通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生的制作方法
【专利说明】通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪 酸的脂质的产生
[00011 本发明申请是基于申请日为2001年1月26日、申请号为200910133079.4、名称为 "通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生"的发明专 利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及培养微生物和回收微生物脂质的新方法。具体地，本发明涉及生产微 生物多不饱和脂。
【背景技术】
[0003] 在真核微生物中生产多烯脂肪酸(含有2个或更多个不饱和碳碳键的脂肪酸)一般 认为需要分子氧的参与（即需氧条件）。这是因为据认为在所有非寄生性真核微生物的脂肪 酸中形成的顺式(cis)双键参与直接的氧依赖型去饱和反应(氧化微生物去饱和酶系统）。 其它已知需要分子氧的真核微生物脂质包括真菌留醇和植物留醇，羟基类胡萝卜素 (0叉7〇31'0丨611〇1(18)(即叶黄素），泛醌，和从任一种这类脂质制备的化合物（如次级代谢产 物)。
[0004] 已证实某些真核微生物(如藻类;真菌，包括酵母;和原生生物)在发酵罐中可以很 好地生产多烯脂肪酸。但是，极高密度培养(微生物的生物量大于l〇〇g/L，特别是商业规模 的)会降低多稀脂肪酸的含量，这样会降低多稀脂肪酸的生产力(productivity)。这可能部 分是由于几种因素，包括由于微生物的高浓度造成对氧的高需求，而难于维持发酵液中的 溶氧水平。保持较高溶氧水平的方法包括提高通气速率和/或采用纯氧替代空气通气和/或 提高发酵罐的搅拌速度。这些解决方法一般提高脂质生产的成本和发酵设备的资金成本， 而且会产生其它的问题。例如，在高细胞密度时增加通气容易在发酵罐中产生严重的起泡 问题，加强搅拌会由于发酵液中剪切力增加而导致微生物细胞破碎(这会导致脂质释放到 发酵液中，从而被氧化和/或被酶降解）。对于正处于氮受限或耗尽以诱导产生脂质从而细 胞壁较弱的细胞，细胞破碎问题更为突出。
[0005] 结果，当以极高细胞密度培养生产脂质的真核微生物时，它们的脂质通常都只含 有极少量的多稀脂肪酸。例如，以醇为碳源培养斯达氏油脂质酵母(Lipomyces starkeyi) 在140小时到153g/L的密度，产生的脂质浓度为83g/L。但是在浓度大于100g/L时酵母的多 烯脂肪酸含量平均只有总脂肪酸的4.2% (在细胞密度为20-30g/L时其含量从占总脂肪酸 的 11 · 5%开始减少）。Yamauchi等，J·Ferment · Technol ·，1983，61，275-280。这样产生的多 烯脂肪酸浓度只有约3.5g/L，平均多烯脂肪酸生产力只有约0.025g/L/hr。此外，在酵母脂 质中唯一报导的多烯脂肪酸是C18:2。
[0006] 已证实另一酵母，Rhodotorula glutinus，具有的平均脂质生产力约为0.49g/L/ hr，但其脂质中多烯脂肪酸含量也较低（占全部脂肪酸的15.8 %，14.7 % C18:2和1.2 % C18: 3)，导致在补料分批培养中多烯脂肪酸生产力只有约0.047g/L/hr，在连续培养中是 0.077g/L/hr〇
[0007]本发明人之一以前已证实破囊壶菌目（Thraustochytriales)的某些海洋微藻类 在发酵罐中是极好的多烯脂肪酸生产者，特别是在低盐，特别是极低氯化物水平培养时。其 它有人描述了Thraustochytrids在培养120小时，细胞密度为59 g//L时的平均多烯脂肪酸 (DHA，C22: 6n-3;和DHA，C22: 5n-6)生产力约为0 · 158g/L/hr。但是这样的生产力只能在约 50%的海水盐度下达到，这样的浓度会严重腐蚀传统的不锈钢发酵罐。
[0008] 生产含多烯脂肪酸的微生物脂质，特别是高度不饱和脂肪酸，如C18: 4n-3，C20 : 4n-6，C20: 5n3，C22: 5n-3，C22: 5n-6和C22: 6n-3，的费用一直较高，部分原因是含高水平多 烯脂肪酸的真核微生物培养密度的限制和在这样的高细胞浓度下的氧限制以及获到高生 产力所需的较高温度的限制。
