一种l-天冬氨酸制取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种L-天冬氨酸制取工艺，其工艺步骤为：(1)选育菌株；(2)细胞固定化；(3)转化；(4)修饰：取1g右旋糖苷溶于15ml蒸馏水，另取一定量NaIO4溶于10ml热水中，将两溶液混合，于4℃冰箱反应18h，室温下以蒸馏水透析4h后，再以5LpH7.4的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，将透析后的液体加入到步骤(3)的转化液中，混合充分，得到混合液；(5)制取粗品；(6)结晶，本发明的L-天冬氨酸能够在短时间内大量生产，修饰之后，抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，适于推广应用。
【专利说明】
一种L-天冬氨酸制取工艺
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种L-天冬氨酸制取工艺。
【背景技术】
[0002]天冬氨酸又称天门冬氨酸，是一种α -氨基酸，天冬氨酸的L-异构物是20种蛋白胺基酸之一，即蛋白质的构造单位，天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中。它是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体，它可作为K+、Mg+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。它参与鸟氨酸循环，促进氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增强肝脏功能，消除疲劳，具有很好的医药价值，因此需求量很大，迫使其批量生产，申请号为CN200910033427.1 一种利用富马酸发酵液制备天冬氨酸酶以及L-天冬氨酸的方法，方法包括，一是富马酸发酵液的清液部分培养大肠杆菌生产天冬氨酸酶，二是利用发酵液的固体沉淀部分富马酸钙与硫酸铵反应生成富马酸铵，经过浓缩后在天冬氨酸酶的作用下生成L-天冬氨酸，该种方法实现了以糖基路线生产L-天冬氨酸，实现了富马酸发酵液全利用以至达到节能减排的目标，有效的降低了 L-天冬氨酸的生产成本，减少了对环境的污染，使得L-天冬氨酸得到可持续的生产，具有较广的工业化生产前景，但是该种生产天冬氨酸的方法生产量小，无法满足大量需求，并且抗原性强，稳定性弱，导致药效差，限制了其使用范围。
【发明内容】
[0003]为克服现有技术上的不足，本发明目的是提供一种L-天冬氨酸制取工艺。
[0004]为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下:
[0005]—种L-天冬氨酸制取工艺，其工艺步骤如下:
[0006](I)选育菌株:选用大肠杆菌作为天冬氨酸酶的来源，用肉汁培养基培养种子，接种与摇瓶培养基中，于32°C下振摇培养12h，逐级扩大培养至1000-2000L规模后，用Imol/L的HCl调pH至5.0，保温42°C，2h后，冷却至室温，于转筒式高速离心机内离心，收集含有天冬氨酸酶的菌体；
[0007](2)细胞固定化:取大肠杆菌湿菌体15kg，悬浮于离心后的培养清液80L中或80L生理盐水，保温35°C再加入90L保温35°C的18%明胶溶液和1.0 %的戊二醛溶液，充分搅匀后，放置冷却凝固，再放入0.25mo 1/L戊二醛溶液中浸泡，于5 °C过夜后，再切成3_5_3大小的小块，并将其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C过夜，再取出以蒸馏水洗涤，滤干，得含天冬氨酸酶的固定化大肠杆菌，将其装填到填充式生物反应器中，备用；
[0008](3)转化:取保温32°C的lmol/L延胡索酸铵含lmmol/LMgC12，pH为8.5底物的溶液，以一定的空间速度连续流过生物反应器，控制最大转化率大于95%，得转化液；
[0009](4)修饰:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸馈水，另取一定量Na104溶于1ml热水中，将两溶液混合，于4°C冰箱反应18h，室温下以蒸馏水透析4h后，再以5LpH7.4的0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，将透析后的液体加入到步骤(3)的转化液中，混合充分，得到混合液；
[0010](5)制取粗品:向步骤(4)得到的混合液渐加入lmol/L的HC1，调pH至2.8，在保持5°C下放置过夜结晶，滤取结晶，用水洗涤，滤干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品；
[0011](6)结晶:将粗品用稀氨水重结晶，先以氨水溶解成pH为5.0，浓度15%再加入1%活性炭，加热70°C搅拌脱色2h后，趁热过滤去渣，取滤液冷却，保温5°C过夜结晶，过滤取结晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。
[0012]优选的，所述步骤(I)中，所述培养基为斜面培养基。
[0013]优选的，所述步骤(4)中，所述修饰过程加入交联剂。
[0014]有益效果:本发明通过选育菌株、细胞固定化、转化、修饰、制取粗品、结晶六大步骤完成抗原性弱的L-天冬氨酸制取工艺，能够在短时间内大量生产，修饰之后，抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，整个制取过程严格控制PH和温度，并且通过固定化生产，致使生产的L-天冬氨酸稳定性好，循环有效批量生产，在修饰步骤中，选用Na104作为氧化剂，其氧化性强，指示性好，方便快捷地使L-天冬氨酸得到修饰，加入的交联剂使修饰反应更加容易地进行，制取粗品之后，通过结晶精制产品，保证了产品的纯度，使其在发挥作用时，药效更好，斜面培养基使大肠杆菌附着容易，而且便于提取工作，本工艺使L-天冬氨酸的短时间内大量生产，极大满足人们的需求，适于推广使用。
【具体实施方式】
[0015]为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。
[0016]实施例1:
[0017]本实施例的一种L-天冬氨酸制取工艺，其工艺步骤如下:
