到干的微生物;和
[0168] (e)从所述干的微生物分离脂质。
[0169] 117.项116的方法，其中所述除去水的步骤包括将所述发酵培养基不经预先离心 而直接蒸发去水。
[0170] 118.项106的方法，其中所述回收脂质的步骤包括：
[0171] (d)处理发酵液以透化，溶解，或破裂微生物细胞;和
[0172] (e)在有或没有试剂帮助裂解脂质/水乳剂的情况下，通过重力分离而回收发酵液 中的脂质。
[0173] 119.项106的方法，其中在步骤(d)中是在发酵罐或类似容器中处理微生物细胞。
[0174] 120.项118的方法，其中所述重力分离包括离心。
[0175] 121.-种富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法，包括在溶氧水平低于10%的生长 培养基中发酵所述微生物。
[0176] 122.项121的方法，其中的溶氧水平低于5%。
[0177] 123.项121的方法，其中的溶氧水平低于1 %。
[0178] 124.项121的方法，其中在开始的生长阶段，溶氧水平高于10%，在随后的生产阶 段，溶氧水平低于10 %。
[0179] 125.项121的方法，其中所述微生物包括聚酮化合物合成酶基因。
[0180] 126. -种生产产物和微生物的异养方法，包括：
[0181] a.在生长培养基中培养所述微生物，所述微生物中包含聚酮化合物合成酶基因； 和
[0182] b.保持溶氧水平低于10%。
[0183] 127.项126的方法，其中所述溶氧水平低于约5%。
[0184] 128.项126的方法，其中所述溶氧水平低于约1 %。
[0185] 129.项126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因天然产生于所述微生物中。
[0186] 130.项126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因是通过基因工程引入到所述 微生物中的。
[0187] 131.项126的方法，其中在生长的开始阶段，溶氧水平高于10%，在随后的生产阶 段，溶氧水平约低于10%。
【附图说明】
[0188]图1是微生物的各种脂质生产参数对发酵培养基中溶氧量的表和图。
[0189]发明详述
[0190] 本发明提供了培养微生物，例如藻类，真菌(包括酵母），原生生物，和细菌的方法。 优选地，微生物选自藻类，原生生物，细菌或其混合物。更优选地，微生物是藻类。而且，本发 明方法可用于生产各种脂质化合物，尤其是不饱和脂质，优选多不饱和脂（即含有至少2个 不饱和碳一碳键，例如双键，的脂质），更优选高度不饱和脂（即含有4个或更多个不饱和 碳一碳键的脂质)如ω -3和/或ω -6多不饱和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸（即DHA);和其它 天然的不饱和，多不饱和及高度不饱和化合物。本文中术语"脂质"包括磷脂;游离脂肪酸； 脂肪酸的酯;三酰基甘油；留醇和留醇酯;类胡罗卜素;叶黄素(例如羟基类胡萝卜素）；烃;类 异戊二烯衍生的化合物和本领域技术人员所知的其它脂质。
[0191] 更具体地，本发明方法可用于生产真核微生物多烯脂肪酸，类胡萝卜素，真菌甾醇， 植物留醇，叶黄素，泛醌，和通常认为需要氧来产生不饱和碳-碳键（即通气条件）的其它类 异戊二烯衍生的化合物，和其次级代谢产物。具体地，本发明方法可用于培养生产多烯脂肪 酸的微生物，并用于生产微生物多烯脂肪酸(类）。
[0192] 本发明的方法可用于培养许多微生物并得到由其产生的包含多不饱和脂的化合 物，但为了简洁，便利和说明，此发明详述将讨论培养能产生含有ω-3和/或ω-6多不饱和 脂肪酸的脂质的微生物，尤其能产生DHA(或密切相关的化合物如DPA，EPA或ARA)的微生物 的方法。优选的微生物包括微藻类，真菌(包括酵母），原生生物和细菌。优选的一组微生物 是称为Stramenopiles的成员，包括微藻类和类藻微生物。