[0009] 因此，需要高浓度培养微生物，并同时利于提高含多烯脂肪酸的脂质的产量。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了培养真核微生物的方法，所述微生物能产生至少约20%的生物量的 脂质，本发明还提供生产这样的脂质的方法。优选这些脂质包含一或多种多烯脂肪酸。此方 法包括向含有真核微生物的发酵培养基加入碳源，优选是非醇碳源，和限制性营养源。优选 地，所述碳源和营养源的添加速度足以提高发酵培养基的生物量密度到至少约l〇〇g/L。
[0011] 本发明的一方面，发酵条件包括生物量密度提高阶段和脂质生产阶段，其中所述 生物量密度提高阶段包括加入碳源和限制性营养源，所述脂质生产阶段包括添加碳源但不 加入限制性营养源，以形成诱导脂质产生的条件。
[0012] 本发明的另一方面，在脂质生产阶段的发酵培养基中的溶氧量低于在生物量密度 提高阶段的发酵培养基中的溶氧量。
[0013] 本发明的另一方面，微生物选自藻类，真菌(包括酵母），原生生物，细菌或其混合 物，其中所述微生物能产生多烯脂肪酸或其它一般被认为其合成需要氧的脂质。本发明特 别有用的微生物是能在发酵培养基中氧水平低于约3%的饱和度的情况下生产脂质的真核 微生物。
[0014] 本发明的另一方面，以补料分批培养方式培养微生物。
[0015] 本发明的另一方面还提供了在此发酵工艺的后半部分保持发酵培养基中氧水平 低于约3 %饱和度。
[0016] 本发明的另一方面提供了生产真核微生物脂质的方法，包括：
[0017] (a)在发酵培养基中培养真核微生物，以便将该发酵培养基的生物量密度提高到 至少约100g/L;
[0018] (b)提供足以使所述微生物生产所述脂质的发酵条件;和 [0019] (c)回收所述脂质，
[0020]其中所述脂质的多于15%是多不饱和脂。
[0021 ]本发明的另一方面提供了回收脂质的方法，包括 [0022] (d)除去所述发酵培养基中的水，得到干的微生物;和 [0023] (e)从所述干的微生物分离所述脂质。
[0024]优选地，所述除去水的步骤包括将所述发酵培养基不经预先离心而直接与转鼓式 干燥机接触。
[0025 ]本发明的另一方面提供了回收脂质的步骤，包括：
[0026] (d)处理发酵液以透化，溶解，或破裂微生物细胞;和
[0027] (e)在有或没有水溶性试剂帮助裂解脂质/水乳剂的情况下，通过重力分离，优选 离心，回收发酵液中的脂质。
[0028] 优选地，步骤(c)中是在发酵罐或类似容器中处理微生物细胞。
[0029] 本发明的另一方面提供了富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法。所述方法包括在 溶氧水平低于1 〇 %的生长培养基中发酵微生物。
[0030] 本发明的又一方面是生产产品和微生物的异养方法。该方法包括在生长培养基中 培养含有聚酮化合物合成酶基因的微生物并保持培养液中的溶氧水平低于1〇%。
[0031 ]具体地，本发明涉及如下各项：
[0032] 1.-种从真核微生物生产含有多烯脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生至少 占其生物量约20%的脂质，该方法包括向含有所述微生物的发酵培养基中以足以提高该发 酵培养基生物量密度到至少约l〇〇g/L的速率加入非醇碳源和限制性营养源。
[0033] 2.项1的方法，其中该方法包含一个生物量密度提高阶段和一个生产阶段，其中该 生物量密度提高阶段包括添加所述碳源和所述限制性营养源，该生产阶段包括添加所述碳 源，不加或很少加入所述限制性营养源以诱导产生营养源限制性条件，该条件可诱导产生 脂质。
[0034] 3.项2的方法，其中在该生产阶段发酵培养基中的溶氧量低于在该生物量密度提 高阶段的发酵培养基中溶氧量。
[0035] 4.项3的方法，其中在该生物量密度提高阶段发酵培养基中溶氧量是至少约4%。
[0036] 5.项4的方法，其中在该生产阶段发酵培养基中溶氧量是不到约1 %。
[0037] 6.项1的方法，其中该非醇碳源包含一种碳水化合物。
