专利名称：使用氨基糖苷类抗生素检测prp的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过硫酸链霉素完全沉淀PrPsc的方法及其在免疫检测或从液体或溶液中除去PrPsc中的应用。
作为细胞朊病毒蛋白的天然或正常朊病毒蛋白，被命名为PrP或PrPc，是一种在哺乳动物的淋巴细胞和神经细胞中广泛表达的糖蛋白。
PrPc的构象变化导致了有蛋白酶K抗性的PrPc的蛋白病原体的出现和增殖。将这种蛋白病原体一般称为PrPsc或者PrPres。PrPsc在动物器官内的积聚是多种疾病的起源，尤其是小型反刍动物的震颤病，麋鹿和羚羊的慢性恶病质病(或者慢性消耗性病“CWD”)，牛的海绵状脑病(ESB)和人的克-雅二氏病(MCJ)。
感染了ESB的牛在2至6年的潜伏期后才有延迟表现并且病症发展缓慢，大大地减慢了流行病学模型的进展。ESB通过摄食传染人类，导致了一种新型克-雅二氏病(vMJC)的出现。
在发病以前看起来很健康的被感染动物体内，尤其是患病动物的血液或尿液中很难检测到蛋白病原体PrPsc。目前，已确认人在摄取被感染组织时，用于人类消费目的的动物中的PrPsc将传染人类。因此，公共卫生的一个主要目标是通过检测用于人类消费目的的动物体内PrPsc的存在以便将它们从食物链中除去，从而避免传染。
因此，检测生物学样品或动物体内PrPsc的存在已经变得极为重要，几个研究组正在研制免疫检测方法(WO02/086511)。此外，为了治疗vMJC，联合使用肽、小分子或PrPsc抑制剂的方法组成了热点研究的主题。然而，当生物样品中PrPsc的含量很低时，现有技术的方法总是难以通过可靠的方式鉴定PrPsc。
本发明人已经证明氨基糖苷，优选II类(group II)氨基糖苷，更优选链霉素的一种新特性，证实了抗生素与PrPsc形成复合体并使之沉淀的能力。
因此，本发明人观察到向多种动物来源且含有朊病毒的生物学样品中加入氨基糖苷后，致使朊病毒的3条带表观分子量增加。观察的结果和随后的试验使发明人证实了氨基糖苷能与PrPsc形成复合体，这种复合能够沉淀PrPsc，使得相对于本领域技术人员所用的常规方法而言检出PrPsc的可能性显著增加。
因而，本发明的目的涉及通过沉淀浓缩PrPsc的方法，用于诊断朊病毒引起的疾病或者除去生物学液体中的朊病毒，其特征在于使源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液接触抗生素，该抗生素优选选自氨基糖苷类家族，更优选链霉素。
更准确地说，根据本发明的方法包括如下步骤a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入一种氨基糖苷，b)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心得到的溶液，使底部和上清分离，c)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。
本发明的方法也可包括使用一定剂量的蛋白酶，尤其是蛋白酶K消化样品的附加步骤。因而，本发明的方法包括如下步骤a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入蛋白酶，例如蛋白酶K，b)加入一种氨基糖苷，c)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心得到的溶液，使底部和上清分离，d)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。