Stramenopiles包括下列微生物： Hamatores,Proteromonads,Opalines ,Developayelle,Diplophrys,Labrinthulids , Thraustochytrids，Biosecids，卵菌纲(Oomycetes)，Hypochytridiomycetes，Commation， Reticulosphaera，Pelagomonas，Pelagococcus，011icola，Aureococcus，Parmales，石圭藻属 (Diatoms)，黄藻（Xanthophytes)，Phaeophytes(褐藻），Eustigmatophytes， Raphidophytes，Synurids，Axodines (包括Rhizochromul inaales，Pedinellales， Dictyochales)，Chrysomeridales，Sarcinochrysidales，Hydrurales，Hibberdiales，和 Chromul inales。其它优选的微藻类包括绿藻和腰鞭毛目（dinoflagellates)，包括 Crypthecodium属的成员。更具体地，本发明的优选实施方案参照培养海洋微生物的方法进 行讨论，所述海洋微生物尤其是藻类，例如破囊壶菌目的Thraustochytrids，更尤其是破囊 壶菌属（1'11瓜1181：0(31171：1'；[11111)的破囊壶菌（1'11抑1181：0(31171：1^&168)以及3(311丨20(31171：1'；[111]1属，包 括在共同转让的美国专利5340594和5340742(两者授权于Barclay，都全文引入作为参考） 中公开的破囊壶菌。应注意，许多专家同意Ulkenia不是一个单独的属，实际是 Schizochytrium 属的一部分。在本文中，Schizochytrium属包括 Ulkenia。
[0193] 优选的微生物是那些可通过聚酮化合物合成酶系统产生目的化合物的微生物。这 样的微生物包括具有内源的聚酮化合物合成酶系统的微生物以及已通过基因工程导入聚 酮化合物合成酶系统的微生物。聚酮化合物是结构多样的天然产物，具有多种生物活性，包 括抗生素和药物学特性。聚酮化合物合成酶催化聚酮化合物碳链骨架的生物合成。象结构 和机理相关的脂肪酸合成酶，聚酮化合物合成酶催化酰基硫代酸酯之间的重复的脱羧缩 合，一次可以使碳链延长两个碳原子。但是，与脂肪酸合成酶不同，聚酮化合物合成酶能产 生结构具有很大差异的终产物。单个聚酮化合物合成酶系统可如下实现这一点：利用非乙 酸酯的起始单元，利用甲基或乙基丙二酸酯作为延伸单位，和改变每次缩合所得β-酮基的 酮还原、脱水和烯酰基还原反应的还原周期(cycle)。本文特别感兴趣的是脱水步骤导入的 碳-碳双键在终产物中可保持。此外，尽管这些双键开始是反式构型，通过酶促异构化作用 在DHA(和其它目的多烯脂肪酸）中可转变为顺式。脱水酶和异构化反应都可在缺乏分子氧 的情况下出现。
[0194] 优选地，本发明提供了异养方法用于产生产品和微生物。此方法优选包括在生长 培养基中培养微生物，所述微生物中包含了聚酮化合物合成酶系统。优选地，保持溶氧水平 低于约8%，更优选低于约4%，更优选低于约3%，更优选低于约1 %。
[0195] 但是应理解地是，本发明作为一个整体并非要进行这样的限制，本领域技术人员 会认识到根据本发明的方法可用于其它微生物生产多种其它化合物，包括其它脂质化合 物。
[0196] 假定某种藻类有相对恒定的生产脂质的速度，显然较高的生物量密度能使单位体 积生产的脂质总量更多。当今传统的培养藻类的发酵方法产生的生物量密度为约50到约 80g/L或更少。本发明人已经发现通过采用本发明方法，可以得到比现有已知生物量密度显 著提高的生物量密度。优选地，本发明生产的生物量密度为至少约l〇〇g/L，更优选至少约 130g/L，还优选至少约150g/L，还优选至少约170g/L，最优选至少约200g/L。因此，有了这样 高的生物量，即使藻类的脂质生产率稍稍降低，单位体积的脂质总产量也会显著高于现有 方法。
