'；[11161'(1011]\〇1111，。0嫩模板2111，无菌水8.5111。反应条件：95°〇3〇860 (1 个循环）；95°C5sec，60°C30sec(40 个循环）
[0076] 5、结果：
[0077]实时突光定量PCR米用ComparativeDelta-deltaCt法，以看家基因beta-actin 为内参，相对定量RAN基因的表达水平。计算方法为： |-QQ78] p=2_[(待检样品目的基因平均Ct值-待检样品看家基因平均Ct值）-(对照样品目的基因平均Ct值-对照样品看家基因平均Ct值）]
[0079] 将测得的实验组和对照组的肝细胞的RAN基因mRNA水平相对表达量汇总到图1 上。
[0080] 从图1上可以看出，经转染质粒LV-RAN-RNAi/n(n:1、2、3、4、5)的肝细胞中，RAN 基因的mRNA表达水平与对照肝细胞相比显著下降，说明本发明的RAN的siRNA能够高效特 异性地抑制肝细胞RAN基因的表达。
[0081] 从图1上还可以看出，转染重组质粒LV-RAN-RNAi/1的实验组的RAN基因的沉默 效果最好，因此在制备沉默人的RAN基因的细胞模型时，可选择SEQIDNO. 1为最有效的人 RAN基因siRNA序列。
[0082] 上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的 特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看 均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求 的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
【主权项】
1. 沉默人的RAN基因的siRNA，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 的任一序列。
2. 权利要求1所述的沉默人的RAN基因的siRNA在制备RAN基因沉默细胞模型中的用 途。
3. 沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1 所述的沉默人的RAN基因的siRNA。
4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，采用两步法构建所述重组载体，具体 方法是：第一步，体外化学合成RAN基因的siRNA表达模板单链，在退火缓冲液中退火形成 双链DNA ;第二步，将双链DNA克隆入表达载体，从而构建成重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为siRNA真核表达载体 Psilencer2. l-U6、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGenesil-l. 1 或慢病毒载体 pGC-LV。
6. 权利要求3-5任一所述的沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体在制备RAN基因沉 默细胞模型中的用途。
7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于，沉默人的RAN基因的siRNA的重组载体在 制备沉默人的肝细胞RAN基因细胞模型中的用途。
【专利摘要】本发明涉及沉默人的RAN基因的siRNA，其具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的任一序列。本发明还提供了含上述沉默人的RAN基因的siRNA重组载体以及含上述沉默人的RAN基因的siRNA、重组载体的用途。本发明提供的沉默人的RAN基因的siRNA、重组载体可为人的RAN基因功能的研究提供有效技术工具。
【IPC分类】C12N15-867, C12N15-113, C12N5-10, C12N15-63
【公开号】CN104745579
【申请号】CN201310749458
【发明人】党旭红, 左雅慧, 刘建功, 张慧芳, 刘占旗, 段志凯, 刘红艳, 杨彪, 王超
【申请人】中国辐射防护研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日