专利名称：用于分析试剂的载体颗粒胶乳和分析试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于分析试剂的载体颗粒胶乳以及使用它的分析试剂，所述分析试剂能够在免疫血清学检验中测定广泛浓度范围的生物样品并可以稳定保存一段延长期。
背景技术：
在临床实验室检验领域，使用生物样品(血，尿等)诊断各种疾病，作为用于诊断它们的方法，已经开发和使用了各种测定法。该测定法的代表是利用酶促反应的生物化学测定法和利用抗原-抗体反应的免疫测定法。作为在该诊断中使用的试剂，已经开发了有关妊娠试验，检测类风湿因子的RA检验，检测C-反应蛋白的CRP检验以及针对乙型肝炎表面抗原(HBs抗原)，抗HBs抗体，β2微球蛋白抗体，支原体抗原，核酸，核蛋白，雌激素，抗雌激素抗体等的检验的试剂。
作为该测定法，可以举例说明免疫浊度测定法(TIA法)，胶乳浊度测定法(LIA法)，酶免疫测定(EIA法)和放射免疫测定(RIA法)，并且取决于目的适当地选择。
在上面列出的那些中，应用LIA法来检测各种抗原和抗体，因为它是方便的并能够被迅速实施，其中使用抗原或抗体将通过将载体颗粒分散至水性介质中形成的胶乳载体颗粒敏化，然后将其用来检测作为载体颗粒聚集反应的与血清中相应抗体或抗原的反应。
医疗实践最近的趋势是从疾病的常规诊断向疾病预防转变。因此，通过在疾病发作前检验血液等，预先鉴定疾病的诱因，由此实现预防。为了应用该预防医疗，在实行LIA法等过程中要求更高的灵敏度。尽管免疫血清学检验如抗原抗体反应最初测定少量物质，在预防医疗中使用的分析试剂应该能够检测更低浓度的疾病相关痕量蛋白(抗原和/或抗体)。因此，比当前使用的那些更灵敏的分析试剂变得必需。
鉴于上面讨论的问题，已经目益改进用于测定少量样品和少量试剂的免疫检验的自动免疫分析仪的仪器，并相应提出在该仪器中使用试剂更高灵敏度的要求。
作为提高该试剂灵敏度的方法，举例说明一种方法，其中通过提高使用的载体颗粒的粒度由此提高光密度变化的数值来试图以更高的灵敏度测定分析物。日本Kokoku出版物Sho-58-50645公开了用于生产胶乳的方法，其包含在没有乳化剂的情况下在水中使用过硫酸盐作为引发剂将苯乙烯与基于所述苯乙烯10％重量或更少的苯乙烯磺酸盐共聚合，接着在碱性条件下加热，表明通过增大基于苯乙烯单体的催化剂的量可以获得由粒度为0.3-0.8μm的载体颗粒组成的胶乳。在另一方面，日本Kokoku出版物Hei-1-36484公开了通过在含有二价金属氧化物或氢氧化物的水溶液中合成胶乳来生产诊断试剂的方法。
然而，使用包含大粒度载体颗粒的胶乳的方法涉及问题，即当分析物以高浓度存在时，由载体颗粒聚集导致的光密度变化超出可检测范围而不能获得对应于分析物的量的光密度改变，它可能反映非特异性聚集反应并且此外，由于缺乏稳定性不能延长期保存。
在另一方面，日本Kokai出版物Sho-63-65369公开了使用胶乳试剂的方法，所述胶乳试剂是通过使用抗体或抗原敏化包含两种或多种具有不同平均粒度的载体颗粒的胶乳并以一定比率混合而获得的。该方法试图取得具有两种分布图(profile)的性能，即基于包含小粒度载体颗粒的胶乳的广泛范围测定和基于由大粒度载体颗粒组成的胶乳的在低浓度范围下的高灵敏度。
日本Kokoku出版物Sho-63-14783公开了由两种具有不同粒度范围的载体颗粒组成的胶乳，所述载体颗粒装载至少两种不同的量的相同抗原或抗体。
日本专利号2588174公开了测定抗原抗体反应的方法，其包含将胶乳与针对致敏性抗体的抗原或针对致敏性抗原的抗体在水中反应并测量在照射时吸光度的变化，所述胶乳是通过使用抗原或抗体敏化两种或多种具有不同平均粒度的颗粒接着混合而获得的胶乳或者是通过混合两种或多种具有不同平均粒度的颗粒接着用抗原或抗体敏化而获得的胶乳，其中混合平均粒度为0.05-0.3μm的载体颗粒和平均粒度为0.3-1.0μm的载体颗粒，并且其中所照射的光其波长至少是混合颗粒平均粒度的2.5倍，也就是0.6-2.4μm。
日本Kokai出版物Hei-5-18973公开了一种免疫测定法，其包含，取决于通过免疫反应待测的组分的量，将其中与待测组分反应的组分是不溶解的粒度为0.1μm或更小的载体颗粒与至少一种与待测组分反应的组分和其中活性组分是不溶解的粒度大于0.1μm的载体颗粒结合，并进行与含有待测组分的样品的反应，以及在其中使用的试剂。
然而，使用由数种具有不同平均粒度的载体颗粒组成胶乳的该方法难以制备胶乳试剂，并且存在问题，即，即使相同操作者按照确定方案使用具有相同平均粒度和相同CV值的颗粒制备试剂，获得的试剂在制剂性能方面一次一次不同。
发明概述本发明的目的是提供用于分析试剂的载体颗粒胶乳以及使用它的分析试剂，所述分析试剂在免疫血清学检测中能够测定广泛浓度范围的生物样品并可以稳定保存一段延长期。
本发明的第一方面是用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005-0.7μmol/m2，平均粒度为0.01-1.5μm。
本发明的第二方面是用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒包含两种或多种具有不同表面磺酸基量的颗粒。在按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，优选所述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005-0.7μmol/m2。在按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，优先所述载体颗粒包含表面磺酸基的量为0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的载体颗粒(A)和表面磺酸基的量为0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的载体颗粒(B)。在按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，优选包含的载体颗粒(A)和载体颗粒(B)的重量比是由(A)/(B)＝1/10-10/1表示。