更准确地说，本发明的方法包括如下步骤a)在5％葡萄糖溶液中匀浆获自动物或人类生物体的生物学液体或组织，制备10％的悬液，b)向100μl得到的悬液中加入蛋白酶K，然后在37℃孵育一小时，c)向悬液中加入一种氨基糖苷，然后在37℃再孵育一小时，d)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，再离心得到的溶液，使底部和上清分离，e)将底部悬浮于50μl 50％v/v 8M的尿素溶液和Laemmli变性缓冲液中，该缓冲液如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685所述。剧烈旋涡振荡后，混合物在100℃加热5分钟，12,000g离心，回收上清夜用于SDS-PAGE迁移，f)在电泳凝胶上迁移后，尤其是在如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685记载的15％的聚丙烯酰胺十二烷基硫酸盐凝胶上的单向电泳后，蛋白质通过电泳转移到硝酸纤维素膜上，然后在室温与识别由126-160个氨基酸组成的特异表位的单克隆抗体免疫印迹60分钟。二抗(1/5000)是与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白的重链和轻链的山羊抗体(IgG H+L)；洗涤印迹膜，使用ECL试剂盒(Amersham)在胶片(Biomex light，Kodak)上检测信号或者使用super Signal Ultra(Pierce)通过化学发光并在Fluor S.Multimager(BioRad)显色检测信号。
根据本发明的方法具有不需要超速离心的优点。根据本发明的方法还涉及朊病毒蛋白与氨基糖苷形成复合体并通过氨基糖苷沉淀朊病毒蛋白。
根据本发明的实施方案，生物学组织源自或获自大脑，或其它动物或人体组织，或获自生物学液体，比如脑脊液或血清。
本发明方法所用蛋白酶是根据它消化存在的朊病毒蛋白的能力进行选择，包括其消化朊病毒蛋白的正常形式的能力，并且该酶不具备消化这个蛋白的病理形式的能力。优选蛋白酶K。
根据本发明优选的实施方案，组织在与所述氨基糖苷接触之前在葡萄糖溶液中匀浆。优选用5％的葡萄糖溶液。
向生物学样品与蛋白酶K和氨基糖苷作用得到的悬液中加入100μlLaemmli缓冲液后，加热步骤相应于温度升高60-150℃，优选约100℃。
根据本发明优选的实施方案，氨基糖苷是II类氨基糖苷，优选链霉素或其衍生物。
本发明也涉及所述氨基糖苷在PrPsc的沉淀、检测甚至免疫组织化学检测和/或诊断中的应用。
本发明也涉及所述氨基糖苷用于从生物学液体中除去PrPsc的应用。
最后，本发明也涉及用于诊断与PrPsc有关的病变的试剂盒，其特征在于含有所述氨基糖苷。
以下实施例涉及当生物学样品与氨基糖苷接触时对Pcrsc的检测的放大作用，阅读这些实施例后可显而易见本发明的的其它优点和特征。
实施例中的参照图见后面的附图。
图1A是感染了震颤病的绵羊脑样品中的PrPsc在不同数量的链霉素存在时，经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后检测结果的比较实施例。
图1B是与递增数量的链霉素混合前后，图1中每条PrPsc带测得的平均分子量的比较图。
图2是含有很多蛋白PrPsc的悬液在存在和不存在不同数量的链霉素时，经第二个小时孵育后，对比上清和沉淀中的PrPsc经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后检测的实施例。
图3显示了向含有少量PrPsc的悬液中同时加入蛋白酶K和链霉素，结果是上清中的PrPsc消失，而沉淀中出现了PrPsc。
图4A，4B和4C显示了经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后，当加入的链霉素量增加时，PrPsc的检测阈值增加。
图5中的表涉及实施例5，显示了使用本发明技术与使用参考技术获得的97个动物脑中PrPsc的诊断结果的比较。
图6显示了用扫描探针显微镜(scanning probe microscopy，SPM)以非接触模式得到的只有重组蛋白朊病毒(recPrP)(A)，有链霉素存在时的recPrP(B)和只有链霉素(C)的烘干胶片(dried film)图像。
