专利名称：D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法
技术领域：
本发明属于手性化合物生物转化分离技术领域，具体地说是涉及一种手性有机化合物的制备方法，尤其是制备D-鸟氨酸和腐胺的方法，也可适用于其它手 性D型氨基酸类化合物和脂肪胺或芳香胺的制备。
背景技术：
D型氨基酸具有重要的生理功能，随着医药工业、食品工业及多肽合成科学 发展,对光学纯氨基酸需求量急剧增加。但D-鸟氨酸(D-Ornithine, D-Orn)的 生产方法较少，生产成本较高。通过发酵法较难获得D-鸟氨酸，而化学合成法 合成得到的氨基酸多为外消旋体(DL型)，必须进行拆分。使用脱羧酶进行DL-氨基酸酶法生物转化是生产光学纯D型氨基酸有效方法之一。鸟氨酸广泛应用于医药、食品和农药等领域。光学纯鸟氨酸衍生物发展目标 是作为药物或医药中间体。L-鸟氨酸(L-Ornithine, L-0rn)是一种重要氨基酸， 在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛用途。D-鸟氨酸属于非天然氨基酸， 具有独特的生物学特性，在多肽合成中具有重要作用。将多肽中某些L-氨基酸 以D-鸟氨酸取代，可以使该多肽产生特殊生物学性质，如D-鸟氨酸可以取代 脑啡肽的第二位氨基酸形成Tyr-D-Orn-Gly-Phe朋2这一类似物，其生理作用是 脑啡肽的数十倍。 一些氨基酸类抗生素中杂入D-鸟氨酸时，难以被细菌酶降解 而不至或减少抗药性产生。D-鸟氨酸及其衍生物还可用于无公害新型氨基酸农药 合成，应用前景十分广阔。本发明还涉及到1，4-丁二胺(腐胺)及其衍生物制备。鸟氨酸脱羧基生成腐 胺(Putriscine， PUT)，后者再相继转变为精脒和精胺，这些统称为多胺类化合 物。多胺是生物体内重要的代谢调控物质，是一种内源活性物质，广泛存在于一 切生物体内，在生理pH下，多胺呈高密度的阳性电荷，参与核酸和蛋白质合成。 与正常细胞生长和分化以及与肿瘤发生和发展密切相关。如1948年Herbs首先 在细菌中发现多胺的存在，其后Ham和Bertossi分别于1964、 1965年发现多 胺在动植物细胞增殖中有重要作用。腐胺也能有效地保持植物愈伤组织的胚胎发 生能力，并减少愈伤组织的褐化。因此，腐胺、亚精胺和精胺等多胺在调节生长发育、细胞的增殖及分化等各个方面具有重要的意义。腐胺也可用于生产工程塑 料，尤其是聚酰胺-4，6的化合物现已成商品售出。目前，制备D-鸟氨酸和腐胺的方法，主要有化学合成法、手性拆分法、生物 发酵法等方法。1. D-鸟氨酸制备方法(1) 生物转化方法通过DL-鸟氨酸与一氯乙酸的乙酰化作用，得到a， 5-二氯乙酰基-DL-鸟氨 酸，后使用从动物肾脏中提得乙酰化酶进行酶转化使a ， S-二氯乙酰基-DL-鸟 氨酸中的a， S-二氯乙酰基-L-鸟氨酸中的氯乙酰基被降解，通过分离得到L-鸟氨酸和a， S-二氯乙酰基-D-鸟氨酸，而后再水解掉a ， 5-二氯乙酰基-D-鸟氨酸的氯乙酰基，得到D-鸟氨酸。(JBiolChem. 1951; 188(2):643-646)(2) 不对称化学合成方法利用氨基保护的丙氨酸与苯甲醛二甲缩醛为反应原料经环化反应得到恶唑 烷酮，后分别与Y-碘代丁酸叔丁酯，叠氮基磷酸二苯酯(DPPA)反应，最后以 甲醇为溶剂经把催化加氢得到相应D-鸟氨酸衍生物。该方法虽然为不对称合成方 法，但是反应步骤较长，所用试剂与原料较为难寻，且价格高昂，不利于D-鸟氨 酸的大规模制备。(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1995; 5(19): 2207-2210)2.腐胺制备方法合成腐胺已有大量合成路线，所有这些化学途径有如下缺点起始材料从被 认为是不可更新的化工原料获得，并将产生环境污染。制备腐胺经济可行和环境 友好的方法是用可更新碳源以及使用活细胞的生物化学方法来合成腐胺。如利用 微生物发酵方法，以适当的碳源和氮源为发酵底物，将具有鸟氨酸脱羧酶活性的 微生物中产生的腐胺被排出到发酵培养液中，对发酵培养液中的腐胺进行收集 (CN101006183， 2005)。和通过对含有蛋白质作为主要的天然产品进行发酵生 产腐胺(EP0726240)。但是该两种方法都存在不能制备D-鸟氨酸的缺点，同时通常多胺类物质被认 为对于生物化学生产中使用的任何细胞或微生物来说都是有毒的。因此，直到现 在，人们仍然详细通过生物发酵的方法是不便获得多胺类化合物。到目前为止，采用L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物为消旋反应原料， 经消旋反应得到DL-精氨酸或其衍生物，随后以有赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶 的微生物或酶进行生物转化，得到D-鸟氨酸和腐胺及其衍生物的方法未见文献 报道。