溶氧水平。例如，在约14，000加仑容量的发酵罐中，摇动 速度设定为前12小时约50rpm到约70rpm，约第12小时到18小时约55rpm到约80rpm，约第18 小时到发酵过程终止为约70rpm到约90rpm，以获得上述总发酵时间约90到约100小时的发 酵过程所具有的溶氧水平。获得发醇培养基中特定溶氧量所需搅拌速度的特定范围是本领 域技术人员能够决定的。
[0204] 本发明方法的优选温度是至少约20°C，更优选约25°C，最优选至少约30°C。应理解 地是，冷水比热水更能保持较高的溶氧量。因此，较高的发酵培养基温度具有降低溶氧量的 额外的好处，这是如上所述特别需要的。
[0205] 某些微生物可能需要在发酵培养基中有一定量的矿物盐。这些矿物盐，特别是氯 离子，能腐蚀发酵罐和其它下游处理设备。为防止或降低在发酵培养基中相对大量氯离子 的存在的这些不需要的影响，本发明方法还包括使用不含氯的钠盐，优选硫酸钠，作为发酵 培养基中的钠源。更具体地，发酵中绝大部分钠需求以不含氯的钠盐形式提供。例如，在发 酵培养基中少于约75%的钠盐以氯化钠的形式提供，更优选少于约50%，更优选少于25%。 本发明的微生物可在氯浓度低于约3g/L时生长，优选少于约500mg/L，更优选低于250mg/L， 更优选在约60mg/L到约120mg/L之间。
[0206] 不含氯的钠盐可包括苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物），碳酸钠，碳酸氢钠，硫酸 钠及其混合物，优选包括硫酸钠。苏打灰，碳酸钠，碳酸氢钠将会提高发酵培养基的PH，因此 需要控制步骤以维持培养基的正确的pH。硫酸钠的浓度有效地符合微生物的盐度要求，优 选钠浓度(表示为g/L的钠)至少约为lg/L，更优选为lg/L到约50g/L，更优选为约2g/L到约 25g/L〇
[0207] 接种，培养，和回收微生物的各种发酵参数，详述于美国专利5130242,其全文引入 作为参考。任何现今分离方法可用于从发酵培养基分离微生物，包括离心，过滤，超滤，倾 析，和溶剂蒸发。本发明人发现，由于本发明的方法产生如此高的生物量密度，当采用离心 回收微生物时，优选加入水稀释发酵培养基以降低生物量密度，从而能更有效的从发酵培 养基分尚微生物。
[0208] 本发明中获得的极高生物量密度也便于回收微生物脂质的"无溶剂"方法。2000年 1月19日提交的题为"无溶剂提取方法"的美国临时专利申请60/177，125、2001年1月19日提 交的题为"无溶剂提取方法"的美国专利申请09/766,500(现为U.S.Letters Patent No.6, 750,048，2004年6月15日授权）和2001年1月19日提交的题为"无溶剂提取方法"的PCT专利 申请PCT/US01/001806 (皆全文引入作为参考），都记述了在发酵罐中裂解细胞的优选方法。 优选的在细胞于发酵罐中透化，破碎或裂解后回收脂质的方法(它可使脂质乳剂裂解，并回 收富含脂质的级分），包括W096/05278公开的脱油方法，其全文引入作为参考。在此方法中， 在油/水乳液中加入水溶性化合物，例如醇或丙酮，以裂解乳液，所得混合物通过重力分离 技术，例如离心来分离。此方法经改良后也可以用其它试剂(水和/或脂溶性的试剂)裂解乳 液。
[0209] 备选地，通过使发酵培养基的水分蒸发，例如使发酵培养基直接接触干燥设备如 转鼓式干燥机（即没有，例如通过离心来预先浓缩），而从培养基回收干(dry)的微生物，即 一种直接的转鼓式干燥机回收方法。当采用直接转鼓式干燥机回收方法分离微生物时，一 般采用蒸汽加热式转鼓式干燥机。此外当采用直接转鼓式干燥机回收方法时，所述发酵培 养基的生物量密度优选至少约130g/L，更优选至少约150g/L，最优选至少约180g/L。这种高 生物量密度通常是直接转鼓式干燥机回收方法所希望的，因为生物量密度低时所述发酵培 养基含有的水分足以使转鼓明显冷却，使微生物不能彻底干燥。其它干燥细胞的方法，包括 喷雾干燥，已为本领域技术人员所熟知。