本发明的第三方面是用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒的平均粒度为0.04-0.1μm，粒度的CV值为8-20％。在按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，优先所述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005-0.7μmol/m2。
优选按照本发明第一，第二或第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳基本上不含乳化剂。此外，在按照本发明第一，第二或第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，优选具有苯基的可聚合单体是苯乙烯，具有苯基和磺酸基的可聚合单体是苯乙烯磺酸盐。
本发明的第四方面是分析试剂，其中在按照本发明第一，第二或第三方面的分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒上承载与分析物特异性结合的物质。
附图简述
图1显示在制备实施例1至3和比较例1至4中制备的分析试剂后立即进行的样品测定结果。
图2显示在实施例1至3和比较例1至4中制备的分析试剂的稳定性检验后进行的样品测定结果。
图3显示在制备实施例4和比较例5中制备的分析试剂后立即进行的样品测定结果。
图4显示在实施例4和比较例5中制备的分析试剂的稳定性检验后进行的样品测定结果。
图5显示使用在实施例5至7中制备的试剂的样品测定结果。
图6显示使用在比较例6至8中制备的试剂的样品测定结果。
图7显示使用在实施例8至11中制备的试剂的样品测定结果。
图8显示使用在比较例9至12中制备的试剂的样品测定结果。
图9显示使用在实施例12(i)，比较例13和实施例13中制备的试剂的样品测定结果。
图10显示使用在实施例12(j)，比较例13和实施例14中制备的试剂的样品测定结果。
图11显示使用在实施例15至18中制备的试剂的样品测定结果。
图12显示使用在实施例14至18中制备的试剂的样品测定结果。
发明详述下面详述本发明。
本发明第一个方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳包含载体颗粒，其包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物。
不具体限制上述具有苯基的可聚合单体，其可包括例如苯乙烯，二乙烯基苯，乙基苯乙烯，α-甲基苯乙烯，对甲基苯乙烯，对氯苯乙烯，氯甲基苯乙烯等。它们可以单独使用或它们中的两种或多种结合使用。在以上所列中，优选使用苯乙烯。
不具体限制上述含有苯基和磺酸基的可聚合单体，只要它允许聚合后的载体颗粒表面含有磺酸基，并可包括例如苯乙烯磺酸盐，二乙烯基苯磺酸盐，乙基苯乙烯磺酸盐，α-甲基苯乙烯磺酸盐等。不具体限制在此提及的盐，其可包括例如钠盐，钾盐，锂盐，铵盐等。它们可以单独使用或它们中的两种或多种结合使用。在上面列出的那些中，优选苯乙烯磺酸盐，更优选苯乙烯磺酸钠。
通过将上述含有苯基的可聚合单体与上述含有苯基和磺酸基的可聚合单体共聚获得上述载体颗粒。上述共聚方法可使用任何已知方法，如一种方法，其中将含有水作为溶剂的反应容器充满上述含有苯基的可聚合单体，上述含有苯基和磺酸基的可聚合单体和聚合引发剂如果需要以及乳化剂，并在氮气氛下搅拌反应物。在该情形中聚合温度优选为50-100℃，更优选60-85℃。聚合时限通常是5-50小时，尽管它可能依赖于可聚合单体的组成和浓度条件以及聚合引发剂而变化。
不具体限制上述聚合引发剂，其可包括例如过硫酸盐等。该过硫酸盐可包括例如过硫酸钾，过硫酸钠，过硫酸铵等。不具体限制聚合引发剂的量，它通常是基于可聚合单体的0.01-1％重量。
通常优选不使用上述的乳化剂因为当在本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中含有乳化剂时测定的准确度受不利影响，这在例如在其中需要调整上述载体颗粒表面上磺酸基的量的情形中是允许的。然而，考虑到在聚合后的后处理步骤中去除，可以优选使用基于含有苯基的可聚合单体的1％重量或更少的量的乳化剂，更优选0.5％重量或更少，更加优选0.01-0.02％重量。
为了将颗粒表面磺酸基的量调整为0.005-0.7μmol/m2，基于上述含有苯基的可聚合单体，上述含有苯基和磺酸基的可聚合单体的量优选为2％重量或更少，更优选0.0001-1.5％重量，更加优选0.001-1.2％重量。通过以该比率将两种组分共聚，可以将上述载体颗粒表面磺酸基的量调整在0.005-0.7μmol/m2。
取决于按照本发明用于分析试剂的载体颗粒胶乳的使用目的，在共聚时可加入另外的可聚合不饱和单体。不具体限制该可聚合不饱和单体，只要它可以用于普通的自由基聚合，其可以包括例如(甲基)丙烯酸，(甲基)丙烯酸酯(盐)，苯乙烯衍生物，(甲基)丙烯腈，(甲基)丙烯酰胺，乙烯基卤化物，乙烯基酯，(甲基)丙烯醛，马来酸衍生物，富马酸衍生物等。在本发明中，(甲基)丙烯酸指丙烯酸或甲基丙烯酸。
上述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005-0.7μmol/m2。本发明人发现在上面指定范围内的载体颗粒表面磺酸基的量导致分析灵敏度的显著改善，允许从低浓度到高浓度广泛范围内测定作为分析物的痕量浓度蛋白，由此建立本发明。小于0.005μmol/m2的载体颗粒表面磺酸基量导致易发生非特异性聚集，而大于0.7μmol/m2的载体颗粒表面磺酸基量导致降低的聚集反应性，其导致低灵敏度。优选该量为0.02-0.5μmol/m2。通过电导率滴定法(Journal of Colloid and Interface Sciences，49(3)，425，1974)可以测定上述载体颗粒表面磺酸基的量。
