5g/L(0.45_0.55);MgS〇4 · 7H20 2g/L(1.8-2.2);Hodag K-60消泡剂0.35g/L(0.3-0.4); K2SO4O · 65g/L(0 · 60-0 · 70) ;KH2P〇4lg/L(0 · 9-1 · 1); (NH4)2S041g/L(0 · 95-1 · 1);CaCl2 · 2H20 0.17g/L(0.15-0.19);95DE 玉米糖浆（以固体计）4.58/1(2-10);]?11(：12.4!12〇311^/1(2.7-3.3)；ZnS〇4 · 7H20 3mg/L(2.7-3.3) ；C0CI2 · 6H2O 0.04mg/L(0.035-0.045) ；Na2Mo〇4 · 2H20 0.04mg/L(0-0.045);CuS04· 5H20 2mg/L(l.8-2.2);NiS〇4· 6H2O 2mg/L(l.8-2.2);FeS〇4· 7H20 10mg/L(9-ll);硫胺素9.5mg/L(4-15);维生素 B120.15mg/L(0.05-0.25)和泛酸钙 3.2mg/L( 1.3-5.1)。此外，28 %NH4〇H溶液用作氮源。
[0249] 干微生物的灰分量约为6%重量份。
[0250] 实施例4
[0251 ]本实施例用于阐明14000加仑规模的发酵培养基中溶氧水平降低对微生物生产力 的影响。
[0252] 采用实施例3所述方法，利用Schizochytrium野生型菌株进行标称体积为14000加 仑的发酵，所述菌株是用上述美国专利5340594和5340742公开的分离方法得到的。在前24 小时发酵培养基中的溶氧水平为约8%，在第24到40小时约为4%，从第40小时到发酵过程 终止约为0.5%。表4显示了发醇过程中此低溶氧水平的结果。
[0253]表4:在降低的溶氧浓度下14000加仑规模的Schizochytrium补料分批发酵的结 果。
[0254]
[0255] 实施例5
[0256] 本实施例阐明41000加仑规模的发酵培养基中低溶氧水平对微生物生产力的影 响。
[0257] 除了发酵在41000加仑的发醇罐中进行外，采用与实施例4相同的方法。增加培养 液体积以在此规模下维持目标化合物的浓度。实验结果显示于表5。
[0258] 表5: Schizochytrium的 41000 加仑规模发酵
[0259]
[0260] 实施例6
[0261 ]本实施例阐明额外的氮对本发明的发酵过程的影响
[0262] 采用与实施例4近似的方法进行4组250L规模的补料分批培养实验。进行两组对照 实验和两组含有额外的氨(1.15 X和1.25 X标称量)的实验。实验结果显示于表6中。
[0263] 表6:额外的氨对Schizochytrium发酵的影响
[0264] 1
[0266]
[0267] 通常，额外的氮对发酵效能有负面影响，在加入了额外的氨的两批中DHA生产力显 著降低。如表6所示，对照批次的最终DHA水平占总细胞干重的18.4%和22.1%，额外供应了 氨的批次为9·2%(1 · 15X氨)和12.6%(1.25父氨）。
[0268] 实施例7
[0269] 本实施例显示本发明发酵方法的动力学特征(prof ile)。
[0270] 采用与实施例4近似的方法进行1000加仑规模的补料分批培养实验。表7表示了发 酵过程的动力学特征。
[0271 ] 表7:1000加仑规模的Schizochytrium补料分批发酵的动力学特征
[0272]
[0273]
[0274] *在48小时的时候分析了两个不同的样品。
[0275] **这是洗过的细胞干重(DCW)样品。其它的值是未洗过的样品的。
[0276] 实施例8
[0277]本实施例阐明了碳源的量对生产力的影响。
[0278]采用实施例4的方法以不同的碳源的量进行了三批不同发酵实验。结果如表8所 不。
[0279] 表8:不同碳源量对Schizochytrium发酵的影响。
[0280]
[0281] 实施例9
[0282] 本实施例阐明营养限制对碳转化为生物量，脂质并特别是DHA的转化效率的影响。
