] 实施例11
[0074] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
[0075] (1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划 线，37°C培养lOh，使菌株复壮；
[0076] (2)种子液的培养:将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32°C，240rpm 培养20h，然后将所得菌液按照体积比为1%的接种量接种到实施例6制备的一种用于高产 核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，32°C，240rpm培养10h，得到种子液；
[0077] (3)发酵罐发酵:将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为10%的比例接种到装有 2L实施例6制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加 入氯霉素，使浓度为5ug/L，在35°C，pH=6.5，0-20h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌转速 调整为SOOrpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料的方 式补充实施例8制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基;补 料速度为〇.lml/min，当溶氧水平降至10%以下时，增加发酵罐的压力至O.IMPa;当发酵液 中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过77h发酵，核黄素产量达到10.60g/L。
[0078] 实施例12
[0079] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
[0080] (1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划 线，37°C培养20h，使菌株复壮；
[0081 ] (2)种子液的培养:将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，37°C，180rpm 培养l〇h，然后将所得菌液按照体积比为10%的接种量接种到一种实施例5制备的用于高产 核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，37°C，180rpm培养20h，得到种子液；
[0082] (3)发酵罐发酵:将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1%的比例接种到装有 3L实施例5制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加 入氯霉素，使浓度为40ug/L，在37°C，pH = 7.3，0-18h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌转 速调整为800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到lg/L以下时，采用连续补料的 方式补充实施例9制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基； 补料速度为〇.51111/1]1；[11，当溶氧水平降至10%以下时，增加发酵罐的压力至0.0210^ ;当发酵 液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过80h发酵，核黄素产量达到10.73g/L。
[0083] 实施例13
[0084] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
[0085] (1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划 线，37°C培养15h，使菌株复壮；
[0086] (2)种子液的培养:将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，35°C，200rpm 培养15h，然后将所得菌液按照体积比为5%的接种量接种到实施例7制备的一种用于高产 核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，35°C，200rpm培养15h，得到种子液；
[0087] (3)发酵罐发酵:将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5%的比例接种到装有 2.5L实施例7制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中， 加入氯霉素，使浓度为20ug/L，在36°C，pH=6.8，0-20h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌 转速调整为800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料 的方式补充实施例10制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养 基;补料速度为〇.31111/1]1；[11，当溶氧水平降至10%以下时，增加发酵罐的压力至0.0610^ ;当 发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过83h发酵，核黄素产量达到10.47g/L。发 酵结果见图4。
【主权项】
1. 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02的构建方法，其特征是包括如下步骤： (1) 获得rib-int段： 以SEQIDNo.4所示rib-F和以SEQIDNo.5所示rib-R为引物，以p20C_EC10为模板，通 过PCR的方法，得到以SEQIDNo.l所示rib-int片段； (2) 构建pLR01质粒： 以SEQIDNo·6所示Cat-F和以SEQIDNo·7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过CEPC 组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSClOl复制子组装成质粒pRB01;将步骤 (1)获得的rib-int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB01质粒上面，得到质粒命名为pLR01; (3) 构建EC-rib01菌株： 将步骤(2)获得的pLR01质粒转入大肠杆菌E.coliMG1655,得到菌株EC-Rib01; (4) 构建EC-Rib02菌株： 敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中 的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib02。2. 权利要求1的方法构建的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02。3. -种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02的发酵培养基，其特征是以每1L 计含有：葡萄糖5_30g，酵母抽提物l-15g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-lg，磷酸氢二钠1-1〇区，磷酸二氢钾1-1(^，尿素1-1(^，柠檬酸铁胺1〇-1〇〇11^，氯化钙1〇-10〇11^，硫酸锌0.01-〇·lmg，氯化猛0.01-0 ·lmg，硼酸0.01-0 ·lmg，氯化钴0.01-0 ·lmg，硫酸铜0.01-0 ·lmg，氯化 镍0.01-0.lmg，钼酸钠0.01-0.lmg，余量为水。4. 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02的补料培养基，其特征是以每1L 计含有：葡萄糖500_800g，酵母抽提物5-20g，硫酸铵l-10g，硫酸镁0 .l-5g，磷酸氢二钠2-5g，磷酸二氢钾2-15g，柠檬酸铁胺10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0 .lmg，氯化锰 0.01-0.lmg，硼酸0.01-0 ·lmg，氯化钴0.01-0 ·lmg，硫酸铜0.01-0 ·lmg，氯化镍0.01-0 ·lmg， 钼酸钠0.01-0.lmg，余量为水。5. -种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02的发酵方法，其特征是包括如下述步 骤： (1) 活化菌株:将权利要求2的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02在LB固体培养 基中划线，37°C培养10_20h，使菌株复壮； (2) 种子液的培养：将步骤（1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32-37°C，180-240rpm培养10-20h，然后将所得菌液按照体积比为1%-10%的接种量接种到权利要求3的 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，32-37°C，180-240rpm培养10-20h，得到种子液； (3) 发酵罐发酵:将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为的比例接种到装有 2-3L权利要求3的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加 入氯霉素，使浓度为5_40ug/L，在35-37°C，pH=6.5-7.3，搅拌转速300-800rpm的条件下发 酵，当培养基中葡萄糖浓度降到l-2g/L以下时，采用连续补料的方式补充权利要求4中的一 种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02的补料培养基；补料速度为0.1-0.5ml/
【专利摘要】本发明公开了一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法，构建方法为：(1)获得rib‐int段：(2)构建pLR？01质粒：(3)构建EC-rib？01菌株：(4)构建EC-Rib？02菌株：敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib？01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib？02。本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib？02核黄素产量达到10.47g/L以上，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量；本发明的EC-Rib？02菌株的生产周期为60-80h，比现有常用的核黄素工程菌株生产周期短，节省能源。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/21, C12P25/00
【公开号】CN105483071
【申请号】CN201511014766
【发明人】陈涛, 刘双, 康培, 王智文, 赵学明
【申请人】天津大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月29日