一种硫酸链霉素的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全分析技术领域，涉及一种硫酸链霉素的检测方法，尤其涉及一种基于有机小分子焚光探针的硫酸链霉素的检测方法。
【背景技术】
[0002]硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)是常用的氨基糖苷类广谱抗生素，但其具有一定的毒副作用，主要表现为对脑神经、听觉及肾脏的损害。因此，许多国家和机构都明确规定了该类药物在食品中的最大残留限量(MRLs)。
[0003]目前，硫酸链霉素常用检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)、色谱-质谱串联(LC-MS)和酶联免疫吸附分析法。硫酸链霉素仪器分析法准确度高，但其操作繁琐，而且需进行衍生化，费用高，耗时耗力，不适于大量样品的快速分析。硫酸链霉素的高灵敏度快速检测多基于竞争性免疫检测技术如酶联免疫分析法。例如专利CN 103645322 A，其涉及一种硫酸链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其包含抗原、硫酸链霉素单克隆抗体、和化学发光物质，该试剂盒能实现硫酸链霉素的检测，但此种检测方法的核心材料抗体通常制备周期长，难以获得，且对温度、湿度、溶剂性质等环境条件要求苛刻。
[0004]荧光探针与待测目标物能够发生高特异性的化学反应，并产生高灵敏度的荧光信号，可用于定性定量检测微量或痕量待侧目标物。基于荧光探针的硫酸链霉素快速检测具有快速、灵敏高效、高效便捷、成本低等特点，适用于食品中硫酸链霉素的快速筛查。由此可见，开发一种基于探针荧光的硫酸链霉素的检测方法，是食品安全分析技术领域的发展方向，同时可大幅度提高分析效率。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提出一种硫酸链霉素的检测方法，其具有快速便捷、灵敏高效、成本低等特点，适用于食品中硫酸链霉素的快速筛查。
[0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种硫酸链霉素的检测方法，所述方法通过使用化学荧光探针与硫酸链霉素发生特异性反应来进行。
[0008]具体地，所述的硫酸链霉素的检测方法包括以下步骤:
[0009]I)将化学荧光探针溶于有机溶剂制得溶液A，碱溶于水制得溶液B ;
[0010]2)将硫酸链霉素溶于水配置一系列不同浓度的硫酸链霉素水溶液，制得标准溶液；
[0011]3)将溶液A和溶液B分别与不同浓度的标准溶液混合、振荡，静置分层后移取水层，测量荧光强度，建立荧光强度与标准溶液浓度间的相关曲线；
[0012]4)将溶液A和溶液B与待测样品溶液混合、振荡，静置分层后移取水层，测量荧光强度，与步骤3)所建立的曲线进行比对，计算样品的硫酸链霉素含量。
[0013]不同于常规的化学发光酶联免疫检测，本方法无须使用抗原和抗体等物质，所用的荧光探针为化学合成，简单易得，成本较低，对外界环境条件耐受程度高。优选地，所述化学荧光探针为9，10-菲醌。
[0014]应当理解的是，本发明所述的硫酸链霉素，包括硫酸链霉素的盐形式。
[0015]在步骤I)中，所述有机溶剂为与水不相溶、密度比水小，且可以溶解所述化学荧光探针如9，10-菲醌的有机溶剂，优选乙醚、乙酸乙醋、石油醚，特别优选乙醚；
[0016]优选地，所述溶液A为9，10-菲醌乙醚溶液，优选地，所述溶液A浓度为500ppm，尤其优选500ppm的9，10-菲醌乙醚溶液；
[0017]优选地，所述碱为无机碱，优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠，特别优选氢氧化钠；
[0018]优选地，所述溶液B为浓度IN的碱溶液，尤其优选IN氢氧化钠水溶液。加入溶液B的目的在于中和硫酸链霉素中的酸部分，使得链霉素游离出来参与接下来的反应。
[0019]在步骤2)中，所述标准溶液为8种不同浓度的硫酸链霉素水溶液；
[0020]优选地，所述标准溶液的浓度范围在Oppm-1OOppm之间，在一个实施方案中，所述标准溶液的浓度分别为 0ppm、0.01ppm、0.05ppm、0.2ppm、lppm、5ppm、25ppm、lOOppm。
[0021 ] 由于我国规定在动物源食品中链霉素最大残留限量为牛奶200ng/mL，鸡肉、肝脏600ng/mL，肾1000ng/mL。因此该标准溶液的范围可很好的覆盖食品中链霉素的含量值，同时选取的标准溶液浓度值的分布有利于绘制荧光强度与标准溶液浓度间的相关曲线。
[0022]在步骤I)和2)中，所述水为去离子水，由于后续步骤将移取水层样品进行荧光强度测定，所用的水不能对荧光强度产生影响。