上述载体颗粒的平均粒度是0.01-1.5μm。小于0.01μm的大小导致在聚集时光密度的太小变化，其导致难以获得测定所需的灵敏度和此外在制备试剂时离心所需时间太多，其导致试剂成本增加。大于1.5μm的大小使得对高浓度分析物，载体颗粒聚集诱导的光密度变化超出可测量范围，导致难以获得相应于分析物的量的光密度的变化。尽管取决于使用用于分析试剂的载体颗粒胶乳的测定方法和装置，载体颗粒的大小可以变化，它优选为0.03-0.8μm，更优选0.05-0.5μm。
上述载体颗粒粒度的变异系数(CV值)优选为10％或更小。大于10％的值可导致在制备试剂时差的lots重复性，其导致分析试剂重复性的降低。更优选它是5％或更小，特别是3％或更小。按照下列等式可以计算上述粒度的变异系数。
粒度变异系数(CV值)＝粒度的标准偏差/平均粒度通过将上述载体颗粒悬浮在水或水性溶剂中可以获得按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳。尽管不具体限制按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中载体颗粒的浓度，它通常优选为1-20％重量。小于1％重量的浓度导致在制备试剂时需要浓缩步骤，而大于20％重量的浓度可导致聚集。
按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳优选基本上不含乳化剂，因为它可导致不利情况如对测定准确度的不良影响。在此使用的术语“基本上”意指当在生产载体颗粒中使用乳化剂时，在去除乳化剂的步骤后存在仅仅痕量的乳化剂是可接受的。
按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒表面磺酸基的量在上面指定的范围内，其导致分析灵敏度的显著改善，允许在从低浓度到高浓度的广泛范围内测定作为分析物的痕量浓度蛋白。此外由于它在延长期稳定性方面极好，它特别最适合于光学测量装置。此外，不需要加糖类等来增大流体的比重，其在常规上为了避免任何沉降而被实施。
本发明的第二方面是用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒包含两种或多种具有不同表面磺酸基的量的颗粒并基本上不含乳化剂。
上述含有苯基的可聚合单体与含有苯基和磺酸基的可聚合单体与本发明第一方面的那些类似。
在按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中，使用包含两种或多种具有不同表面磺酸基的量的颗粒的载体颗粒。通过使用包含两种或多种具有不同表面磺酸基的量的颗粒的载体颗粒，得到的分析试剂的载体颗粒胶乳能够在从低浓度到高浓度的广泛范围内高敏感度和高准确度测定抗原抗体反应，因此适合于获得同样在延长期稳定性方面极好的试剂，特别是适合于光学测量装置如分光光度计，浊度计，光散射光度计等的试剂。
按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒表面磺酸基的量优选为0.005-0.7μmol/m2。小于0.005μmol/m2的量导致易发生非特异性聚集，而大于0.7μmol/m2的量导致降低的聚集，并且导致低的灵敏度。优选该量为0.02-0.5μmol/m2。
优选按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒包含表面磺酸基的量为0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的载体颗粒(A)和表面磺酸基的量为0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的表面载体颗粒(B)。通过使用这种载体颗粒(A)和载体颗粒(B)的混合物，得到的分析试剂的载体颗粒胶乳能够在从低浓度到高浓度的广泛范围内高灵敏度和高敏感度测定抗原抗体反应，提供延长期稳定性的进一步改善。
上述载体颗粒(A)的表面磺酸基的量小于0.005μmol/m2可导致作为最终产品的用于分析试剂的载体颗粒胶乳或分析试剂具有降低的延长期稳定性，并使得分析试剂容易进行非特异性聚集，而0.12μmol/m2或更高的量可导致在低浓度时难以测定。上述载体颗粒(B)的表面磺酸基的量小于0.12μmol/m2可导致在高浓度时难以测定，而大于0.7μmol/m2的量可导致作为最终产品的试剂免疫血清学的聚集减少，其导致测定不充分的灵敏度或准确度。
上述载体颗粒(A)和载体颗粒(B)的重量比优选为1/10-10/1重量。背离该范围，不能获得用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其适合于获得被赋予上述优异性能组合的分析试剂。
优选按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒的粒度为0.01-1.5μm。小于0.01μm的大小可导致在聚集时光密度变化太小和导致难以获得测定所需的灵敏度和，此外在制备试剂时离心所需时间太多而导致试剂成本增加。大于1.5μm的大小使得在高浓度分析物存在条件下，聚集诱导的光密度变化超出可测量的范围，导致难以获得对应于高浓度分析物的量的光密度变化。大小优选为0.03-0.8μm，特别是0.05-0.5μm。在按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒粒度的变异系数(CV值)优选为10％或更小。大于10％的值可导致在制备试剂时lots差的重复性，导致试剂重复性的降低。更优选它是5％或更小，特别是3％或更小。载体颗粒(A)的平均粒度可以是或不是类似于载体颗粒(B)的平均粒度。
