l进行适当稀释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物 GABA的浓度。W重组大肠杆菌合成的谷氨酸脱簇酶进行转化时，GABA产量达到260g/l，产 率为99.6% 重组谷氨酸棒杆菌合成的谷氨酸脱簇酶进行转化时，GABA产量达到116g/ L产率为99. 5%。
[0021] 重组菌摇瓶种子培养基（g/L):葡萄糖1.0,蛋白腺3.0,玉米浆1.5,化Cl0.3， K2HPO4O. 1，M拆〇47&0 0. 05。在抑 6. 5 ~7. 0、12rC下灭菌lOmin。 W22] 重组菌发酵培养基（g/L):葡萄糖5. 0,蛋白腺10,玉米浆7. 5,化Cl0. 5，K2HPO4O. 1,MgS〇47H2〇 0. 05, 1. 2X10pH6. 5 ~ 7. 0U21°CT 10min〇
[0023] 本发明通过定点突变改造谷氨酸脱簇酶基因，将谷氨酸脱簇酶第91位由谷氨酸E 分别突变为精氨酸R或丙氨酸A，所得的谷氨酸脱簇酶突变体分别在P册.5时的相对酶活由 原来的38%提高至72%或84%，在中性抑范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的 谷氨酸脱簇酶突变体更加适合工业化的生产需求，为高效合成丫-氨基下酸奠定了基础。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1突变表达质粒的构建及重组菌株的获得 阳O巧]根据NCBI中植物乳杆菌植物乳杆菌GB01-21全基因组核酸序列325437化P中的Ipgad基因序列，设计谷氨酸脱簇酶编码基因的两头引物引物，再根据待突变的氨基酸位点 来设计PCR点突变中间引物：
[00%] 利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。
[0027] 用于定点突变的引物为：
[0034] 提取植物乳杆菌GB01-21染色体为模板
[0035]PCR反应条件：95°C预变性 5min，95°C变性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 120s, 30 个循环；72°C延伸5min，。将所得突变基因片段经胶回收后分别与祀T-2姑和PXMJ19连接， 分别获得重组质粒祀T28a-lpga祀X和pXMJ19-lpga祀X。
[0036] 制备E.coli BL2UDE3)感受态，将祀T28a-lpga祀X的连接液加入120yL的 E.COliBL2UDE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌。
[0037] 制备C.glutami州ml3032感受态，将pXMJ19-lpga祀X的连接液加入120yL的 C.glutamiCiiml3032感受态细胞中，获得重组谷氨酸棒杆菌。
[0038] 实施例2突变体谷氨酸脱簇酶的表达及Ni-NTA纯化
[0039] 取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素（终浓度为50yg/mL)的LB培养基中， 37°C振荡培养过夜，次日按1%接种量转接发酵培养基，37°C培养至OD约0. 6-0. 8,加人 IPTG至终浓度为0. 5mmol/l，16°C过夜诱导表达。IPTG诱导后的菌液经超声波破碎细胞，上 清液SDS-PAGE分析，检测到一条分子量约为53kDa的特异性条带，上清液测得比酶活。将过 夜诱导表达的菌液于1000化/min，4°C离屯、15min，收集菌体，用抑7. 4PBS缓冲液悬浮菌体， 超声波破碎细胞，然后经0. 45ym滤膜过滤，选用表达载体祀T-28a(+)中含有6 ?化S-化g 编码序列，过Ni-NTA纯化GAD，获得较纯的GAD酶蛋白。 W40] 实施例3野生酶和突变酶在不同抑下的稳定性的测定
[0041] 将上一步得到的纯酶液稀释至浓度为2. 5111邑/111以然后分别进行酶促反应。酶促反 应总体积为500yL，取490yLO. 2M的不同抑(3. 0~7. 0)的缓冲液，其中含有0.OlmMPLP、 IOOmM心谷氨酸钢，加入10yL酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40°C下预热5min， 然后混匀，在40°C下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离屯、，用5%S氯乙酸（TCA)稀释 5倍，在4°C冰箱沉淀蛋白化左右，然后用HPLC检测。
[0042] 结果显示谷氨酸脱簇酶突变体与野生型酶相比分别在P册.5时的相对酶活由原 来的38%提高至72%或84%，在中性抑范围内的酶活稳定性显著提高即有效抑作用范围 拓宽。因此能够更好的运用突变体酶，在抑5. 5~6. 5的条件下，催化GABA的生物合成。
[0043] 实施例4含突变体谷氨酸脱簇酶的重组菌转化k谷氨酸产GABA
[0044] 将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为IOmDLB培养基中，于旋转式摇床中 37°C、160r/min培养1化进行活化；再W5%的接种量接入500ml摇瓶（装液量为100mL) 种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液；按10%的接种量将培养好的种 子液接入化全自动发酵罐（装液量为化)，先于37°C、250r/min培养至0D600为0. 6,再 向其中添加乳糖至终浓度为IgA,同时在线控制P册.6流加葡萄糖，30°C，诱导发酵1化至 0D600为14。将培养好的菌体进行离屯、收集，双蒸水洗涂=次，用乙酸-乙酸钢缓冲液悬 浮菌体，W50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间 隔为每化投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，1化后，投料时间间隔 延长到4h，在转速25化/min、通气量Ivvm的条件下转化24h，之后转化液离屯、取上清，加入 15%的=氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后用氨基酸自动分析仪测得转化液中产物 GABA浓度。
【主权项】
1. 一种在中性pH范围内的酶活及pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于， 对植物乳杆菌GB01-21来源的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变得到；是将谷氨酸脱羧 酶氨基酸序列的第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。2. 权利要求1所述突变体编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2 所示。3. 含有权利要求2所述基因的质粒或细胞。4. 获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，是以质粒pET28a-lpgad为模版，设 计引物，通过PCR获得编码突变体的基因及质粒，以大肠杆菌为宿主表达谷氨酸脱羧酶突 变体。5. 权利要求1或4所述谷氨酸脱羧酶突变体基因或其编码的谷氨酸脱羧酶突变体在生 物合成GABA的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱羧酶(GAD)的pH稳定性向中性范围偏移的突变体，属于生物工程领域。将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变，主要将第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。谷氨酸脱羧酶突变体分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。以重组大肠杆菌合成的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，GABA产量达到260g/L,产率为99.6％；而以重组谷氨酸棒杆菌合成的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，GABA产量达到116g/L,产率为99.5％。本发明减少了发酵设备在酸性条件下的损耗，为高效合成γ-氨基丁酸奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/60, C12P13/00, C12N5/10, C12N9/88
【公开号】CN105296456
【申请号】CN201510819438
【发明人】饶志明, 徐美娟, 杨套伟, 张显
【申请人】江南大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月23日