一种解脲芽孢杆菌及其生产高温过氧化氢酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一株解脲芽孢杆菌及其生产高温过氧化氢酶的方法。属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用与工业、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留物对生产工艺和身体健康有很大影响。过氧化氢酶可以特异性的将过氧化氢分解为无毒的水和氧气，是一种高效环保的过氧化氢去除方法。过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧微生物中，最初过氧化氢酶是从猪、牛等动物肝脏中提取纯化的，但该方法受限于原料、成本和季节等因素，且工艺复杂，易污染，酶的稳定性也较差。相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、活性高、酶学性质丰富、成本低廉等诸多优点。因工业上过氧化氢酶的作用环境多为高温，碱性等恶劣条件，因此筛选耐高温过氧化氢酶菌株对纺织印染等工业具有重要意义目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品，国内有一些文献及专利报道过氧化氢酶产酶菌株，但对耐热过氧化氢酶的研究及报道较少，其中多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力单位，仅江南大学陈坚教授和浙江大学谢雪凤文献中报道菌株酶产量达到3000 U/mL和2500 U/mL左右。本发明人发现一株产高温过氧化氢酶的菌株，通过液体发酵得到高酶活的过氧化氢酶酶液，该酶液可以高效分解过氧化氢。基于以上发现提出了本发明。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株新型高温过氧化氢酶高产菌株，和以酵母粉为氮源，牛肉膏为碳源发酵生产过氧化氢酶的工艺。所产过氧化氢酶制剂活性高，生产成本低廉，热稳定性好，适于纺织、造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除。
[0004]本发明的技术方案:
所述解脈芽抱杆菌(1^6让&(3；111118 1:1161'1]108口11&61'；[(3118)1^1'-2，该菌种已于2015年12月9日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2015733。
[0005]1、菌株的筛选及鉴定
(1)筛选:挑取从堆肥中分离纯化的细菌纯培养于前述液体种子培养基中震荡培养，取100微升发酵液加入100微升过氧化氢，有大量气泡产生的菌株为产酶菌株。
[0006](2)鉴定:对该菌株16S rRNA进行PCR扩增与测序，NCBI数据库比对显示该菌为解脲芽孢杆菌。
[0007](3)菌株特征:菌落呈扁平的圆形，周围乳白色，中间透明，边缘光滑，易于挑起。光镜下菌体为杆状。
[0008](4)过氧化氢酶活性测性方法:发酵液超声破碎直至澄清，用pH 7.0的roS缓冲液稀释适当倍数后备用。过氧化氢酶酶活测定方法为:2.9 ml反应液(pH 7.0,0.2 M PBS,20mM H2O2)迅速加入0.1 ml酶液中，在240 nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H2O2的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H2O2所用的酶量为1 U。
[0009]2、应用菌株KAT-2发酵生产过氧化氢酶。工艺如下:
(1)种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.种子液制备方法:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养12 h，转速为180 r/min。
[0010](2)发酵产酶:
产酶培养基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH为7.0。
[0011]发酵条件:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为40?55°C，转速为180 r/min，发酵时间为12-28 h，发酵液超声破碎即为过氧化氢酶酶液。应用上述方法发酵获得的酶液活力达到41426 U/mlo
[0012]本发明的有益效果:本发明首先提供了一株高产过氧化氢酶菌株，液体摇瓶培养酶活达41426 U/ml以上。该菌生长速度快，发酵时间短;培养基成分简单，以酵母粉为氮源，牛肉膏为碳源的培养基可以极大促进该菌株产酶，发酵过程无需过氧化氢或乙醇等诱导，工艺简单，成本低廉，该酶温度稳定性好，其最适反应温度为55 °C，在60 °C条件下保温90min仍能保持60%以上的活性。应用该菌株及配套工艺制备的过氧化氢酶可以应用于食品加工和造纸纺织等工业，因此本发明提供的菌种及工艺具有广泛的应用前景和明显的经济效益。
【具体实施方式】
[0013]应用菌株KAT-2发酵生产过氧化氢酶。工艺如下:
(1)种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.种子液制备方法:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养12 h，转速为180 r/min。
[0014](2)发酵产酶:
产酶培养基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH为7.0。
[0015]发酵条件:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为40?55°C，转速为180 r/min，发酵时间为12?28 h，发酵液超声破碎即为过氧化氢酶酶液。
[0016]实施例1:产酶菌株KAT-2的筛选及鉴定