图7A是患有克-雅二氏病的病人(MCJ+)和未患克—雅二氏病的病人(MCJ-)的脑脊液(LCR)样品中蛋白朊病毒经一定量范围的链霉素处理后，经12％bis-tris丙烯酰胺凝胶电泳、转移和免疫检测后，检测结果的比较实施例。图7B列出了图7A中各泳道的样品。
图8显示了用一定浓度范围内蛋白酶K消化或者未消化和经链霉素处理或者未处理后，MJC的LCR(+)和LCR(-)样品Western印迹的结果。免疫显色通过抗朊病毒抗体证实。图8B列出了图8A中各泳道的样品。
下面实施例2，3中的生物学样品是在5％葡萄糖溶液中匀浆牛脑获得的。在后面的试验中，100μl这种悬液相当于10mg脑组织。这样，每个加入了蛋白酶K的样品均由100μl组成。37℃孵育一小时后，加入或者不加链霉素。旋涡振荡溶液，37℃再孵育一小时。加入100μl变性Laemmli缓冲液后，混合物在100℃加热5分钟，然后以12,000g离心5分钟，回收上清用于SDS-PAGE迁移。底部也被回收并加入50μl 50％v/v8M尿素溶液和Laemmli缓冲液的溶液。经剧烈旋涡振荡后，混合物在100℃加热5分钟，以12,000g离心5分钟，回收上清用于SDS-PAGE迁移。
实施例1实施例1涉及图1A和1B的相关试验，其中递增浓度的(0μg，62.5μg，125μg，500μg和2000μg)链霉素加到相当于从920μg患有震颤病的绵羊脑中提取的恒量PrPsc中，然后离心混合物。上清用Western印迹作免疫检测(图1A)，测量PrPsc条带的平均分子量(图1B)。结果表明，随着链霉素量的增加，即由0，62.5，125，500，1000和2000μg的增长，可以观察到在链霉素浓度最低时，非糖基化的蛋白条带第一个出现了表观分子量的增加。随后复合的是单糖基化蛋白条带，最后当链霉素浓度达到最大时，复合双糖基化蛋白。
特定浓度下结合每条PrPsc带的链霉素分子的数量通过测定每条带的分子量来估算。发明人推测当有2000μg链霉素存在时，每条PrPsc带增加的表观分子量相当于每条PrPsc带吸附了10-12个链霉素分子。
实施例2实施例2涉及图2的相关试验，其中递增浓度的(0μl，5μl，10μl，和20μl)1g/ml的链霉素加到如上述方法制备的恒量生物学样品中。当没有链霉素时，所有的PrPsc带都鉴定为出现在上清中。它们应该逐渐地并同时在底部和上清中被检测到。上清中PrPsc的量逐渐减少，而沉淀中的量逐渐增加。加入20μl链霉素使PrPsc完全沉淀，所以只在沉淀中检测到。
实施例3实施例3涉及图3。
重复实施例2的试验，但是相同的脑样品稀释至实施例2的1/25，并在同时向脑悬液中加入蛋白酶K和链霉素后，孵育时间减至一小时。结果是当没有链霉素时，只在上清中检测到PrPsc带，而有任何浓度的链霉素存在时，只在底部中检测到PrPsc带。
实施例4实施例4涉及图4A、4B和4C。
将感染了ESB的牛脑在5％葡萄糖溶液中匀浆，制成10％的匀浆物母液，以1∶2对该母液进行系列稀释，同一稀释液制备3份，每管含有100μl相同的稀释液。
第一组稀释组中，每管加入体积为10μl的1μg蛋白酶K(从纯液至1/64)。
第二组稀释组中，每管同时加入5μl链霉素和体积为10μl的1μg蛋白酶K(从1/2至1/256)。
第三组稀释组中，每管同时加入10μl链霉素和体积为10μl的1μg蛋白酶K(从1/2至1/256)。
所有管子在37℃孵育一小时，然后加入100μl Laemmli变性缓冲液。混合物在100℃加热5分钟，然后以12,000g离心5分钟，回收第一组管的上清用于SDS-PAGE。除去第二组和第三组管的上清，每管中加入50μl 50％v/v 8M的尿素和Laemmli变性缓冲液。剧烈涡旋振荡后，混合物在100℃加热5分钟，12,000g离心，回收第二组管和第三组管的上清。
图4A显示了当没有链霉素时，PrPsc的检测极限值是1/16。
图4B显示了5μl链霉素存在时沉淀的PrPsc量检测的PrPsc减小到1/128稀释度，这说明检测阈值有很大的提高。
图4C显示了10μl链霉素存在时沉淀的PrPsc量图4C表明即使在最大稀释度的样品中(1/256)，检测还是可能和典型的。