[0210] 本发明的方法提供至少约0.5g/L/hr的平均脂质生产速度，优选至少约0.7g/L/ 1!1'，更优选至少约0.98凡/111'，最优选1.(^/17111'。而且，本发明方法生产的脂质包含约15% 以上的多不饱和脂，优选约20 %以上，更优选约25 %以上，还优选约30 %以上，最优选约 35%以上。可从干微生物或发酵培养基中的微生物回收脂质。通常，本发明方法中由微生物 产生的脂质至少约20%是ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸，优选至少约30%的脂质是ω-3 和/或ω -6多不饱和脂肪酸，更优选至少约40%的脂质是ω -3和/或ω -6多不饱和脂肪酸， 最优选至少约50 %的脂质是ω -3和/或ω -6多不饱和脂肪酸。或者，本发明方法的ω -3脂肪 酸(例如DHA)平均产生速度为至少约0.2g ω -3脂肪酸(例如DHA)/L/hr，优选至少约0.3g ω -3脂肪酸（例如DHA)/L/hr，更优选至少约0.4g ω -3脂肪酸（例如DHA)/L/hr，最优选至少约 〇 · 5g ω _3脂肪酸（例如DHA)/L/hr。或者，本发明方法的ω _6脂肪酸(例如DPAn-6)平均产生 速度为至少约〇 . 〇7g ω-6脂肪酸（例如DPAn_6)/L/hr，优选至少约0 . lg ω-6脂肪酸（例如 DPAn-6)/L/hr，更优选至少约0.13g ω -6脂肪酸（例如DPAn-6)/L/hr，最优选至少约0.17g ω-6脂肪酸（例如DPAn-6)/L/hr。还备选地，至少约25%的脂质是DHA(基于总脂肪酸甲基 酯），优选至少约30%，更优选至少约35%，最优选至少约40%。
[0211] 从中提取了脂质的微生物，在提取脂质之后所剩的生物量或其混合物可直接用作 食品成分，例如饮料，调味汁，乳制品（例如乳，酸乳酪，干酪和冰淇淋)和烤制的食品的成 分;营养添加剂(胶囊或片剂形式中）；其肉或产品为人所消费的任何动物的饲料或饲料添 加剂;食品添加剂，包括幼儿食品和婴儿乳粉;药品(在直接或附属的治疗应用中）。术语"动 物"指属于动物界的任何生物，包括但不限于可得到家禽肉，海产食品，牛肉，猪肉或羊肉的 任何动物。海产食品得自但不限于鱼，虾，甲壳类动物。术语"产品"包括除了这类动物的肉 以外的任何产品，包括但不限于蛋，乳或其它产品。当饲喂这样的动物时，多不饱和脂能被 引入到这些动物的肉，乳，蛋或其它产品中以提高它们中这些脂质的含量。
[0212] 在了解了下面的实施例后，本发明的其它目的，优势和新的特点对本领域一般技 术人员是显而易见的，这些实施例并不构成对本发明的限制。 实施例
[0213]在较宽范围的各种发酵条件下，这些实施例所用的Schizochytrium菌株产生两种 主要的多烯酸，DHAn-3和DPAn-6，比例一般为3:1，还有少量的其它多烯酸，如EPA和C20:3。 因此，当下列实施例仅列出了 DHA的量时，可以采用上述的比例容易地计算出产生的DPA(n-6)的量。
[0214] 实施例1
[0215] 本实施例举例说明发酵培养基中氧含量对脂质生产力的影响。
[0216] 检测了在各种溶氧水平下Schizochytrium菌株ATCC 20888的发酵结果。该结果见 图1，其中RCS是蔗糖的残余浓度，DCW是细胞干重。
[0217] 实施例2
[0218] 本实施例也举例说明发酵培养基中低溶氧水平对最终生物量产物中DHA含量（％ 干重）的影响。
[0219] 在250ml的Erl enmeyer烧瓶中进行"按比例缩小（seal e-down)"实验以模拟在大规 模发酵罐中培养Schizochytrium细胞时低氧量对DHA含量的影响。在04-4培养基中培养 Schizochytrium菌株(ATCC 20888)。该培养基由每升去离子水中溶解的如下物质组成： Na2S〇4l2.61g;MgS〇4 · 7H20 1.2g;KCl 0.25g;CaCl20.05g;谷氨酸单钠7.0g;葡萄糖 10g; KH2P040.5g;NaHC030. lg;酵母提取物0. lg;混合维生素1.OmL;PII金属1.OOmLHI金属混合 物含有（每升）：6.0g Na2EDTA，0.29g FeCl3.6H2〇,6.84g H3B03,0.86g MnCl2.4H20,0.06g ZnCl2,0.026g CoCl2*6H20,0.052g NiS〇4*H20,0.002g CuS〇4*H2〇,和0.005g Na2Mo〇4· 2H2O。混合维生素含有(每升）：lOOmg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg维生素 B12。调培养液的pH 为7.0，然后过滤除菌。
