目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量。
[0036]本发明的用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基和用于高产核黄素大 肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基利于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02核 黄素的发酵，提高了核黄素的产量。
[0037]本发明的高产核黄素大肠杆菌EC-Rib 02菌株的生产周期为60_80h，比现有常用 的核黄素工程菌株(枯草芽孢杆菌，酵母等生产周期普遍在l〇〇h以上)生产周期短，节省能 源。
【附图说明】
[0038] 图l为用SEQIDNo.3所示pLR01质粒的示意图。
[0039] 图2为用SEQ ID No.2所示pRB 01载体的示意图。
[0040]图3为pfkA基因敲除后，琼脂糖凝胶电泳示意图。
[00411图4为生物反应器发酵EC-rib 02菌株，核黄素产量示意图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员 能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
[0043] 本发明所用到的原始菌株E.coli MG1655购自CGSC(Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale·edu/)〇
[0044] 原始质粒pTKRed和pCas9和pTKS / CS来源为Addgene (https : / / www.addgene.org/)。
[0045] 原始质粒p20C_EC10来源于如下文章：Lin，Z·，et al ·，Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of riboflavin.Microb Cell Fact,2014.13 (l):p,104.
[0046] 所用限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等分子生物学试剂购买自thermo公 司（http://www.thermoscientificbio·com/fermentas)〇
[0047] 所用发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司(http: //www.blbio. com/)。
[0048]所用PCR 仪和电转仪购自 Bio-Rad (http://www. bio-rad, com/)。
[0049]所用其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司（http : / / www. sangon. com/)贝勾买。
[0050] LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂0.8%-2%)余 量是水。
[0051 ] LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)余量是水。
[0052] 实施例1
[0053] 以SEQIDNo·6所示Cat-F引物和以SEQIDNo·7所示Cat-R为引物，以pCas9为模 板，通过PCR扩增氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因，然后通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自 于pTKRed质粒上的pSClOl复制子组装成全新的质粒pRB 01，如图2所示。
[0054] 实施例2
[0055] 以SEQ ID Νο·4所示rib-F引物和以SEQ ID Νο·5所示rib-R为引物，以p20C_EC10 为模板，通过PCR扩增的方法得到以SEQ ID No.l所示的片段rib-int。以Seal和Hindm两种 限制性内切酶切割pRB 01质粒，酶切产物经过纯化，和rib-int通过T4DNA连接酶，连接成新 的质粒pLR 01，如图1所示。
[0056] 实施例3
[0057] 挑取E. coli MG1655至LB液体培养基，37°C，200rpm培养，当菌体浓度介于0.4-0.6 (以600nm吸光值表示)之间时，做成感受态。然后通过电转化，将pLR 01质粒导入到E. co 1 i MG1655,通过氯霉素筛选出阳性转化子，得到菌株命名为EC-rib 01.
[0058] 实施例4
[0059] 以pfkA 1F(SEQ ID Νο·8)和pfkA 1R(SEQ ID Νο·9)为引物，以MG1655基因组为模 板，通过PCR反应，得到pfkA-U(SEQIDNo·16)。以pfkA2F(SEQIDNo·10)和pfkA2R(SEQ ID No.ll)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到pfkA-tet-U(SEQ ID Νο·17)。以 pfkA3F(SEQIDNo·12)和pfkA3R(SEQIDNo·13)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反 应，得到pfkA-tet-L(SEQIDNo·18)。以pfkA4F(SEQIDNo·14)和pfkA4R(SEQID No.l5)为引物，以MG1655基因组为模板，通过PCR反应，得到pfkA-L(SEQIDNo.l9)。然后将 上诉PCR产物pfkA-U(SEQ ID No.l6)，pfkA-tet-U(SEQ ID No.l7)，pfkA-tet-L(SEQ ID No.l8)，pfkA-L(SEQIDNo.l9)通过融合PCR的方法，融合成一个片段pfkA-tet(SEQID No.20)。
[0060] 将pTKRed质粒通过电转化导入到大肠杆菌E.coli MG1655,然后制作成感受态，利 用电转化的方法，将片段pfkA-tet(SEQIDNO.20)导入，利用四环素筛选出阳性克隆，并进 行菌落PCR进行验证。验证正确的菌株通过诱导归巢核酸内切酶I-sce I的表达，将四环素抗 性删除，并用菌落PCR验证，PCR结果用琼脂糖凝胶电泳来显示，核酸大小如图3所示。应用同 样的方法，继续敲除eda基因和edd基因，最终获得的菌株基因型为E.coli MG1655, ApfkA， Δ edd，Δ eda命名为EC-Rib 02。
[0061 ] 实施例5
[0062] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有： 葡萄糖5g，酵母抽提物lg，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钠 lg，磷酸二氢钾lg，尿素 1 g，梓檬酸铁胺l〇mg，氯化|丐10mg，硫酸锌0 · 0 lmg，氯化猛0 · 0 lmg，硼酸0 · 0 lmg，氯化钴 0.0 lmg，硫酸铜0.0 lmg，氯化镍0.0 lmg，钼酸钠0.0 lmg，余量为水。
[0063] 实施例6
[0064] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有： 葡萄糖30g，酵母抽提物15g，硫酸铵5g，硫酸镁lg，磷酸氢二钠10g，磷酸二氢钾10g，尿素 l〇g，梓檬酸铁胺l〇〇mg，氯化|丐100mg，硫酸锌0 . lmg，氯化猛0 . lmg，硼酸0 . lmg，氯化钴 0. lmg，硫酸铜0. lmg，氯化镍0. lmg，钼酸钠0. lmg，余量为水。
[0065] 实施例7
[0066] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有： 葡萄糖10g，酵母抽提物5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾2.5g，尿素 3g，梓檬酸铁胺20mg，氯化IMOmg，硫酸锌0 · 05mg，氯化猛0 · 05mg，硼酸0 · 04mg，氯化钴 0.05mg，硫酸铜0.03mg，氯化镍0.04mg，钼酸钠0.03mg，余量为水。
[0067] 实施例8
[0068] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有： 葡萄糖500g，酵母抽提物5g，硫酸铵lg，硫酸镁O.lg，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸 铁胺10mg，氯化，硫酸锌0 · Olmg，氯化猛0 · Olmg，硼酸0 · Olmg，氯化钴0 · Olmg，硫酸铜 0.0 lmg，氯化镍0.0 lmg，钼酸钠0.0 lmg，余量为水。
[0069] 实施例9
[0070] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有： 葡萄糖800g，酵母抽提物20g，硫酸铵10g，硫酸镁5g，磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钾15g，柠檬酸 铁胺100mg，氯化^lOOmg，硫酸锌0. lmg，氯化猛0. lmg，硼酸0. lmg，氯化钴0. lmg，硫酸铜 0. lmg，氯化镍0. lmg，钼酸钠0. lmg，余量为水。
[0071] 实施例10
[0072] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有： 葡萄糖700g，酵母抽提物10g，硫酸铵5g，硫酸镁3g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾8g，柠檬酸铁 胺40mg，氯化^SOmg，硫酸锌0 · 06mg，氯化猛0 · 07mg，硼酸0 · 05mg，氯化钴0 · 07mg，硫酸铜 0.03mg，氯化镍0.03mg，钼酸钠0.05mg，余量为水。
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