为：蛋白腺15g/ 以玉米浆15g/l，葡萄糖15g/l，黄豆粉4g/l，氯化钢5g/l，憐酸二氨钟2g/l，pH7.2， 摇床转速为280r/min，29°C培养7化后种入发酵培养基，摇床转速为280r/min，29°C培养 4化后，补入维生素化，使得维生素化在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止 发酵，测定发酵效价，与出发菌株相比，自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布情况见表3,挑 选出发酵效价较高的菌株20支进行复筛。
[0040] 表3自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布
从表3可知，采用该模型进行筛选，获得自养假诺卡氏菌正突变的比例较高，达到 33. 3% 复筛：将挑选出的效价较高的20支菌株接种到种子培养基，摇床转速为280r/min， 29°C培养7化后种入发酵培养基中，摇床转速为280r/min，29°C培养4化后，补入维生素 化，使得维生素化在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定发酵效 价，挑选出效价最高的菌株1支，保存，备用。
[0041] 发酵培养基试验：将效价最高的菌株进行发酵培养基试验。按如下配方配制种子 培养基100mL:蛋白腺15g/L玉米浆15g/L葡萄糖15g/L黄豆粉4g/L氯化钢5g/ L憐酸二氨钟2g/L，pH7. 2。将种子培养基装入3个250mlS角瓶中，每瓶30ml。灭菌后， 从斜面菌株挖块接入种子培养基中，29°C培养72h，将种子液分别接入含有不同浓度聚山梨 醋-80的发酵培养基中进行发酵试验，接种量为10% (V/V)。
[0042] 按照如下配方配制发酵培养基：蛋白腺15g/l，玉米浆15g/l，葡萄糖15旨/1，黄 豆粉4g/l，氯化钢5g/l，憐酸二氨钟2g/l，倍他环糊精3邑/1，聚山梨醋-80 1.0、2.0、 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0g/L，抑7. 2。摇床转速为 280r/min，29°C培养 4她后，补 入维生素化，使得维生素化在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测 定发酵效价，所对应的测定结果见表4。
[0043]HPLC方法：色谱柱为Kromasil正相硅胶柱（250X4. 6mmi.d，5um)，流动相为异丙 醇-正己烧（1 : 9)，流速1.5ml/min，柱溫为40°C，检测波长265皿。
[0044] 对含有不同聚山梨醋-80浓度的培养基进行综合比较，筛选出最佳发酵配方。
[0045] 表4实验测定结果
从表4中可W看出，配方中聚山梨醋-80的浓度在3-8g/L时，25径基维生素化的效价 较高，7g/L时25径基维生素化效价最高。
【主权项】
1. 筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法，包括如下步骤： (1) 初筛：将诱变处理的自养假诺卡氏菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有聚山梨 酯-80含量为15-20g/L的分离培养基做成的若干平板上，在29°C培养箱中培养144-192h， 从若干平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面培养基制成的若干斜面上，在29°C 培养箱中培养168h，斜面成熟后挖块种入三角瓶中的种子培养基中，同时将用于诱变处理 的出发菌株斜面也挖块种入三角瓶中的种子培养基中，作为对照，摇床转速为280r/min， 29°C培养72h后，种入发酵培养基，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29°C培养 48h后，补入维生素D3，使得维生素％在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止 发酵，测定两种菌的发酵效价，与出发菌株相比，选出自养假诺卡氏菌突变株相对发酵效价 较高的菌株若干支进行复筛， (2) 复筛：将发酵效价较高的若干菌株接种于若干三角瓶中的种子培养基中，将三角瓶 置于摇床上，摇床转速为280r/min，29°C培养72h后接种于若干个三角瓶中的发酵培养 基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29°C培养48h后，补入维生素D3，使得 维生素％在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定若干个三角瓶中 的发酵培养基发酵效价，挑选出一个三角瓶中发酵效价最高的一支菌株为最终产品。 2. 25羟基维生素D3高产菌株生产25羟基维生素D3的发酵培养基中聚山梨酯-80含量 的筛选方法，其特征在于将种子培养基装入3个250ml三角瓶中，每瓶30ml，灭菌后，从25 羟基维生素D3高产菌株的斜面挖块接入3个三角瓶种子培养基中，将三角瓶置于摇床上， 摇床转速为280r/min，29°C培养72h，将3个三角瓶中的种子液分别移入含有不同含量聚 山梨酯-80的若干个三角瓶中的发酵培养基中进行发酵试验，将三角瓶置于摇床上，摇床 转速为280r/min，29°C培养48h后，补入维生素D3，使得维生素03在发酵液中的终浓度为 500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，确定一个三角瓶中的发酵效价最高的 发酵培养基，其聚山梨酯-80的含量为最佳值。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（1)中所述分离培养基成分和 含量为：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米浆3 g/L，氯化钠4 g/L，琼脂15 g/L，聚山梨 酯-80 15 g/L，ρΗ7·0。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（1)中所述斜面培养基成分和 含量为：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米浆3 g/L，氯化钠4 g/L，琼脂15 g/L，ρΗ7.0。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的种子培养基成分和含量为：蛋 白胨15 g/L，玉米浆15 g/L，葡萄糖15 g/L，黄豆粉4 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/ L，ρΗ7· 2〇6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含聚山梨酯-80量不同的发酵 培养基，聚山梨酯-80含量分别为1-9 g/L中之一，其他成分和含量均为：蛋白胨15 g/L， 玉米浆15 g/L，葡萄糖15 g/L，黄豆粉4 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，倍他环糊精 3 g/L, pH7. 2〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中所述诱变处理为将出发菌株自 养假诺卡氏菌成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤 收集单孢子悬液约l〇ml于无菌培养皿中，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，紫外功率 30W，灯距25cm照射30s〇8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中所述诱变处理为将出发菌株 自养假诺卡氏菌成熟斜面用pH7. 0的磷酸钠缓冲液成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散 30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，加入烷 化剂甲基磺酸乙酯EMS，终浓度为3%，振荡处理30min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡 20min〇9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于发酵培养基中聚山梨酯-80的含量为3 -8 g/L〇
【专利摘要】本发明为筛选25羟基维生素D3高产菌株和发酵培养基中聚山梨酯-80含量的方法，解决诱变育种正突变率低，筛选工作量大，费时费力，从而不易筛选到高产菌株的问题。将能够改变25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌细胞膜通透性的物质聚山梨酯-80加入到分离培养基中，观察菌株对聚山梨酯-80的耐受情况，确定其最低耐受剂量，选用出发菌株在高浓度下不能生长的聚山梨酯-80的量，作为筛选模型。经过诱变后的自养假诺卡氏菌菌种，用所建立的筛选模型进行筛选。
【IPC分类】C12N15/01, C12R1/01, C12P7/02
【公开号】CN105296464
【申请号】CN201510825931
【发明人】曾志刚, 梁彦明
【申请人】曾志刚, 梁彦明
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月25日