实施例5-比较实施例参考技术是基于1.2ml脑匀浆物的PrPsc抽提物之上的(Madec等，Microbia Pathogenesis，28(2000)，353-362)。将匀浆物挤过直径0.4mm的针头，然后每100mg脑组织用10μg蛋白酶K在37℃处理一小时。加入肌氨酰(10％)和10mM tris缓冲液(pH7.4)后，样品在室温孵育15分钟，然后20℃在10％的蔗糖垫上以245,000g离心4小时(BeckmanTL 100超速离心机)。最后，底部用50μl Laemmli变性缓冲液悬浮，在100℃加热5分钟，然后以12,000g再离心5分钟。回收上清用于SDS-PAGE迁移。
根据本发明的技术，使用100μl如参考技术所述碾碎脑后得到的脑悬液。加入1μg蛋白酶K，混合物第一次孵育一小时。接着，加入20μl链霉素，混合物第二次孵育一小时。然后，加入100μl Laemmli变性缓冲液。在100℃加热5分钟，混合物以12,000g离心2分钟。除去上清，加入50μl 50％v/v 8M的尿素和Laemmli变性缓冲液。剧烈涡旋振荡后，混合物在100℃加热5分钟，12,000g离心2分钟。回收上清用于SDS-PAGE迁移。
结果如表1所示。总而言之，使用硫酸链霉素可更好地检测微阳性的情况，而且可避免长时间昂贵的超速离心。
实施例6recPrP(重组蛋白朊病毒)样品通过用等体积的水或链霉素溶液(1g/ml)稀释recPrP(42μM)溶液制得。单独链霉素对照用0.5g/ml溶液制备。
在刚裂开的云母上放置10μl这种溶液，37℃干燥24小时制得样品。
使用装有三角架的100μm扫描仪的AFM ExplorerThermomicroscope以非接触模式进行图象分析，其中用带有硅氧烷探针的塔形悬臂的提高的共振频率(F0＝320kHz)以1Hz频率扫描。图像处理使用SPMlab5.1软件，不使用滤片。
从图6中可以看出，单独的recPrP的图像表现出圆形聚集物的结构特征。单独的链霉素胶片表现出假晶体(pseudo-crystalline)表面的组织结构。含有混合物的胶片表现出无定形表面没有观察到晶体或球形组织结构。因此，链霉素和PrPsc之间的相互作用抑制了混合物的两种成分的表面组织结构特性。
实施例7从未患有MJC患者和患有MJC患者死后采集脑脊液(LCR)样品，优选为非溶血性且没有细胞碎片。一份来自未患有MJC患者的LCR样品和一份来自患有MJC患者的LCR样品与0.05g/ml到0.2g/ml(0.05-0.1和0.2g/ml)浓度范围之间的链霉素溶液接触。经过旋涡匀浆后(在旋涡器上匀浆)，样品在37℃孵育1小时，然后以12,000g离心5分钟。
得到的底部用蛋白抽提缓冲液重悬。在100℃加热10分钟后，样品以12,000g再离心5分钟。每个上清取15μl，进行12％bis-tris丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE。用5μl经变性缓冲液1/100稀释的脑PrPsc提取物平行地作为阳性对照。提取物的制备方法按照诊断克-雅二氏病的参考方案。恒压(200V)下在一次浓缩的电泳缓冲液中电泳40分钟。然后在恒定功率(1W)下，将蛋白向用两个石墨电极之间的半干系统激活的PVDF膜转移1小时。直接免疫显色用0.5μg/ml偶联了辣根过氧物酶的抗朊病毒抗体AC23(它识别人PrP的145-154氨基酸区域和动物PrP的同源区域)完成。
图7A显示了不用蛋白酶K消化时，链霉素与蛋白朊病毒良好结合。事实上，用0.1g/ml和0.2g/ml的链霉素处理后，观察到一条唯一带，它的表观分子量变化与链霉素浓度成比例。对0.1g/ml链霉素而言，该带的表观大小约为50kDa。此外，带的轮廓(弯曲的方向，衰减)表明了分子的聚集。
实施例8一份来自未患有MJC的患者的LCR和一份来自患有MJC的患者的LCR用0.5μg/ml或1μg/ml的蛋白酶K消化。平行地，等份的每个样品不用蛋白酶K消化。轻微搅动下，37℃消化1小时。消化后，样品在终浓度为50mg/ml的链霉素存在下37℃孵育一小时，然后以12,000g离心5分钟。