本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种生产成本较低、 后处理容易、设备投资少，环境友好且适合工业化生产D-鸟氮酸和腐胺及其衍 生物的方法，本发明是通过已发酵的全细胞所含的脱羧酶来进行酶催化反应不仅 获得D-鸟氨酸，同时可获得腐胺。本发明是以如下技术方案实现的D-鸟氨酸和腐胺及其衍生物手性制备方法 是以L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物为化学消旋反应原料，经消旋反应 得到DL-精氨酸或其衍生物，再用含有赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶的微生物或 酶进行生物转化，得到D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物，其方法步骤如下(1) 将L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物与适量催化剂水杨醛或其衍 生物混合后，在3(TC至溶剂沸点下溶于水的酸碱溶剂中，经0. 5-24小时反应后， 可得到DL-鸟氨酸或其衍生物；(2) 取上述DL-鸟氨酸或其衍生物，用经发酵培养的微生物含有脱羧酶全 细胞或提取得到相应脱羧酶，再加入PH5-10缓冲溶液和表面活性剂，将该DL-鸟氨酸或其衍生物中的丄-鸟氨酸或其衍生物脱羧分解，可得到D-鸟氨酸和腐胺 或其衍生物；(3) 通过等电点结晶法或等电点结晶法与离子交换树脂分离相结合的方法 将反应生成物进行分离，得到高纯度的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物。上述步骤(1)所述的L-精氮酸或部分消旋精氨酸及其衍生物其结构式是其中Ri可以是烷基、芳基、卤素、羟基和烷氧基取代基；，R2可以是烷基、 芳基、卣素、羟基和烷氧基取代基；R3可以是烷基、芳基、卤素、羟基和烷氧基发明内容取代基。所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物也可以是精氨酸盐包括 盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。 上述步骤(2)所述的脱羧酶为(1) L-赖氨酸脱羧酶(L-Lysine Decarboxylase, EC 4.1.1.18， LDC)，催 化以下反应DL-鸟氨酸 D-鸟氨酸 腐胺(2) L-鸟氨酸脱羧酶(L-Ornithine Decarboxylase, EC4. 1. 1. 17，简称 ODC)，催化以下反应上述步骤(2)所用的培养基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，果 糖，乳糖。其浓度为5-30g/L;氮源采用有机氮源，如酵母膏，玉米浆，蛋白胨， 豆饼水解液或蛋白质水解物，其浓度为5-30g/L，加入L-赖氨酸或L-鸟氨酸诱 导，其浓度为0. 1-20g/L。上述步骤(2)所述的缓冲溶液包括磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液，磷酸盐 缓冲溶液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液，巴比妥钠-盐酸缓冲溶液，Tis-盐酸 缓冲溶液硼砂-盐酸缓冲溶液，硼酸-硼砂缓冲溶液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲溶液使转化液pH5-10。上述步骤(2)所述的表面活性剂包括吐温-80，十六烷基三甲基溴化铵，聚 乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0. 005%-5%。上述步骤(2)所述的培养液中赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶为每小时每克 湿细胞转化lX103 lX105nmol L-鸟氨酸。本发明的优点是D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法是一种既经济可 行又具有高效拆分效率的适合工业化生产的方法，从目前的研究表明，采用L-精氨酸或部分消旋精氨酸及其衍生物为化学消旋反应原料,经消旋反应得到D,L-精氨酸或其盐及其衍生物，随后以有赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶的微生物或酶 进行生物转化，得到D-鸟氨酸和腐胺及其衍生物的方法是经济可行的，适合于 大规模工业化生产且具有环境友好特点。本发明解决了 D-鸟氨酸和腐胺或其衍 生物制备中的以下几个问题(1) 使用溶剂无毒害、价格低廉，而且易于回收。