[0018](I)选育菌株:选用大肠杆菌作为天冬氨酸酶的来源，用普通肉汁培养基培养种子，接种与摇瓶培养基中，于32°C下振摇培养12h，逐级扩大培养至1000-2000L规模后，用lmol/L的HCl调pH至5.0，保温42°C，2h后，冷却至室温，于转筒式高速离心机内离心，收集含有天冬氨酸酶的菌体，所述培养基为斜面培养基；
[0019](2)细胞固定化:取大肠杆菌湿菌体15kg，悬浮于离心后的培养清液80L中或80L生理盐水，保温35°C再加入90L保温35°C的18 %明胶溶液和1.0 %的戊二醛溶液，充分搅匀后，放置冷却凝固，再放入0.25mo 1/L戊二醛溶液中浸泡，于5 °C过夜后，再切成3_5_3大小的小块，并将其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C过夜，再取出以蒸馏水洗涤，滤干，得含天冬氨酸酶的固定化大肠杆菌，将其装填到填充式生物反应器中，备用；
[0020](3)转化:取保温32°C的lmol/L延胡索酸铵含lmmol/LMgC12，pH为8.5底物的溶液，以一定的空间速度连续流过生物反应器，控制最大转化率大于95%，得转化液；
[0021](4)修饰:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸馈水，另取一定量Na104溶于1ml热水中，将两溶液混合，于4°C冰箱反应18h，室温下以蒸馏水透析4h后，再以5LpH7.4的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，将透析后的液体加入到步骤(3)的转化液中，混合充分，得到混合液，所述修饰过程加入交联剂；
[0022](5)制取粗品:向步骤(4)得到的混合液渐加入lmol/L的HCl，调pH至2.8，在保持5°C下放置过夜结晶，滤取结晶，用水洗涤，滤干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品；
[0023](6)结晶:将粗品用稀氨水重结晶，先以氨水溶解成pH为5.0，浓度15%再加入1%活性炭，加热70°C搅拌脱色2h后，趁热过滤去渣，取滤液冷却，保温5°C过夜结晶，过滤取结晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。
[0024]实施例2:其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(3)控制最大转化率改为大于90 %，本实施例中，成本低，制取时间短，但纯度低。
[0025]实施例3:其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(6)中趁热过滤去渣之后，再进行一次重结晶，本实施例中，操作繁杂，耗时长，但制取产品纯度高。
[0026]经实际应用中可知，通过选育菌株、细胞固定化、转化、修饰、制取粗品、结晶六大步骤完成抗原性弱的L-天冬氨酸制取工艺，能够在短时间内大量生产，修饰之后，抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，整个制取过程严格控制pH和温度，并且通过固定化生产，致使生产的L-天冬氨酸稳定性好，循环有效批量生产，在修饰步骤中，选用Na104作为氧化剂，其氧化性强，指示性好，方便快捷地使L-天冬氨酸得到修饰，加入的交联剂使修饰反应更加容易地进行，制取粗品之后，通过结晶精制产品，保证了产品的纯度，使其在发挥作用时，药效更好，斜面培养基使大肠杆菌附着容易，而且便于提取工作，本工艺使L-天冬氨酸的短时间内大量生产，极大满足人们的需求，适于推广使用。
[0027]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.一种L-天冬氨酸制取工艺，其特征在于，其工艺步骤如下: (1)选育菌株:选用大肠杆菌作为天冬氨酸酶的来源，用肉汁培养基培养种子，接种与摇瓶培养基中，于32°C下振摇培养12h，逐级扩大培养至1000-2000L规模后，用lmol/L的HCl调pH至5.0，保温42°C，2h后，冷却至室温，于转筒式高速离心机内离心，收集含有天冬氨酸酶的菌体； (2)细胞固定化:取大肠杆菌湿菌体15kg，悬浮于离心后的培养清液80L中或80L生理盐水，保温35°C再加入90L保温35°C的1896明胶溶液和1.0%的戊二醛溶液，充分搅匀后，放置冷却凝固，再放入0.25mol/L戊二醛溶液中浸泡，于5°C过夜后，再切成3_5mm3大小的小块，并将其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C过夜，再取出以蒸馏水洗涤，滤干，得含天冬氨酸酶的固定化大肠杆菌，将其装填到填充式生物反应器中，备用； (3)转化:取保温32°C的lmol/L延胡索酸铵含lmmol/LMgC12，pH为8.5底物的溶液，以一定的空间速度连续流过生物反应器，控制最大转化率大于95%，得转化液； (4)修饰:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸馈水，另取一定量Na104溶于1ml热水中，将两溶液混合，于4°C冰箱反应18h，室温下以蒸馏水透析4h后，再以5LpH7.4的0.lmol/L磷酸钠缓冲液透析，将透析后的液体加入到步骤(3)的转化液中，混合充分，得到混合液； (5)制取粗品:向步骤(4)得到的混合液渐加入lmol/L的HCl，调pH至2.8，在保持5°C下放置过夜结晶，滤取结晶，用水洗涤，滤干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品； (6)结晶:将粗品用稀氨水重结晶，先以氨水溶解成pH为5.0，浓度15%的溶液再加入1%活性炭，加热70°C搅拌脱色2h后，趁热过滤去渣，取滤液冷却，保温5°C过夜结晶，过滤取结晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。2.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸制取工艺，其特征在于，所述步骤(I)中，所述培养基为斜面培养基。3.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸制取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中，所述修饰过程加入交联剂。
【文档编号】C12R1/19GK105886567SQ201410693796
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月27日
【发明人】张爱标
【申请人】张爱标