挑取一环各菌株纯培养分别转接于含有50 ml前述液体种子培养基的三角瓶中，分别取一定量发酵液加入等体积过氧化氢观察产气泡情况。有气泡产生者为过氧化氢酶产酶菌株，选择产气泡最剧烈的菌株KAT-2作为过氧化氢酶生产用菌。将菌株KAT-2的发酵液冰浴超声破碎直至澄清，破碎条件为300 W，破碎2 s停顿3 s，将破碎液用roS缓冲液稀释20倍测量酶活。过氧化氢酶活力测定方法为:2.9 ml反应液(02 M PBS pH 7.0,20 mM H2O2)迅速加入0.lml酶液中，在240nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H202的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H202所用的酶量为1U。测得此时过氧化氢酶活性为1239 U/ml。取3 ml菌液用细菌基因组提取试剂盒提取该菌基因组，用细菌16S rDNA通用引物(27F和1492R)PCR扩增该菌的16S rDNA，扩增程序为94 °C变性1min，55 °C退火1 min，72 °C延伸2 min，扩增循环数为35个循环。PCR扩增产物送生物公司测序，序列如SEQ ID N0.1所示，在NCBI进行序列比对后确认该菌为解脲芽孢杆菌。
[0017]实施例2:菌株发酵生产过氧化氢酶
从斜面上挑取一环KAT-2纯培养于盛有50 ml种子液体培养基的250 ml三角瓶中，55°C摇床上培养12 h，摇床转速为180 r/min。以2%的接种量转接至液体发酵培养基，250ml三角瓶的装液量为50 ml产酶发酵培养基，培养条件为55 °C，摇床转速180 r/min，培养15 h。取出发酵液冰浴超声破碎直至澄清，破碎条件为300 W，破碎2 s停顿3 s。所获澄清液体即为过氧化氢酶液，此时酶液活性达23147U/ml。
[0018]种子培养基为:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.产酶培养基:酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0。
[0019]实施例3 种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.种子液制备方法:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养12 h，转速为180 r/min。
[0020]发酵产酶:
产酶培养基:酵母粉15 g/L，牛肉膏25g/L，CaCl2 1 g/L，pH为7.0。
[0021]发酵条件:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为50°C，转速为180 r/min，发酵时间为15 h。
[0022]该实施例酶产量达24571 U/ml。
[0023]实施例4:牛肉膏为氮源发酵产酶种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.种子液制备方法:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养12 h，转速为180 r/min。
[0024]发酵产酶:
产酶培养基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0。
[0025]发酵条件:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为40°C，转速为180 r/min，发酵时间为15 h。
[0026]牛肉膏为30 g/L时产酶量达23865 U/ml。
[0027]实施例5:氯化钙为无机盐发酵产酶种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.种子液制备方法:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养12 h，转速为180 r/min。
[0028]发酵产酶:
产酶培养基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，CaCl2 1 g/L，pH为7.0。
[0029]发酵条件:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为40°C，转速为180 r/min，发酵时间为15 h。
[0030]该实施例产酶量达27780 U/ml。
[0031 ] 实施例6
以15 g/L酵母粉，30g/L牛肉膏，1 g/L NaCl，pH为7.0的培养基发酵产酶。以实施例2中的发酵条件和方法，当摇瓶发酵时间为16h时酶活达26752 U/ml，发酵28 h后酶活达到41426 U/mlo
[0032]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一株产过氧化氢酶的解脲芽孢杆菌，其特征在于:所述菌为解脲芽孢杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)KAT_2，该菌种已于2015年12月9日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2015733。2.用权利要求1所述解脲芽孢杆菌发酵生产过氧化氢酶的方法，其特征在于:用上述菌株为出发菌株，经种子液培养和以酵母粉为氮源、牛肉膏为碳源发酵生产过氧化氢酶。3.根据权利要求2所述的解脲芽孢杆菌发酵生产过氧化氢酶的方法，其特征在于:具体工艺为: (1)种子液培养: 种子液培养基:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0; 种子液制备:从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55 °C培养.12 h，转速为 180 r/min； (2)发酵产酶: 产酶培养基:酵母粉5?30g/L，牛肉膏10~35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH为7.0; 发酵产酶:将种子液以2%接种量接种液体发酵培养基，发酵温度为40?55 °C，转速为.180 r/min，发酵时间为12?30 h，最终获得过氧化氢酶液。
【专利摘要】一株解脲芽孢杆菌及及其生产高温过氧化氢酶的方法，属于生物工程领域。本发明提供了一株解脲芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015733。该菌以酵母粉为氮源，牛肉膏为碳源促进产酶，经液体发酵可得到高产量的过氧化氢酶，酶活高达41426？U/ml。本发明过氧化氢酶制剂制备简单、酶活性高，造价低廉，且温度稳定性好，在纺织、造纸等领域有良好的应用前景。CCTCC NO：M 201573320151209
【IPC分类】C12N9/08, C12R1/01, C12N1/20
【公开号】CN105483061
【申请号】CN201610034815
【发明人】林新坚, 陈济琛, 田燕丹, 贾宪波, 郑力
【申请人】福建省农业科学院土壤肥料研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月20日