[0283] 为了研究营养限制的影响，在2升Applikon发酵罐中对Schizochytrium菌株ATCC 20888进行连续培养实验，基本生长培养基（ICM-2)由下列化合物组成（标定浓度）：1组成 分:Na2S〇4(18 · 54g/L)，MgS〇4 · 7H2〇(2 · Og/L)和KC1 (0 · 572g/L); II组成分(每一个单独制 备）：葡萄糖（43.818/1)，1〇12?04(1.288/1)，〇&(：12.6!120(0.0258/1)和（顺4)2304(6.538 8/ U;ΠI组成分：Na2EDTA(6·0mg/L)，FeCl3·6H20(0·29mg/L)，H3B03(6·84mg/L)，MnCl2·4H20 (0.86mg/L),ZnS0 4 · 7H20(0.237mg/L) ,CoCl2 · 2H20(0.026mg/L) ,Na2Mo04 · 2H20(0.005mg/ L)，CuS〇4 · 5H2〇(0.002mg/L)和NiS〇4 · 6H2〇(0.052mg/L);和IV组成分：盐酸硫胺素（0.2mg/ L)，维生素 B12(0·005mg/L)，泛酸钙(0· 2mg/L)。加入到发酵罐之前，I和II组高压灭菌，III和 IV组过滤除菌。用Schizochytrium接种生长培养基，在30°C，pH5.5，溶氧为20%饱和度的控 制条件下生长直到达到最大细胞密度。
[0284] 通过以足以维持稀释速率为0.06hr4的流量栗入无菌ICM-2进料培养基到发酵罐 并同时移出含Schizochytrium细胞的培养液进行连续模式操作，直到达到稳定状态。为观 察营养限制的影响，减少ICM-2进料培养基中的含有特定所需营养的化合物，使该营养成 分在含细胞的出口培养液中耗尽，这样由于该特定所需营养的缺乏，细胞生长受到限制。一 旦确立每一条件的稳定状态的操作，就测定最终培养液的干生物量，残余葡萄糖，限制性营 养浓度，细胞脂质含量和细胞DHA含量。用葡萄糖总耗量除以所得干生物量的总量，计算出 葡萄糖转化为生物量的转化效率，以百分比表示。
[0285] 对列于下表中的每一营养成分重复进行此实验，研究每一营养成分限制生长的效 应。最终结果列于下表中。
[0286] 表9:营养限制对Schizochytrium菌株的生物量产量，转化效率（葡萄糖-生物 量），脂质含量和DHA含量的影响。
[0287] 方案中记述的项的装置和方法，包括那些可能已在以前的装置或方法中采用的项，例如为 改进效果，减轻劳动和/或降低实施成本而采用的项。
[0295]出于阐述和说明的目的提供本发明的上述讨论。上述内容不打算限制本发明于本 文所公开的形式。尽管本发明的说明已经包括一种或多种实施方式和某些变化与修饰的说 明，不过其他变化与修饰也在本发明的范围内，例如在理解了目前的公开内容后，可以在本 领域的技术与知识范围内作出这些变化和修饰。本发明打算获得包括替代实施方式的权利 至这样一种程度，包括与所要求保护的那些可交替、互换和/或等价的结构、功能、范围或步 骤，无论本文是否公开这类可交替、互换和/或等价的结构、功能、范围或步骤，并且不打算 以公众名义贡献任何可授予专利权的主题。
[0296]保藏材料
[0297] 以下材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)。
[0298] 名称 保藏号 保藏日
[0299] Schizochytrium sp.(裂殖壶菌属菌种）S31 ATCC 20888 1988-8-5
【主权项】
1. 一种含高度不饱和脂肪酸的微生物生物量，其中所述生物量通过在包含碳源和限制 性营养源的发酵培养基中进行所述微生物的发酵的方法来产生，所述方法包括： a) 提供包含碳源和限制性营养源的发酵培养基； b) 向所述发酵培养基中添加所述微生物； c) 向所述发酵培养基中添加额外量的所述碳源和限制性营养源以将该发酵培养基的 生物量密度提高以按细胞干重计至少约l〇〇g/L。 d) 向所述发酵培养基中添加额外量的所述碳源同时限制添加的限制性营养源的量以 诱导所述微生物产生脂质;且 其中所述微生物是破囊壶菌目的微生物，并产生以所述生物量的细胞干重计至少15% 的脂质。2. 权利要求1的生物量，其中所述方法进一步包括： e) 从所述微生物中回收至少一些所述脂质。3. 