生产按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒的方法和生产按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的方法类似于在按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的情形中的方法。
通过使用两种或多种表面磺酸基的量不同的颗粒，按照本发明第二方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳能够在从低浓度到高浓度的广泛范围内高灵敏度和高准确度测定抗原抗体反应，因此适合于获得同样延长期稳定性方面优异的试剂，特别是适合于光学测量装置如分光光度计，浊度计，光散射光度计等的试剂。
本发明的第三个方面是用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒的平均粒度为0.04-0.1μm，粒度的CV值为8-20％，并且其中基本上不含乳化剂。
上述含有苯基的可聚合单体与含有苯基和磺酸基的可聚合单体与本发明第一方面的那些类似。
在按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒的平均粒度为0.04-0.1μm，粒度的CV值为8-20％。通过使用这种具有控制在某一范围内的平均粒度和粒度CV值的载体颗粒，得到的产物能够在广泛浓度范围内测定抗原-抗体反应，同样在延长期稳定性方面优异，此外适合于获得能够特别应用于光学测量装置的免疫血清学检验的试剂。平均粒度小于0.4μm导致制备试剂所需周期延长，而大于0.1μm的尺寸导致增强的本底，其导致在低浓度下测定准确度降低。优选该尺寸为0.05-0.095μm。在另一方面，粒度的CV值小于8％使从低浓度到高浓度的广泛范围内不能测定，而值大于20％的值导致在离心后和在制备试剂时难以回收颗粒。优选该值为10-16％。
在按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒的表面磺酸基的量优选为0.005-0.7μmol/m2。小于0.005μmol/m2的量导致易发生非特异性聚集，而大于0.7μmol/m2的量导致降低的聚集，其导致低的灵敏度。优选该量为0.02-0.5μmol/m2。
生产在按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳中使用的载体颗粒的方法和生产按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的方法类似于在按照本发明第一方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳的情形中的方法。
通过使用具有控制在一定范围内的平均粒度和粒度CV值的载体颗粒，按照本发明第三方面用于分析试剂的载体颗粒胶乳成为一种产品，其能够在广泛浓度范围内测定抗原-抗体反应，此外在延长期稳定性方面是优异的，适合于获得能特别应用于光学检测装置的免疫血清学检验的试剂。
本发明的第四方面是分析试剂，其中在按照本发明第一，第二和第三方面的分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒上承载与分析物特异性结合的物质。
不具体限制上述与分析物特异性结合的物质，只要它是免疫血清学检验试剂(在免疫聚集和聚集抑制反应中使用)或通常在生物化学测定中使用的生物活性物质，并优选是在抗原-抗体反应中可利用的一种。
上述在抗原-抗体反应中可利用的一种可包括例如蛋白质的抗原或抗体，核酸，核蛋白，雌激素脂类等。抗原可包括例如各种抗原，受体，酶等中的任何一种和β2微球蛋白，C-反应蛋白(CRP)，人血纤蛋白原，铁蛋白，类风湿因子(RA)，α-胎蛋白(AFP)，支原体抗原，HBs抗原等。抗体可包括例如针对各种毒素和病原菌的各种抗体中的任何一种，抗-链球菌溶血素O抗体，抗雌激素抗体，β2微球蛋白抗体，梅毒密螺旋体抗体，针对梅毒密螺旋体脂质抗原的抗体，HBs抗体，HBc抗体，Hbe抗体等。除了免疫球蛋白分子它本身之外，抗体还可以是片段如F(ab′)2。
不具体限制使与分析物特异性结合的物质被承载在上述载体颗粒上的方法，在已知方法中可使用物理和/或化学键介导的承载方式(supportingmode)。
取决于使用的与分析物特异性结合的物质的类型，与分析物特异性结合并被承载在上述载体颗粒上的物质的量可以变化，并且不具体限制。
按照本发明第四方面的分析试剂可包含用于改善分析灵敏度和促进抗原-抗体反应的各种敏化剂。该敏化剂可包括例如烷基化多糖如在日本Kokai出版物Hei-2-173567中描述的甲基纤维素和乙基纤维素以及在日本Kokai出版物Hei-5-180838中描述的支链淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。
为了抑制由样品中其它物质导致的非特异性聚集或为了提高试剂的稳定性，按照本发明第四方面的分析试剂可包含蛋白质或其降解产物如清蛋白(牛血清清蛋白，卵清蛋白)，酪蛋白，明胶等，氨基酸或表面活性剂。
按照本发明第四方面的分析试剂可以在使用适当稀释剂稀释后使用。该稀释剂可以使用任何pH5.0-9.0的缓冲液，如磷酸盐缓冲液，甘氨酸缓冲液，tris缓冲液，硼酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液等。
使用按照本发明第四方面的分析试剂，通过载体颗粒聚集度的光学测量可以测定样品中分析物的反应量，所述聚集是由样品中的分析物和与分析物特异性结合并且被承载在载体颗粒上的物质之间的反应导致。该光学测量可使用能够检测散射光密度，透射强度，吸光度等的任何光学装置，特别是普通的自动生物化学分析仪。光学测量聚集度的方法可以是任何已知方法，如比浊法，其中将聚集的形成作为浊度的增加来监测，其中将聚集的形成作为粒子大小分布或平均粒度的变化来监测的方法，使用积分球(integrating sphere)的比浊法，其中使用积分球将比值(ratio)与透射强度比较来测定由于形成聚集导致的向前散射光的变化。同样例证的测定方法是速率测定，其中聚集度的测定是基于在不同时间点获得的至少两个测量值之间测量值的增量(增加率)；和端点测定，其中聚集度的测定是基于在某一时间点的单个测量值(通常假定时间点为反应的终点)。在上面列出的那些中，优选比浊法因为可以便利地和迅速地进行测定。