然后，按照实施例7的流程抽提蛋白，通过在蛋白变性缓冲液的存在下加热使蛋白变性并用Western印迹分析。直接免疫显色用偶联了辣根过氧物酶的抗体AC23(0.5μg/ml)完成。
图8A显示了样品用链霉素处理时，观察到一条单个低密度带。在不用蛋白酶K消化时，仅阴性样品中可见一条约35kDa表观分子量的带(LCR(-)凝胶中第5道)，然而阳性样品中无论使用何种浓度的蛋白酶(LCR(+)凝胶中第5，6和7道)，抗性形式的蛋白朊病毒都是可见的。
通过使用链霉素使LCR中蛋白朊病毒的检测成为可能。事实上，不用蛋白酶K消化检测的总PrP(细胞的和病理的)由于链霉素的存在而被放大，而且PrPsc出乎意料地被优先检测。用蛋白酶K消化后，本技术实现了在未患有克-雅二氏病的患者的LCR和患有相同病的患者的LCR之间表现出显著不同的信号。因此，链霉素对生物学液体中PrPsc的检测非常重要。
此外，氨基糖苷比如链霉素可用于通过接触氨基糖苷而沉淀PrPsc从而除去PrPsc。
权利要求
1.一种检测PrP、特别是PrPsc的方法，其特征在于使源自或获自动物或人类生物体的组织或生物学液体接触抗生素，该抗生素优选选自氨基糖苷类家族。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入一种氨基糖苷，b)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心所得到的溶液，并使底部和上清分离，c)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于a)向源自或获自动物或人类生物体的组织悬液或生物学液体悬液中加入蛋白酶K，b)加入一种氨基糖苷，c)将该溶液置于合适的缓冲液中并加热，然后离心所得到的溶液，并使底部和上清分离，d)电泳凝胶迁移、转移和免疫检测后检测PrPsc。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述生物学组织来自或获自动物或人的脑部或其它组织。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于所述蛋白酶是蛋白酶K。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于在与所述氨基糖苷接触前，将所述组织或生物学液体在葡萄糖溶液中匀浆。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其特征在于加热步骤相应于使温度升高60-150℃之间。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述氨基糖苷是II类氨基糖苷。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其特征在于所述氨基糖苷是链霉素。
10.氨基糖苷在PrPsc的沉淀、检测和/或诊断的应用，甚至在免疫组织化学检测中。
11.氨基糖苷用于从组织或生物学液体中除去PrPsc的应用。
12.用于诊断与PrPsc相关的病变的试剂盒，其特征在于含有氨基糖苷。
13.根据权利要求12的试剂盒，其特征在于所述氨基糖苷是II类氨基糖苷。
14.根据权利要求11-13任一项的试剂盒，其特征在于所述氨基糖苷是链霉素。
全文摘要
本发明涉及通过沉淀浓缩PrP
文档编号G01N33/68GK1729396SQ200380106773
公开日2006年2月1日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月20日
发明者阿利·穆萨, 安东尼·威廉·科尔曼, 安娜·本奇克－雷尼耶, 帕特里克·沙阿加尔蒂安, 埃尔韦·佩龙, 安布鲁瓦兹·马丁 申请人:法国食品卫生安全署, 国立科学研究中心, 克洛德·贝纳尔－里昂大学, 生物梅里埃公司