一种pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱簇酶（GAD)的抑稳定性向中性范围偏移 的突变体，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 丫-氨基下酸（GABA)是广泛存在动物、植物和微生物中的一种功能性非蛋白质天 然氨基酸，是脊椎动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，具有镇静、抗惊厥、 增进食欲，促进消化、抗氧化等功能，对动物的抗热应激能力、繁殖性能、激素分泌、禍体品 质有显著影响。随着对GABA研究的逐渐深入，其功能已经在各个领域得到了广泛的应用， 尤其在食品及畜牧业中，对富含GABA的食品、饲料的开发及在动物生产中的应用已成为国 内外研究的热点之一，因此，对GABA的研究具有较广阔的前景。在哺乳动物体内GABA只存 在于神经组织中，由谷氨酸脱簇酶（Glutamatedecarbo巧Iase,GAD)转化谷氨酸而成。研 究发现，乳酸菌、大肠杆菌W及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌种。 阳00引 目前，制备GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法，生物合成法又包括 植物富集法和微生物发酵法。化学合成法常用的有两种：一种是W邻苯二甲酯亚氨钟和 丫-氯下氯在180°C反应，产物与浓硫酸回流水解，再经结晶提纯而得；另外一种是W化咯 烧酬作为原料，经碳酸氨锭、氨氧化巧水解制得。最近，杨东元等采用一种新的方法，是W 丫-下内醋为起始原料，经氯化醋化反应生成4-氯下酸甲醋，再经氨解和皂化反应制得 GABA，总收率达57. 9%。运用化学合成法生产GABA虽然反应迅速，产品纯度高，但是在生产 过程使用了危险溶剂，脱除产品中的有毒成分比较复杂且反应条件苛刻、能耗大、成本大， 其主要被应用于化工领域，在食品和医药领域中应用仍存在一定的安全隐患。
[0004] 大肠杆菌谷氨酸脱簇酶能催化k谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳。植物富集主 要是转化途径谷氨酸经谷氨酸脱簇酶催化转化合成GABA，是植物组织对外界条件应激代 谢所生成，虽然天然产物提取法在操作上简单易行，但由于植物富集的GABA含量较低且分 离提取比较困难，所W不适合规模化生产。而微生物发酵法中谷氨酸脱簇酶（glutamate decar-bo巧lase，GAD)是特异性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已经被发 现存在于多种细菌和真核微生物。大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用 于GABA规模化生产。谷氨酸脱簇酶能催化k谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳，为提高生产 量研究者渐渐开始将研究重点转向GABA限速酶一-谷氨酸脱簇酶（GAD)。通过克隆谷氨酸 脱簇酶基因并导入其它菌株来表达，W运种方式来提高发酵产GABA的能力。使GABA的产 量最终可达到2. 41g/l。而大肠杆菌谷氨酸脱簇酶（GAD)的最适抑过低，为3. 8-4. 5,酶分 子在抑高于6. 0时易发生解聚而失活，运限制了它的工业应用。由于工业生产GABA所用 底物为k谷氨酸钢，该物质呈中性偏碱，为了达到k谷氨酸脱簇酶最适抑条件，生产时必 须向反应体系中加入大量的盐酸或硫酸，运一方面造成了额外的原料成本和后续的废水处 理成本，另一方面，酸性反应条件对于生产设备的腐蚀性大大增加，加速设备老化，降低了 生产设备的使用寿命，也增加了额外的成本。因此，在保持谷氨酸脱簇酶活性的基础上，提 高其抑适应性成为工业生产的迫切需要。
[0005] 因此，本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱簇酶（GAD)的抑稳定性向中性范围 偏移的突变体，将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱簇酶的谷氨酸脱簇酶编码基因进行 定点突变，其特征在于所述定点突变的基因工程谷氨酸脱簇酶氨基酸序列相对于天然的谷 氨酸脱簇酶氨基酸序列的第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。本发明所述 的谷氨酸脱簇酶突变体分别在P册.5时的相对酶活由原来的38%提高至72%或84%，在中 性抑范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的谷氨酸脱簇酶突变体更加适合工业化 的生产需求，为高效合成丫-氨基下酸奠定了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的问题是提供一种抑稳定性向中性范围偏移的谷氨酸脱簇酶突变 体（GAD)。是将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱簇酶第91位的谷氨酸E进行定点突 变，分别突变为精氨酸R或丙氨酸A，将含突变后基因的重组质粒祀T28a-lpgad转化进入 大肠杆菌中进行表达，得到谷氨酸脱簇酶分别在P册.5时的相对酶活由原来的38%提高至 72%或84%的突变体。 阳007] 编码所述突变后谷氨酸脱簇酶的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 所述突变是将第91位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。
[0009] 获得所述突变体的方法，是W质粒祀T28a-lpgad为模版，设计引物，通过PCR进行 定点突变得到含有突变后基因的重组质粒祀T28a-lpga祀R，将祀T28a-lpga祀A转化大肠 杆菌中表达。
[0010] 获得所述突变体的方法，具体是：
[0011] (1)突变表达载体的构建
[0012] 通过分析谷氨酸脱簇酶的3D结构，确定91位的谷氨酸E为目的突变为点，设计突 变实验，将该位点的谷氨酸分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。
[0013]W质粒祀T28a-lpga祀为模板，根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物， 通过重叠延伸PCR进行扩增，得到突变基因；之后分别与祀T28a和PXMJ19载体连接分别获 得的重组质粒祀T28a-lpga祀X和pXMJ19-lpga祀X狂为突变后的氨基酸）；然后将此重组 质粒分别转化到E.coli化21和谷氨酸棒杆菌C.glutamicuml3032菌株获得重组菌株，提 取质粒进行测序。
[0014] (2)含突变体的基因工程菌的获得
[0015] 制备E.coliBL2UDE3)感受态，将祀T28a-lpga祀X的连接液加入120yL的 E.COliBL2UDE3)感受态细胞中，筛选转化子，并提取质粒测序验证。
[0016] 制备C.glutami州ml3032感受态，将pXMJ19-lpga祀X的连接液加入120yL的 C.glutamicuml3032感受态细胞中，筛选转化子，并提取质粒测序验证。
[0017] (3)谷氨酸脱簇酶活力测定
[0018] 酶活测定方法：酶促反应总体积为500yL取490yLO. 2M的不同抑(3. 0~7. 0) 的缓冲液，其中含有0.OlmMPLP、IOOmMk谷氨酸钢，加入10yL酶液，在反应之前分别把 缓冲液和酶液在40°C下预热5min，然后混匀，在40°C下反应30min，最后迅速煮沸终止反 应，离屯、，用5%S氯乙酸灯CA)稀释5倍，在4°C冰箱沉淀蛋白化左右，然后用HPLC检测。
[0019] (4)重组菌发酵生产突变GABA
[0020] 将斜面保藏的菌种培养1化进行活化，再W5%的接种量接入500ml摇瓶（装液 量为100mL)种子培养基中培养24h得到种子液，按10%的接种量将培养好的种子液接入 化全自动发酵罐，先于37°C、250r/min培养至0D600为0. 6,再向其中添加乳糖至终浓度 为IgA,同时在线控制P册.8流加葡萄糖，30°C，诱导发酵14h至0D600为13. 6。将培养 好的菌体进行离屯、收集，双蒸水洗涂=次，用乙酸-乙酸钢缓冲液悬浮菌体，在优化后的转 化条件下，W50g/L的投料量进行分批投料，，转化2地，反应结束后转化液离屯、取上清，加 入15%的=氯乙酸终止反应，取Im