实施本发明的最好模式在下列实施例中进一步详述本发明，其不是意图限制本发明。
(实施例1)[载体颗粒的制备]将装有搅拌器，回流冷凝器，温度计，氮气入口管和套管的玻璃反应容器(2L)充满1500g蒸馏水，280g苯乙烯，0.9g苯乙烯磺酸钠和溶解在10g蒸馏水中的0.5g过硫酸钾的水溶液，并用氮气清洗，然后，搅拌同时在70℃进行聚合24小时。
完成聚合后，将溶液通过纸滤器过滤以获得载体颗粒。通过下述方法测定得到的载体颗粒的粒度和表面磺酸基的量。在表1中显示结果。
(测量载体粒度的方法)使用透射电子显微镜拍载体颗粒的相片，然后将其进行图象分析以确定粒度。
(测定载体颗粒表面磺酸基的量的方法)使用玻璃纸管渗析膜将载体颗粒对净化水渗析48小时，去除任何残余的单体。称量10g这些干颗粒放入4-颈玻璃容器中，用蒸馏水稀释至150ml，使用搅拌器末端搅拌。将得到的溶液称为溶液A。
然后，将N/100-氢氧化钠(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD制造)放置于附加于电势电导率滴定信息处理机(型号AT-310，由KYOTO ELECTRONICS MANUFACTURING CO.，LTD制造)的电子滴定管型号ATB-310之中，将电导率电极(conductivity electrode)浸于溶液A中，并放置氮气入口管，排气管和pH电极。然后滴入N/100-氢氧化钠(滴速0.05ml/150-500秒基于待测的磺酸的量调整)，使用电势电导率滴定信息处理机(型号AT-310)基于电导率的变化测定当量点，由此计算目的磺酸的量。
将通过使用得到的载体颗粒调整到5％(w/v)的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中。向其中立即加入550μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生产，蛋白浓度12mg/mL)，并在37℃温和搅拌1小时允许其被吸收。然后，立即加入450μl含有1.0％重量牛血清清蛋白(下文有时称为BSA)的甘氨酸缓冲液(pH8.5)，37℃搅拌1小时进行封闭处理。
将封闭处理后的等分混悬液放置于8ml离心管中，4℃15000rpm离心30分钟，去除上清液，将残渣再分散于含有1.0％重量BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)，并进行两次过量抗体处理。
将已经进行过量抗体处理的颗粒与2.5ml含有1.0％重量BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，在超声破碎后，再与含有1.0％重量BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，调整终体积为30ml，由此制备分析试剂。
1)分析灵敏度的评估使用得到的分析试剂，测定在测量样品时吸光度的变化。在测定中，每次样品测量使用132μl分析试剂，和132μl作为样品稀释剂的含有1.0％重量BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以及2μl具有0.08-20mg/dl CRP浓度的样品，由此测定每个样品吸光度的变化。作为测量装置，在检测波长为800nm和光观测点为2点-端21-34p(2point-end 21-34p)的条件下使用自动生物化学分析仪(由HITACHI LTD制造，型号7170自动分析仪)。图1中显示结果。
从图1明显的，这里获得的分析试剂能够高敏感测定从低浓度到高浓度范围内的样品。
2)试剂稳定性的评估将得到的分析试剂4℃保存6个月，然后使用CRP浓度为0.08-20mg/dl的样品以与上述方法同样的方式检验分析灵敏度。
在图2中显示结果。
从图2明显的，与在制备后即刻的分析试剂类似，甚至延长期保存后的分析试剂也能够高度敏感测定从低浓度到高浓度范围内的样品，证明可以延长期稳定保持性能。
(实施例2至3，比较例1至4)除了充满如在表1中显示的蒸馏水，苯乙烯和苯乙烯磺酸钠以外，以与实施例1中相同的方式生产载体颗粒。
以与实施例1中相同的方式测量得到的载体颗粒的粒度和表面磺酸基的量，结果在表1中显示。
然后，以与实施例1中类似的每表面积敏化量制备含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)，制备用于每个实施例和比较例的分析试剂。
以与实施例1中相同的方式检验得到的试剂的分析灵敏度。结果在图1中显示。
从图1明显的，在实施例2和3中制备的分析试剂显示与实施例1类似的满意结果。相反，在比较例1至4中制备的分析试剂显示低灵敏度。
然后将这里制备的试剂4℃保存6个月，以与实施例1相同的方式检验试剂的稳定性。结果在图2中显示。
从图2明显的，类似于以与实施例1相同的方式制备前所即刻显示的，即使在延长期保存后，在实施例2和3中制备的试剂的任何一种能够高灵敏度测定从低浓度到高浓度范围内的样品，因此显示它可延长期稳定保持它的性能。相反，任何在比较例1至4中制备的试剂在延长期保存后，显示与在制备后立即观测的灵敏度相比更低的灵敏度，其反映试剂性能变差。
表1
(实施例4，比较例5)制备含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8..5)以使实施例3和比较例3中生产的载体颗粒每表面积的抗体敏化量分别成为基于实施例3和比较例3的那些的80％，并用来制备分析试剂，其分别被称为实施例4和比较例5。
以与实施例1相同的方式检验得到的分析试剂的灵敏度，结果在图3中显示。
