一种微生物生产氰基羟基安息香酸的方法
【专利摘要】一种微生物生产氰基羟基安息香酸的方法，具体是一种解脂假丝酵母生物催化制备医药中间体3?氰基?4?羟基?安息香酸的方法，微生物发酵液中加入底物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。
【专利说明】
一种微生物生产氰基羟基安息香酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到解脂假丝酵母生物催化制备医药中间 体3-氰基-4-羟基-安息香酸的技术。
【背景技术】
[0002] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的应用领域之一，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。
[0003] 芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成 起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与C0 2反应，反应压力高达lOMPa， 温度高达140-380°C，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采 用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应 少，产率高。
[0004] 本发明将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸:3_氰基-4-羟基-安息香酸。
【发明内容】
[0005] 本发明采用解脂假丝酵母催化制备3-氰基-4-羟基-安息香酸，反应式如下：
底物2-羟基-氰苯（1)经解脂假丝酵母催化反应，得到产物3-氰基-4-羟基-安息香酸 (2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用解脂假丝酵母作为 催化剂，因为其催化反应的效果最好，副产物极少，反应收率高。
[0006] 许多酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发 明选用解脂假丝酵母菌株为DSM-70561，其催化反应效果最佳。
[0007] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性 剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质 为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是 提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使 得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须 生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。 大量实验表明，对于本反应，加入单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L是最佳的。
[0008] 反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法： 加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁;凝聚法:加入聚合氯化铝、明矾等； 或者将上述2类混合加入;加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入 1.6%的硫酸钙+0.1%的明矾是最佳的。
[0009] 羧化反应中，采用NaHC〇3提供C02,实际上，有多种物质可以提供C02,但是，通过大 量实验，结果表明，对于本发明，使用NaHC0 3是最佳的。由于加入NaHC03会使反应液的pH升 高，而适宜的PH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入 NaHC03。然而，即使流加 NaHC03，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处 于适宜的PH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是 适宜的方法，调节NaHC0 3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物 催化反应正常进行。
[0010] 可以明显看出，本发明所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、 C02供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众 多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反 应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催 化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。
[0011] 培养介质： 1、种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6.5;配 制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0012] 2、培养液成份：酵母浸膏6-7 g/L，葡萄糖29-31 g/L，麦芽浸膏30-32 g/L，玉米 胚芽浆25-27g/L，硫酸铵0 · 2-0 · 25g/L，硫酸镁0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧钾1 · 8-2 · 3g/L;固体培 养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉；pH6.5。
[0013] 3、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0014]微生物发酵液制备。解脂假丝酵母DSM-70561经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子 液;发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至30-32Γ，将解脂假丝酵母种子液接 种至发酵罐，接种比例为9-9.5%，通气比为1.6-1.8VAV·分钟），32-33°C培养44-48小时， 发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0015] 用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓 冲液：甲醇=90:10。
[0016] 生物催化反应:发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-羟 基-氰苯，使浓度为98-10 lg/L，补加以下成份，使浓度为:单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L， 葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至35-36°C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40小时;反应开始时，立即流加浓度 为4.5 %的NaHC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的 流加速率，维持PH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.9-0.95V/V.分钟，即 每分钟通气量为0.9-0.95倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯 萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物3-氰基-4-羟基-安息香 酸，反应转化率98.5-99.6 %，产品收率96.5-97.7 %。
[0017] 实施例！ 培养液成份:酵母浸膏6-7 g/L，葡萄糖29-31 g/L，麦芽浸膏30-32 g/L，玉米胚芽浆 25-27g/L，硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L;固体培养基成 份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉；pH6.5。
[0018] 微生物发酵液制备。解脂假丝酵母DSM-70561经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子 液;发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至30-32Γ，将解脂假丝酵母种子液接 种至发酵罐，接种比例为9-9.5%，通气比为1.6-1.8VAV·分钟），32-33°C培养44-48小时， 发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0019] 生物催化反应：15L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 2-羟基-氰苯，使浓度为98-101g/L，补加以下成份，使浓度为:单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L，葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却 至35-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的NaHC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶 液的流加速率，维持PH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.9-0.95V/V ·分 钟，即每分钟通气量为〇. 9-0.95倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸 乙酯萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物3-氰基-4-羟基-安 息香酸，反应转化率98.5-99.6 %，产品收率96.5-97.7 %。
[0020] 实施例2 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0021 ]生物催化反应:150L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 2- 羟基-氰苯，使浓度为98-101g/L，补加以下成份，使浓度为:单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L，葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却 至35-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的NaHC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶 液的流加速率，维持PH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.9-0.95V/V ·分 钟，即每分钟通气量为〇 . 9-0.95倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、 0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 3- 氰基-4-羟基-安息香酸，反应转化率98.5 %，产品收率96.5 %。
[0022] 实施例3 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0023]生物催化反应：1000L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物2-羟基-氰苯，使浓度为98-10 lg/L，补加以下成份，使浓度为:单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L，葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却 至35-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的NaHC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶 液的流加速率，维持PH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.9-0.95V/V ·分 钟，即每分钟通气量为〇 . 9-0.95倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、 0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 3-氰基-4-羟基-安息香酸，反应转化率98. 6 %，产品收率96.8 %。
[0024] 实施例4 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0025]生物催化反应:15000L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物2-羟基-氰苯，使浓度为98-10 lg/L，补加以下成份，使浓度为:单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L，葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却 至35-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的NaHC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶 液的流加速率，维持PH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.9-0.95V/V ·分 钟，即每分钟通气量为〇. 9-0.95倍反应液体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃取 液为乙酸乙酯，蒸出有机相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物3-氰基-4-羟基-安息香 酸，反应转化率99.6 %，产品收率97.7 %。
【主权项】
1. 一种解脂假丝酵母生物催化制备3-氰基-4-羟基-安息香酸的方法，其特征在于解脂 假丝酵母发酵液中加入底物2-羟基-氰苯，使浓度为98-101g/L，补加以下成份，使浓度为： 单硬脂酸甘油酯含量为25-28g/L，葡萄糖29-33g/L、木糖35-40g/L、小麦麸皮粉20-25g/L， 121°C高压灭菌30分钟;冷却至35-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为36-40 小时；反应开始时，立即流加浓度为4.5 %的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水 溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.5-6.6，所加入的物料均经过灭菌处 理;通气比为0.9-0.95V/V ·分钟，即每分钟通气量为0.9-0.95倍反应液体积，反应结束后， 破乳，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物3-氰基-4-羟基-安息香酸， 反应转化率98.5 %，产品收率96.5 % ;所述发酵液由培养液发酵微生物得到。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于解脂假丝酵母发酵液制备过程如下:解脂假丝酵 母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却 至30-32Γ，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9-9.5%，通气比为1.6-1.8VAV·分钟），32-33°C培养44-48小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液 用作生物催化反应催化剂;培养液成份:酵母浸膏6-7g/L，葡萄糖29-31 g/L，麦芽浸膏30-32 g/L，玉米胚芽浆25-27g/L，硫酸铵0 · 2-0 · 25g/L，硫酸镁0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧钾1 · 8-2.3g/L;固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉；pH6.5。
【文档编号】C12R1/73GK105886565SQ201610464849
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】秦敬如, 刘均洪
【申请人】青岛科技大学