权利要求1的生物量，其中当发酵培养基的生物量密度以细胞干重计为至少150g/L 时，所述微生物的发酵产生含有高度不饱和脂肪酸的脂质。4. 权利要求1的生物量，其中所述方法以每小时发酵每升发酵培养基至少0.5克脂质的 平均速率产生脂质。5. 权利要求1的生物量，其中所述微生物选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)，裂殖壶 菌属（Schizochytrium)及其混合物。6. 权利要求1的生物量，其中所述方法平均产生每小时发酵每升发酵培养基至少0.2克 的二十二碳六烯酸。7. 权利要求1的生物量，其中当所述生物量密度为以细胞干重计至少100g/L时所述微 生物产生含有高度不饱和脂肪酸的脂质。8. 权利要求1的生物量，其中所述高度不饱和脂肪酸选自下组:二十二碳六烯酸，二十 二碳五烯酸，二十碳五烯酸，花生四烯酸及其混合物。9. 从权利要求1 _8中任一项的生物量中提取的油。10. -种含有权利要求1 -8中任一项的生物量或权利要求9的油的饲料产品。
【专利摘要】本发明涉及通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生。本发明提供了培养真核微生物的方法，所述微生物可以生产脂质，具体是含有多烯脂肪酸的脂质。本发明还提供了生产真核微生物脂质类的方法。ATCC 2088819880805
【IPC分类】C12N1/00, C12N1/12, C12P7/64, C12N15/09, C12N1/13, A23L1/03, C12R1/89, A23D9/00, A23B7/10, C12R1/645
【公开号】CN105567752
【申请号】CN201610022191
【发明人】克雷格·M·鲁克尔, 唐·迪马西, 乔恩·M·汉森, 彼得·J·米拉索尔, 理查德·B·贝利, 乔治·T·维德尔第三, 塔茨奥·卡奈科, 威廉·R·巴克利
【申请人】Dsm Ip资产公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2001年1月26日
【公告号】CA2396691A1, CA2396691C, CA2760879A1, CA2786722A1, CN1416320A, CN100491519C, CN101003821A, CN101519677A, CN101519678A, CN101519678B, CN101519679A, CN101519679B, CN101519680A, CN101519680B, CN105112463A, DE01903376T1, DE60130737D1, DE60130737T2, DE60130737T3, DE60130737T8, EP1251744A1, EP1251744A4, EP1251744B1, EP1251744B2, EP1707055A2, EP1707055A3, EP2338974A2, EP2338974A3, EP2341125A2, EP2341125A3, EP2341126A2, EP2341126A3, EP2341127A2, EP2341127A3, EP2341127B1, EP2960325A1, US6607900, US7579174, US7732170, US8124384, US8124385, US8133706, US8187845, US8187846, US8206956, US8216812, US8288133, US8288134, US20010046691, US20030180898, US20060286648, US20060286649, US20080032360, US20080032361, US20080032362, US20080032363, US20080032364, US20080032365, US20080032366, US20080032381, US20080032387, US20080057551, US20120178135, US20150320084, WO2001054510A1, WO2001054510A9