a. 本发明减少了贵重有机溶剂的使用，所使用的溶剂为无毒无害的亲水性 溶剂体系，而且价格低廉，方便获得，易于回收。b. 通过拆分母液的循环使用，减少了溶剂的使用量，降低了生产成本。(2) 原料来源广泛，价格便宜。利用L-精氨酸或部分消旋精氯酸为消旋反应原料，具有原料来源广，价格低 廉的优势，随着我国氨基酸发酵工业的发展，精氨酸面临产能过剩问题，本方法 需找到一种以精氨酸为原料制备高附加值的D-鸟氨酸和腐胺及其衍生物的方 法，有助于解决这一矛盾。(3) 、该方法具有转化时间短，操作简便，生产成本低等优点，同时工艺流 程简单，适合于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明 实施例11.将泡/)w'a AS 1. 1009菌株在如下1000mL培养基中蔗糖2%，蛋白胨1%，玉米浆2%，酵母膏0. 1%， (NH4) 2S04 0. 1%， L-赖氨酸1%。发酵条件为 温度35°C ，接种量6% ，培养基装量100mL，发酵时间14h。经4000rpm离心15rain得湿细胞。2. 将细胞加入到600mL转化液中，转化液含有10%的经消旋反应得到的DL-鸟氨酸，加入6mL0. 5%吐温-80和600mL pH8. 0磷酸缓冲液，37。C反应24h。。3. 将转化液浓缩至200mL，加入2g活性炭脱色处理。脱色液继续浓縮至 100mL，加入200mL95y。乙醇搅拌均匀，冷却结晶，过滤后真空干燥得到晶体干重37.5g， [a]1)U=-11.5(C=5.5, H20)，所得母液经JK008阳离子树脂吸附，用3%氨水洗脱，洗脱液经活性炭脱色后浓縮，将浓缩液调pH至lO，得到腐胺21.8g。 转化后可以得到理论收率为75. 0%的D-鸟氨酸和理论收率为65. 3%的腐胺。 实施例21. 选用#3/>w's sJrei AS 1.1009菌株，种子培养和发酵条件同实施例1， 得湿细胞。2. 将细胞加入到600mL转化液中，转化液含有10%的经消旋反应得到的DL-鸟氨酸，加入6mL 0. 1%十六烷基三甲基溴化铵和600mL pH7. 0磷酸二氢钠-柠檬 酸缓冲溶液，3(TC反应36h。3. 将转化液浓縮至200mL，加入2g活性炭脱色处理。脱色液继续浓缩至 100mL，加入200mL95y。乙醇搅拌均匀，冷却结晶，过滤后真空干燥得到晶体干重30. lg， [ a ]ZDU=-10.8(05.5， H20),所得母液经JK008阳离子树脂吸附，用3% 氨水洗脱，洗脱液经活性炭脱色后浓缩，将浓縮液调PH至IO，得到腐胺。转化 后可以得到理论收率为60. 2%的D-鸟氨酸和理论收率为51. 2%的腐胺。 实施例31. 将^s/) /s W陀i AS 1. 1009菌株在如下1000raL培养基中葡萄糖2%， 豆饼水解液1%，玉米浆2%，酵母膏0. 1%， (NH4) 2S04 0. 1%， L-鸟氨酸0. 5%。发 酵条件为温度35°C，接种量5%，培养基装量100mL，发酵时间20h。经4000rpm 离心15min得湿细胞。2. 将细胞加入到600raL转化液中，转化液含有10%的经消旋反应得到的DL-鸟氨酸，加入6mL0. 5%吐温-80和600mLpH9. 0硼砂-盐酸缓冲溶液，4(TC反应站h。3. 将转化液浓縮至200mL，加入2g活性炭脱色处理。脱色液继续浓縮至 100mL，加入200mL95。/。乙醇搅拌均匀，冷却结晶，过滤后真空干燥得到晶体干重35.5g， [a]l)U=-11.2(C=5.5， H20)，所得母液经JK008阳离子树脂吸附，用3%氨水洗脱，洗脱液经活性炭脱色后浓縮，将浓縮液调pH至lO，得到腐胺20.3g。 转化后可以得到理论收率为71. 0%的D-鸟氨酸和理论收率为60. 7%的腐胺。
权利要求
1.一种D-鸟氨酸和腐胺及其衍生物手性制备方法，其特征在于以L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物为化学消旋反应原料，经消旋反应得到DL-精氨酸或其衍生物，再用含有赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶的微生物或酶进行生物转化，得到D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物，其方法步骤如下(1)将L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物与适量催化剂水杨醛或其衍生物混合后，在30℃至溶剂沸点下溶于水的酸碱溶剂中，经0.5-24小时反应后，可得到DL-鸟氨酸或其衍生物；(2)取上述DL-鸟氨酸或其衍生物，用经发酵培养的微生物含有脱羧酶全细胞或提取得到相应脱羧酶，再加入pH5-10缓冲溶液和表面活性剂，将该DL-鸟氨酸或其衍生物中的L-鸟氨酸或其衍生物脱羧分解，可得到D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物；(3)通过等电点结晶法或等电点结晶法与离子交换树脂分离相结合的方法将反应生成物进行分离，得到高纯度的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物。