[0220] 此按比例缩小实验的构想是，在有不同体积培养液的摇瓶中培养细胞-摇瓶中几 乎装满(例如在250mL摇瓶中装200mL)，在摇床上不能充分混合，这样在细胞生长时就会产 生低溶氧条件。为此，在本实验中建立4种处理，每一种都双份：（1) 250mL摇瓶中装50mL培养 基；（2)250mL摇瓶中装100mL培养基；（3)250mL摇瓶中装150mL培养基；（4)250mL摇瓶中装 200mL培养基。这8个摇瓶的每一个都接种已经培养了 48小时的Schizochytrium细胞，所述 细胞已经在04 - 4培养基中按照第1种处理所述条件，在28°C以220rpm在摇床上培养。将所 有这8个摇瓶置于培育箱（28°C)中的摇床(220rpm)上，避光培养48小时。在实验结束时，用 YSI溶氧计检测每个摇瓶中的溶氧(D0)水平，也测定培养基中的pH，以及细胞干重和脂肪酸 含量。实验结果列于表1中。
[0221] 表1:观察低溶氧浓度对Schizochytrium菌株的长链高度不饱和脂肪酸含量 (DHA%干重）的影响的按比例缩小实验结果。
[0222]
[0223] 该结果显示在低溶氧水平下培养的细胞的脂质含量（以％FAME计)和DHA含量（％ 干重)较高，溶氧水平越低，脂质和DHA量越高。这是令人意外的，因为一般认为氧是形成不 饱和(双)键所必需的。令人惊异的是在低溶氧水平下形成如此多的DHA，因为DHA是最不饱 和的脂肪酸之一。尽管随着溶氧水平降低，生物量产量降低，DHA含量却提高了。因此，较为 有利地是使生长阶段的溶氧水平较高以形成最多的生物量，然后降低溶氧水平以产生最多 的长链脂肪酸。
[0224] 实施例3
[0225] 本实施例阐明本发明方法的再现性。
[0226] 采用正常工作体积为1200加仑的发酵罐生产微生物。浓缩所得发酵液，采用转鼓 式干燥机干燥微生物。提取所得微生物等分试样的脂质，并纯化产生精炼的，脱色的，除臭 的油。在分析脂质前加入约3000ppm d-1-α-生育酚醋酸酯作为营养添加剂。
[0227] 对Schizochytrium菌株ATCC 20888进行九次发酵，所得结果表示于表2中。在前24 小时溶氧水平为约8%，其后为约4%。
[0228] 表2: Schizochytrium菌株生产DHA的补料分批发醇结果
[0229]
[0231] 1.生物量密度实际产量，
[0232] 2.以％细胞干重计的0拟含量，
[0233] 3.以％细胞干重计的总脂肪酸含量（以甲基酯形式测定），
[0234] 4.(g DHA)/L/Hr,
[0235] 5.平均值，
[0236] 6.标准差
[0237] 7.变异系数。变异系数值低于5%指示具有极佳再现性的方法，在5%到10%之间 指示具有良好再现性的方法，在10%到20%之间指示具有合理再现性的方法。
[0238] 补加玉米糖浆使发酵罐中的体积达到约1200加仑，此时停止加入玉米糖浆。在残 余糖浓度低于5g/L时停止发酵过程。从接种到终点的典型菌龄为约100小时。
[0239] 发酵液，即发酵培养基用水稀释至接近2:1的比例以减少终产品中灰分含量并帮 助改进离心步骤时的相分离。将浓缩的细胞加热到160°F(约71°C)，在Blaw Know双-转鼓式 干燥机(42" X 36"）上干燥。但是优选微生物不经离心而直接在转鼓式干燥机上干燥。
[0240] 从表2中每一实体的等分试样提取的脂质的分析结果总结在表3中。
[0241] 表3:表2所列补料分批发酵中产生的微生物生物量的分析。
[0242]
[0243]
[0244] 1.参见表2。
[0245] 2 ·参见上述讨论。
[0246] 3.标准差
[0247] 4.变异系数。变异系数值低于5%指示具有极佳再现性的方法，在5%到10%之间 指示具有良好再现性的方法，在10%到20%之间指示具有合理再现性的方法。
[0248] 除非特别指出，在本文实施例部分所用的发酵培养基包括如下成分，其中第一个 数字指出正常的目标浓度，括号中的数字表示可接受的范围：硫酸钠12g/L( 11-13) ;KC1 0.