[0038] 7.项1的方法，其中该限制性营养源选自氮源，碳源，磷酸盐源，维生素源(如维生 素 B12源，泛酸盐源，硫胺素源），痕量金属源(如锌源，铜源，钴源，镍源，铁源，锰源，钼源），主 要金属源(如镁源，钙源，钠源，钾源），二氧化硅源或其混合物。
[0039] 8.项7的方法，其中所述痕量金属源和主要金属源选自这些金属的硫酸盐或氯化 物（如MgS〇4 · 7H20;MnCl2 · 4H20;ZnS〇4 · 7H2〇;CoC12 · 6H2〇;Na2Mo〇4 · 2H20;CuS〇4 · 5H20; NiS〇4 · 6H20;FeS〇4 · 7H2〇;CaCl2;K2S〇4;KCl ;和Na2S〇4)或其混合物。
[0040] 9.项1的方法，其中所述限制性营养源包括氮源。
[0041 ] 10.项9的方法，其中所述氮源包括无机铵盐。
[0042] 11.项9的方法，其中所述氮源包括氢氧化铵。
[0043] 12.项10的方法，其中所述发酵培养基的pH由该限制性营养源控制。
[0044] 13.项1的方法，其中所述发酵培养基的温度至少为约20°C。
[0045] 14.项1的方法，其中该方法以至少约0.5g/L/hr的速率产生脂质。
[0046 ] 15.项14的方法，其中所述脂质的至少约15 %是多不饱和脂。
[0047] 16.项14的方法，其中ω-3和ω-6脂肪酸的总量是所述脂质的至少约20%。
[0048] 17.项14的方法，其中所述脂质的至少约25%是二十二碳六烯酸。
[0049] 18.项1的方法，其中所述微生物选自藻类，真菌(包括酵母），原生生物，细菌或其 混合物，其中所述微生物能产生多烯脂肪酸或其它一般被认为其合成需要氧的脂质。
[0050] 19.项18的方法，其中所述微生物能在发酵培养基氧水平低于约3 %的饱和度下产 生脂质。
[0051] 20.项18的方法，其中对所述微生物进行补料分批培养。
[0052] 21.项20的方法，还包括在该发酵方法的生产阶段发酵培养基维持低于约3%饱和 度的氧水平。
[0053] 22.项1的方法，其中所述微生物是微藻类和类藻微生物。
[0054] 23.项1的方法，其中所述微生物是Stramenopiles。
[0055] 24.项1的方法，其中所述微生物属于破囊壶菌目。
[0056] 25.项1的方法，其中所述微生物选自破囊壶菌属，Schizochytrium或其混合物。
[0057] 26.培养能生产占其生物量的20%为脂质的真核微生物的方法，包括向包含所述 微生物的发酵培养基中添加碳源和限制性营养源，添加的速率足以提高该发酵培养基的生 物量密度到至少约l〇〇g/L，其中该方法生产脂质的速度至少平均约为0.5g/L/hr，所述微生 物产生的总脂质中至少约15%是多不饱和脂。
[0058] 27.项26的方法，其中该方法还包括：
[0059] (a)生物量密度提高阶段，其中发酵培养基的溶氧水平至少约为4% ;和
[0060] (b)脂质高产阶段，其中发酵培养基中的溶氧水平低于约1%。
[0061] 28.项26的方法，其中所述碳源是非醇碳源。
[0062] 29.项26的方法，其中所述限制性营养源选自氮源，碳源，磷酸盐源，维生素源(如 维生素 B12源，泛酸盐源，硫胺素源），痕量金属源（如锌源，铜源，钴源，镍源，铁源，锰源，钼 源），主要金属源(如镁源，钙源，钠源，钾源），二氧化硅源或其混合物。
[0063] 30.项29的方法，其中所述痕量金属源和主要金属源选自这些金属的硫酸盐或氯 化物（如MgS〇4 · 7H20;MnCl2 · 4H20;ZnS〇4 · 7H2〇;CoC12 · 6H2〇;Na2Mo〇4 · 2H20;CuS〇4 · 5H20; NiS〇4 · 6H20;FeS〇4 · 7H2〇;CaCl2;K2S〇4;KCl ;和Na2S〇4)或其混合物。
[0064] 31.项26的方法，其中所述限制性营养源包含氮源。
[0065] 32.项31的方法，其中该氮源包含无机铵盐。
[0066] 33.项26的方法，其中所述微生物选自藻类，真菌(包括酵母），原生生物，细菌或其 混合物，其中所述微生物能产生多烯脂肪酸或其它一般被认为其合成需要氧的脂质。
[0067] 34 ·项26的方法，其中所述微生物是Stramenopi les。
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