2. 根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其特征在于步骤(1)所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸及其衍生物其结构式是<formula>formula see original document page 2</formula>其中R'可以是烷基、芳基、卤素、羟基和烷氧基取代基；R2可以是烷基、芳 基、卤素、羟基和烷氧基取代基；R3可以是垸基、芳基、卤素、羟基和垸氧 基取代基，所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物也可以是精氨酸盐 包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。
3.根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其特征在于步骤(2)所述的脱羧酶为(1) L-赖氨酸脱羧酶(L-Lysine Decarboxylase, EC 4.1.1.18， LDC)， 催化以下反应(2) L-鸟氨酸脱羧酶(L-Ornithine Decarboxylase, EC4丄1. 17，简称 ODC)，催化以下反应<formula>formula see original document page 3</formula>
4. 根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其特征在于步骤(2)所用的培养基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其浓度为5-30g/L;氮源采用有机氮源，如酵母膏，玉米浆， 蛋白胨，豆饼水解液或蛋白质水解物，其浓度为5-30g/L，加入L-赖氨酸或 L-鸟氨酸诱导，其浓度为0. 1-20g/L。
5. 根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其 特征在于步骤(2)所述的缓冲溶液包括磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液， 磷酸盐缓冲溶液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液，巴比妥钠-盐酸缓冲溶液， Tis-盐酸缓冲溶液硼砂-盐酸缓冲溶液，硼酸-硼砂缓冲溶液，甘氨酸-氢氧化 钠缓冲溶液，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲溶液使转化液pH5-10。
6. 根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其 特征在于步骤(2)所述的表面活性剂包括吐温-80，十六烷基三甲基溴化 铵，聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0. 005%-5%。
7. 根据权利要求1所述的D-鸟氨酸和腐胺或其衍生物手性制备方法，其 特征在于步骤(2)所述的培养液中赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶为每小时 每克湿细胞转化lX103 lX105ymol L-鸟氨酸。
全文摘要
本发明属于手性化合物生物转化分离技术领域，具体地说是涉及一种手性有机化合物的制备方法，尤其是制备D-鸟氨酸和腐胺的方法，也可适用于其它手性D型氨基酸类化合物和脂肪胺的制备。将L-精氨酸或其盐与水杨醛或其衍生物按比例混合，溶于碱性或酸性溶剂中，经消旋反应后，得到DL-鸟氨酸；取DL-鸟氨酸，在25℃至45℃下用含有赖氨酸脱羧酶或鸟氨酸脱羧酶的微生物或酶进行生物转化，得到D-鸟氨酸和腐胺，再用等电点结晶法或离子交换树脂分离方法，将D-鸟氨酸和腐胺分离，得到光学纯D-鸟氨酸和腐胺。本方法使用的化学消旋方法主要有水为溶剂，催化剂消耗少，使用的溶剂无毒害、价格低廉，微生物易于培养，适合于大规模工业化生产。
文档编号C12P41/00GK101235403SQ200810018589
公开日2008年8月6日 申请日期2008年2月26日 优先权日2008年2月26日
发明者毅 刘, 玲 刘, 莉 刘, 印晓星, 玲 张, 林奇泗 申请人:徐州医学院