从图3明显的，实施例4中制备的分析试剂显示与实施例1类似的满意结果。相反，比较例5中制备的分析试剂显示低敏感度。
然后将这里制备的试剂4℃保存6个月，以与实施例1相同的方式检验试剂的稳定性。结果在图4中显示。
从图4明显的，类似于制备前所即刻显示，在实施例4中制备的试剂能够高灵敏度测定从低浓度到高浓度范围内的样品，因此显示它可延长期稳定保持它的性能。相反，在比较例5中制备的试剂在延长期保存后，显示与在制备后立即观测的灵敏度相比更低的灵敏度，其反映试剂性能变差。
(实施例5-7，比较例6-8)[载体颗粒的制备]将装有搅拌器，冷却旋管，温度计，套管等的玻璃反应容器(2L)充满原材料，其组成在表2中显示，用氮气清洗，在搅拌控制反应温度为70-71℃的同时进行共聚合48小时。作为聚合的催化剂，使用溶解在10g蒸馏水中的0.5g过硫酸钾的水溶液。在实施例5和6以及比较例6中使用非离子乳化剂(EMULGEN 804S，由Kao Corporation制造)，在实施例7和比较例7中使用阴离子乳化剂(NEOPELEX F-25，由KaoCorporation制造)。
取出得到的载体颗粒并类似于实施例1检验它们的粒度和表面磺酸基的量。
结果在表2中显示。
表2
将通过使用实施例5中获得的载体颗粒调整到5％的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入550μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生产，蛋白浓度12mg/mL，也称为抗体溶液)，并在37℃搅拌1小时允许其被吸收，然后，与450μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，37℃搅拌60分钟进行封闭处理。
将封闭处理后的等分混悬液放置于8ml离心管中，15000rpm离心50分钟，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)中，并进行两次过量抗体处理，与2.5ml含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，在超声破碎后，然后再与含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合以使终体积为30ml，由此制备分析试剂。
除了制备含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使实施例6和7以及比较例6至8中生产的载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得类似以外，以与实施例5相同的方式制备分析试剂。
在实施例5和比较例6中15000rpm进行离心50分钟，在实施例6和比较例7中15000rpm离心45分钟，在实施例7和比较例8中15000rpm离心38分钟。
使用每种得到的分析试剂，在下面指定的条件下测定在测量CRP浓度为0.08-20mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图5和图6中显示。
仪器由HITACHI LTD制造，型号7170自动分析仪体积样品2μL稀释剂(R1)132μL(稀释剂组成1％重量含BSA的甘氨酸缓冲液)分析试剂132μL检测波长800nm光观测点2点-端21-24p[载体颗粒的制备]将装有搅拌器，冷却旋管，温度计，套管等的玻璃反应容器(2L)充满在表3中显示的一定数量的蒸馏水，苯乙烯和苯乙烯磺酸钠，另外装有溶解在10g蒸馏水中的0.5g过硫酸钠(引发剂)水溶液，用氮气清洗，在搅拌控制反应温度为71℃-73℃的同时进行共聚合48小时，由此获得6种类型的载体颗粒，即(a)至(f)。以与实施例1相同的方式测量每种得到的载体颗粒的粒度和表面磺酸基的量。结果在表3中显示。
表3
(实施例8)[分析试剂的制备]使用将载体颗粒(a)和载体颗粒(b)的固体重量比调整至(a)/(b)＝1/10的载体颗粒，与蒸馏水结合将％固体调整为10％重量，将250ml等分试样放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(蛋白浓度18mg/mL，由DAKO生产，也称为抗体溶液)，37℃搅拌1小时允许其被吸收，然后与2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，37℃搅拌60分钟进行封闭处理。将封闭处理后的等分试样放置于8ml离心管中，15000rpm离心50分钟，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)中，并进行两次过量抗体处理，然后与2.5ml含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，在超声破碎后，再与含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，调整终体积为5ml，由此制备分析试剂。
使用每种得到的分析试剂，在下面指定的条件下测定在测量CRP浓度为0.08-20mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图7中显示。
仪器由HITACHI LTD制造，型号7150自动分析仪体积样品3μL稀释剂(R1)270μL(稀释剂组成1％重量含BSA的甘氨酸缓冲液)分析试剂90μL检测波长800nm光观测点2点-30-50p(实施例9)除了使用将载体颗粒(a)和载体颗粒(b)的固体重量比调整为(a)/(b)＝10/1的载体颗粒以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
(实施例10)除了使用将载体颗粒(c)和载体颗粒(d)的固体重量比调整为(c)/(d)＝1/10的载体颗粒以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