[0197] 本发明培养破囊壶菌目微生物的方法包括向包含微生物的发酵培养基中加入碳 源和限制性营养源，其加入速度足以提高发酵培养基的生物量密度到上述水平。此处，"限 制性营养源"指微生物生长所必需的营养来源(包括营养物本身），当生长培养基中限制性 营养耗尽时，它的缺乏会大大抑制微生物的进一步生长或复制。但是，由于其它营养物质还 很丰富，所述生物会继续制造和累积胞内和/或胞外产物。通过选择特异性的限制性营养 物，可以控制积累产物的类型。因此，以一定的速度提供限制性营养源，可以控制微生物的 生长速度和所需产物(例如脂质）的生产或积累。这种发酵过程由于将一或多种底物(例如 碳源和限制性营养源)增量加入，而通常称为补料分批发酵过程。已发现在分批发酵过程中 加入底物时，大量的碳源(例如每60g/L生物量约200g/L或更高密度)对微生物有不利影响。 不受任何理论的限制，认为这样大量的碳源会对微生物产生有害影响，包括渗透压，并抑制 微生物的初始生产力。本发明方法避免了这种不需要的有害影响，同时提供了足以使所述 微生物达到上述生物量密度的底物量。
[0198] 本发明的培养微生物的方法包括生物量密度的提高阶段。在此阶段，发酵过程的 主要目的是提高发酵培养基中的生物量密度以得到上述的生物量密度。加入碳源的速度一 般保持在不对微生物的生产力，或微生物的活力产生显著有害影响的特定水平或范围，所 述有害影响是由于发酵设备除热和对培养液输入或输出气体的能力不足而导致的。具体微 生物在发酵过程所需的碳源量的合适范围为本领域技术人员所熟知。优选地，本发明的碳 源是非醇碳源，即不包含醇的碳源。此处，"醇"指具有4个或更少的带有一个羟基的碳原子， 例如甲醇，乙醇和异丙醇，但是为了本发明的目的不包括羟基有机酸如乳酸和类似的化合 物。更优选地，本发明的碳源是碳水化合物，包括，但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀 粉。其它合适的单纯和复合碳源和氮源公开在上述参考的专利中。但是典型地，碳水化合 物，优选玉米糖浆用作主要的碳源。脂肪酸，羟基形式的脂肪酸，三酸甘油酯，和双一和单一 酸甘油酯也可用作碳源。
[0199] 特别优选的氮源是尿素，硝酸盐，亚硝酸盐，大豆蛋白，氨基酸，蛋白质，玉米浆，酵 母提取物，动物性副产物，无机铵盐，更优选硫酸铵，氢氧化铵，最优选氢氧化铵。其它限制 性营养源包括碳源(如上定义），磷酸盐源，维生素源(如维生素 B12源，泛酸盐源，硫胺素源）， 痕量金属源(如锌源，铜源，钴源，镍源，铁源，锰源，钼源），主要金属源(如镁源，钙源，钠源， 钾源，和二氧化硅源等）。痕量金属源和主要金属源选自这些金属的硫酸盐或氯化物（例如 MgS〇4 · 7H20;MnCl2 · 4H20;ZnS〇4 · 7H20;C〇C12 · 6H2〇;Na2Mo〇4 · 2H20;CuS〇4 · 5H20;NiS〇4 · 6H20;FeS〇4 · 7H2〇;CaCl2;K2S〇4;KCl;和Na2S〇4)。
[0200] 当铵用作氮源时，如不加碱或不用缓冲液控制，发酵培养基会变酸。当氢氧化铵用 作主要的氮源时，它也可用于控制pH。破囊壶菌目微生物，尤其破囊壶菌属的破囊壶菌和 Schizochytrium属可在较宽pH范围内生长，例如从约pH5到约pHll。本领域技术人员了解具 体微生物发酵的合适pH范围。
[0201] 本发明培养微生物的方法还包括生产阶段。在此阶段，微生物利用底物的主要用 途不是提高生物量密度，而是利用该底物生产脂质。应理解地是在生物量密度提高阶段微 生物也产生脂质；但是，如上所述，在生物量密度提高阶段的主要目的是提高生物量密度。 一般地，在生产阶段，减少或优选停止添加限制性营养底物。
[0202] 以前一般认为在利用真核微生物生产多不饱和化合物，包括ω-3和/或ω-6多不 饱和脂肪酸时，发酵培养基中的溶氧的存在是至关重要的。因此，通常认为发酵培养基中优 选溶氧水平相对较高。但是，本发明人惊奇地发现在生产阶段当溶氧水平降低时脂质的生 产速率显著提高。因此，在生物量密度提高阶段发酵培养基中的溶氧水平优选至少约8%的 饱和度，优选至少4%的饱和度，而在产生阶段发酵培养基中的溶氧水平减少到约3%的饱 和度或更少，优选约1 %饱和度或更少，更优选〇 %饱和度。在发酵开始时，D0值可以为或接 近饱和，当微生物生长时可使D0值降低至这些低D0设定值。在本发明的一个具体实施方案 中，发酵期间发酵培养基中的溶氧量有变化。例如，对于总发酵时间为从约90小时到约100 小时的一个发酵过程，发酵培养基中的溶氧水平在前24小时保持在约8%，在约第24小时到 约第40小时约为4%，从第40小时到发酵过程终止约为0.5%或更少。
[0203]可通过控制发酵罐顶部空间中的氧量来控制发酵培养基中的溶氧量，或优选通过 控制发酵培养基的摇动(或搅拌)速度来控制。例如，高的摇动(或搅拌)速度会比低摇动速 度在发醇培养基中产生相对更高的