[0023]在步骤3)和步骤4)中，三种溶液混合后，硫酸链霉素以游离链霉素的形式与溶液A中的化学荧光探针发生特异性反应，生产新的荧光产物，该产物易溶于水，进入水层，而未结合的游离化学荧光产物仍停留在有机相，不会对测量结果产生影响。产物的荧光信号的强度与硫酸链霉素浓度呈正相关，因此通过对标准溶液检测产物荧光信号的强度可以建立荧光强度与标准溶液浓度间的相关曲线，再对比待测样品的荧光强度，可计算样品中硫酸链霉素的含量。
[0024]所述溶液A、溶液B和标准溶液的体积比与所述溶液A、溶液B和待测样品溶液的体积比相同，平行操作，以免水和有机溶剂的量对各种化合物的浓度产生影响，从而影响荧光强度的测量，优选地，所述体积比为为5:1:4 ;
[0025]优选地，所述振荡的时间为30s，以使三种成分完全混匀并发生反应，静置直至水层和有机层完全清晰地分离，所需时间至少为Imin ;
[0026]优选地，所述移取水层使用移液管，所移取的水层不能含有有机层，否则随后测得的荧光强度将产生偏差；
[0027]优选地，所述测量荧光强度在278nm下用荧光分光光度计进行测量，该波长的光可激发产物释放出荧光信号，可观察到黄绿色的荧光。
[0028]作为一种可替代的实施方案，在使用荧光分光光度计测量待测样品的荧光强度之前，可先在360nm紫外灯下用肉眼观察步骤4)所移取的水溶液是否有黄绿色荧光，以初步判断待测样品中是否含有硫酸链霉素。
[0029]在一个具体的实施方案中，所述硫酸链霉素的检测方法包括以下步骤:
[0030]I)将9，10-菲醌溶于乙醚制得浓度为500ppm的溶液A，将氢氧化钠溶于去离子水制得浓度为IN的溶液B ；
[0031]2)将硫酸链霉素溶于去离子水配置浓度分别为0ppm、0.01ppm、0.05ppm、0.2ppm、lppm、5ppm、25ppm、10ppm的硫酸链霉素水溶液，制得标准溶液；
[0032]3)将溶液A和溶液B分别与不同浓度的标准溶液按体积比5:1:4混合、振荡30s，静置lmin，分层后移取水层，在360nm下用荧光分光光度计测量荧光强度，建立荧光强度与标准溶液浓度间的相关曲线；
[0033]4)将溶液A和溶液B与待测样品溶液按体积比5:1:4混合、振荡30s，静置lmin，分层后移取水层，在278nm下用荧光分光光度计测量荧光强度，与步骤3)所建立的曲线进行比对，计算样品的硫酸链霉素含量。
[0034]需特别指出的是，本发明所述的硫酸链霉素检测方法用于食品安全分析领域，在使用本发明所述方法之前，须对待测的食品进行预处理，形成待测样品溶液。所述样品包括鸡肉、肝脏、牛奶、奶粉和蜂蜜等本领域常需进行硫酸链霉素检测的食品。优选地，在本发明中样品预处理的方法包括提取和净化:
[0035]I)提取:10g样品均质后与20mL 0.1 %磷酸溶液祸旋混合5min ；
[0036]2)净化:米用SCX固相萃取柱(500mg/3cc)和C18固相萃取柱(500mg/6cc)双柱净化。
[0037]在一个具体的实施方案中，所述双柱进化的操作步骤为:a)活化SCX固相萃取柱:将5mL甲醇、5mL水加入SCX固相萃取柱，弃去流出液；b) SCX固相萃取柱上样:将所述提取所得的样品注入SCX固相萃取柱，弃去流出液；c)SCX固相萃取柱淋洗:依次用5mL 0.1%磷酸溶液、5mL水淋洗，流出液弃去；d)SCX固相萃取柱洗脱:30mL 0.2mol/L磷酸氢二钾溶液(磷酸调节PH 8.0)，洗脱，收集洗脱液，用磷酸调节pH至2，得第一样品洗脱液，用于C18固相萃取柱净化；e)活化C18固相萃取柱:将5mL甲醇、5mL水加入C18固相萃取柱(500mg/6CC)，弃去流出液；f)C18固相萃取柱上样:将所得的第一样品洗脱液加入C18柱，弃去流出液；j)C18固相萃取柱淋洗:5mL 0.1 %磷酸溶液淋洗C18柱，弃去流出液，抽干C18柱，再用5mL甲基叔丁基醚+正己烷混合溶液(体积比=4:1)淋洗，弃去流出液；h) C18固相萃取柱洗脱:10mL甲醇洗脱，收集第二样品洗脱液；i)重新溶解:35°C下将第二样品洗脱液减压蒸馏至干，使用ImL 2%甲醇-水定容，制得待测样品溶液，使用本发明所述的硫酸链霉素检测方法进行分析。
[0038]本发明的另一目的还在于提供本发明所述的硫酸链霉素检测方法在食品安全分析中的用途。其利用荧光探针与待测目标物硫酸链霉素特异性反应并生成新的荧光产物，提供了一种快速按检测食品中硫酸链霉素的方法。由于上述反应中，产物荧光信号的强度与硫酸链霉素浓度呈正相关，因此通过检测产物荧光信号的强度可以对硫酸链霉素进行定量检测。
[0039]本发明的目的还在于提供化合物9，10-菲醌在食品安全分析中，作为化学荧光探针检测硫酸链霉素的用途。该化合物为化学合成，资源丰富，较抗体等生物分子更容易获得，且具有更好的稳定性。
[0040]本发明使用的化学荧光探针的核心材料为化学合成，成本较低，对外界环境条件耐受程度高。所述硫酸链霉素检测方法快速便捷、灵敏高效、成本低，无需进行传统方法的复杂流程及液相色谱、色谱质谱联用等大型仪器，一般人员均可操作，适用于食品中硫酸