(实施例11)
除了使用将载体颗粒(c)和载体颗粒(d)的固体重量比调整为(c)/(d)＝10/1的载体颗粒以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
以与实施例8相同的方式检验实施例9至11中获得的分析试剂的每一种它的性能(灵敏度)。结果在图7中显示。
(比较例9)除了仅使用载体颗粒(a)作为载体颗粒并制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得与实施例8中类似以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
(比较例10)除了仅使用载体颗粒(d)作为载体颗粒和制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得与实施例8中类似，并且还在15000rpm进行离心38分钟以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
(比较例11)除了仅使用载体颗粒(e)作为载体颗粒并制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得与实施例8中类似以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
(比较例12)除了仅使用载体颗粒(f)作为载体颗粒和制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得与实施例8中类似，并且还在15000rpm进行离心38分钟以外，以与实施例8相同的方式制备分析试剂。
以与实施例8相同的方式检验比较例9至12中获得的分析试剂的每一种它的性能(灵敏度)。结果在图8中显示。
如从图7明显的，在实施例8至11中制备的分析试剂中的任何一种导致在0.08-20mg/dl CRP的广泛浓度范围内吸光度的显著变化，其显示优异的灵敏度。
相反，如从图8明显的，分别使用载体颗粒(a)，(e)和(f)作为唯一载体颗粒的比较例9，11和12的试剂的任何一种在0.08-20mg/dl CRP的广泛浓度范围内导致小的吸光度变化，其显示差灵敏度。使用载体颗粒(d)作为唯一载体颗粒的比较例10的试剂在5-20mg/dl CRP的高浓度处导致小的吸光度变化，其显示在高浓度处的差灵敏度。
将装有搅拌器，冷却旋管，温度计，套管等的玻璃反应容器(2L)充满在表4中显示组成的原材料，用氮气清洗，在搅拌控制反应温度为71℃-73℃的同时进行共聚合48小时，由此获得5种类型的载体颗粒，即(g)至(k)。以与实施例1相同的方式测量每种得到的载体颗粒的粒度和表面磺酸基的量。结果在表4中显示。作为用于聚合的催化剂，使用溶解在10g蒸馏水中0.5g过硫酸钾的水溶液。
表4
将250μl被调整为10％(w/v)载体颗粒(g)的水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生产，蛋白浓度18mg/mL，也称为抗体溶液)，37℃搅拌1小时允许其被吸收，然后与2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，37℃搅拌60分钟进行封闭处理。然后，将封闭处理后的等分试样放置于8ml离心管中，18000rpm离心60分钟，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)中，并进行两次过量抗体处理，与2.5ml含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，在超声破碎后，然后再与含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合以使终体积为5ml，由此制备分析试剂。
制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使载体颗粒(h)，(i)，(j)和(k)的每表面积抗体敏化量变得相似，以与载体颗粒(g)的相似的方式制备分析试剂。对于载体颗粒(h)进行18000rpm离心45分钟，对于载体颗粒(i)和(j)15000rpm30分钟和对于载体颗粒(k)18000rpm60分钟。
(实施例12)使用由得到的载体颗粒(i)和(j)组成的分析试剂，在以下指定的条件下测定在测量CRP浓度为0.5-30mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图9和图10中显示。
仪器由HITACHI LTD制造，型号7150自动分析仪体积样品3μL稀释剂(R1)270μL(稀释剂组成1％重量含BSA的甘氨酸缓冲液)分析试剂90μL检测波长800nm光观测点2点-30-50p(比较例13)使用含有得到的载体颗粒(k)的分析试剂，在与实施例12中类似的条件下测定在测量CRP浓度为0.5-30mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图9和图10中显示。
(实施例13)使用通过以1∶10的比率将包含得到的载体颗粒(g)的分析试剂和包含得到的载体颗粒(i)的分析试剂混合而获得的混合物作为分析试剂，在与实施例12中类似的条件下测定在测量CRP浓度为0.5-30mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图9中显示。
(实施例14)使用通过以1∶10的比率将包含得到的载体颗粒(h)的分析试剂和包含得到的载体颗粒(j)的分析试剂混合而获得的混合物作为分析试剂，在与实施例12中类似的条件下测定在测量CRP浓度为0.5-30mg/dl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图10中显示。
(实施例15至18，比较例14至18)[载体颗粒的制备]将装有搅拌器，冷却旋管，温度计，套管等的玻璃反应容器(2L)装满原材料，其组成在表5中显示，另外装有溶解在10g蒸馏水中的0.5g过硫酸钾(引发剂)的水溶液，用氮气清洗，在搅拌控制反应温度为71℃-73℃的同时进行共聚合48小时。
将得到的载体颗粒通过纸滤器过滤，检验粒度，计算平均粒度和CV值。基于通过透射电子显微镜观察的图像使用图像分析仪确定此处的粒度。以与实施例1相同的方式确定表面磺酸基的量。
表5
将使用在实施例15中获得的载体颗粒调整为10％(w/v)的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生产，蛋白浓度18mg/mL，也称为抗体溶液)，37℃搅拌1小时允许其被吸收，然后与2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，37℃搅拌60分钟进行封闭处理。然后，将封闭处理后的等分试样放置于8ml离心管中，18000rpm离心60分钟，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)中，并进行两次过量抗体处理，与2.5ml含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合，在超声破碎后，然后再与含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)结合以使终体积为5ml，由此制备分析试剂。
制备含BSA的甘氨酸缓冲液(pH8.5)以使在实施例16至18和比较例14至18中生产的载体颗粒的每表面积抗体敏化量变得相似，以与实施例15相同的方式制备分析试剂。
在实施例15和比较例18中进行18000rpm离心60分钟，在实施例16和17以及比较例16和17中18000rpm70分钟。
使用每种得到的分析试剂，在下面指定的条件下测定在测量CRP浓度为0.5-30mg/cl的样品时观测到的吸光度变化。
结果在图11和图12中显示。
仪器由HITACHI LTD制造，型号7150自动分析仪体积样品3μL稀释剂(R1)270μL(稀释剂组成1％重量含BSA的甘氨酸缓冲液)分析试剂90μL检测波长800nm光观测点2点-30-50p
工业适用性按照本发明，提供了用于分析试剂的载体颗粒胶乳和使用它的分析试剂，所述分析试剂能够在免疫血清学检验中在广泛浓度范围内测定生物样品并且可以延长期稳定保存。
权利要求
1.一种用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体和具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒具有0.005-0.7μmol/m2的表面磺酸基量和0.01-1.5μm的平均粒度。
2.一种用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体和含有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒包含两种或多种具有不同表面磺酸基的量的颗粒。
3.按照权利要求2的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其中所述载体颗粒具有0.005-0.7μmol/m2的表面磺酸基的量。
4.按照权利要求2或3的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其中所述载体颗粒包含表面磺酸基的量为0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的载体颗粒(A)和表面磺酸基的量为0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的载体颗粒(B)。
5.按照权利要求4的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其中包含的所述载体颗粒(A)与所述载体颗粒(B)的重量比由(A)/(B)＝1/10-10/1表示。
6.一种用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体与具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒具有0.04-0.1μm的平均粒度和8-20％的粒度的CV值。
7.按照权利要求6的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其中所述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005-0.7μmol/m2。
8.按照权利要求1，2，3，4，5，6或7的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其基本上不含乳化剂。
9.按照权利要求1，2，3，4，5，6，7或8的用于分析试剂的载体颗粒胶乳，其中所述具有苯基的可聚合单体是苯乙烯并且所述具有苯基和磺酸基的可聚合单体是苯乙烯磺酸盐。
10.一种分析试剂，其中在按照权利要求1，2，3，4，5，6，7，8或9的用于分析试剂的载体颗粒胶乳的载体颗粒上承载与分析物特异性结合的物质。
全文摘要
本发明的目的是提供一种用于分析试剂的载体颗粒胶乳以及使用它的分析试剂，所述分析试剂能够在免疫血清学检验中在广泛浓度范围内测定生物样品并可以延长期稳定保存。本发明是一种用于分析试剂的包含载体颗粒的载体颗粒胶乳，所述载体颗粒包含具有苯基的可聚合单体和具有苯基和磺酸基的可聚合单体的共聚物，其中所述载体颗粒表面磺酸基的量为0.005－0.7μmol/m
文档编号G01N33/543GK1522370SQ0281335
公开日2004年8月18日 申请日期2002年7月2日 优先权日2001年7月2日
发明者尾花敏 申请人:积水化学工业株式会社